高壓氧對蛛網膜下腔出血大鼠模型基底動脈痙攣的作用及機制

趙龍，朱茜，唐曉平（通訊作者）

（1. 川北醫學院附屬醫院 神經外科，四川 南充 637000；2. 川北醫學院附屬醫院 神經外科研究所，四川 南充 637000；3. 川北醫學院附屬醫院 護理部，四川 南充 637000）

0 引言

高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）作為一種有效的神經修復與保護措施已經被廣泛應用于多種神經外科疾病中，臨床報道顯示，HBO 可以明顯改善患者預后，減輕腦損傷[1]。在蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者中，已有報道表明HBO 可以減輕腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS），改善患者神經功能[2]，但對其作用機制的研究仍較少。本研究擬通過動物實驗觀察HBO 對SAH后基底動脈痙攣的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組。清潔級成年雄性SD 大鼠90 只，隨機均分為對照組、假手術組、HBO 組。各組再根據干預終止時間分為1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 亞組。

1.2 主要干預措施。采用枕大池二次注血法建立SAH 模型，造模方法按照之前文獻描述進行[3]，分兩次枕大池抽取腦脊液0.3 mL 后注射等量自體動脈血。假手術組操作步驟同上，以無菌生理鹽水代替自體血。HBO 組大鼠在第二次注血后當天接受高壓氧治療，每天一次，每次80 分鐘，對照組常規飼養。

1.3 外周血NO 含量測定。使用NO 測試試劑盒（化學法，南京建成）測定血清NO 濃度。

1.4 基底動脈的組織學觀察及血管內徑測定。取基底動脈末端切片行HE 染色，400 倍顯微鏡下，觀察基底動脈管壁組織學特點，并在100 倍光鏡下用接目測微尺測量基底動脈的最大內徑與最小內徑，以公式：校正管徑=（最大內徑＊最小內徑）1/2 計算基底動脈校正管徑。

1.5 內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的測定。選擇術后5天亞組大鼠基底動脈切片以免疫組化法檢測eNOS 水平。基底動脈切片經脫蠟、水化、EDTA 抗原修復液（邁新生物，福州）修復抗原后，采用羊抗小鼠Streptavidin-HRP 試劑盒（康為世紀，北京）、抗大鼠eNOS 單克隆抗體（BD 生物，美國）、增強型HRP-DAB 底物顯色試劑盒（天根生物，北京）等進行免疫組化染色。應用IPP 6.0 圖像分析軟件測定陽性細胞的平均光密度值（AOD）來表示抗原表達量。

1.6 統計學分析。采用SPSS 22.0 進行統計學分析，計數資料以均數±標準差表示。兩組間比較采用成組分析t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，SNK-q 檢驗進行兩兩比較，以雙側P＜0.05 認為有統計學意義。

2 結果

2.1 基底動脈組織學觀察假手術組基底動脈周圍無血凝塊，血管壁結構正常：內膜平滑，內彈力膜完整，中層可見2-3 層平滑肌細胞均勻分布，外膜薄且平滑。對照組術后1 d 蛛網膜下腔可見大量紅細胞，血管周徑、血管壁厚度及內皮細胞形態改變尚不明顯；術后3 d、5 d 可見蛛網膜下腔紅細胞及炎細胞聚集，血管管腔明顯變窄，血管壁增厚，內皮細胞出現不同程度的變性、腫脹、染色質不均，胞漿內空泡形成；內彈力膜迂曲、皺褶甚至斷裂，厚薄不均，中膜增厚，平滑肌細胞排列紊亂。術后7 d 上述情況有所好轉，術后14 d 基本恢復正常。HBO 組術后3 d、5 d 可見類似于對照組變化，但程度較輕。

2.2 各組血管內徑比較，見表1。對照組血管內徑值進行性減小，至術后5d 達其最低值，而假手術組各時間點血管內徑一致，說明SAH 組大鼠基底動脈發生了CVS，其痙攣高峰為術后5 d，術后7 d 血管內徑仍明顯低于假手術組（P＜0.05）。HBO 組基底動脈內徑也逐漸變小，其痙最低值出現在術后3 d，變化程度較SAH 組輕（P＜0.05）；術后5 d 及術后7 d，血管內徑值明顯高于SAH 組（P＜0.05），術后7 d 血管內徑與假手術組間無差異（P＞0.05）。

2.3 術后5 d 基底動脈內皮細胞eNOS 染色程度比較。eNOS 陽性表現為均勻性棕黃色或棕褐色胞漿著色，主要表達于血管內皮層，腦膜及動脈外膜也可見陽性表達。假手術組術后5 d 組基底動脈內皮層可見均勻黃染；SAH 組術后5 d 可見基底動脈內皮層著色淺，染色不均；HBO 組內皮層染色不均，陽性染色較SAH 強。對照組、假手術組、HBO組AOD 值 分 別 為（0.156±0.069）、（0.414±0.102）、（0.299±0.067），組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，對照組、HBO 組均較假手術組低，差異有統計學意義（P＜0.05）；HBO 組AOD 值較對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 基底動脈校正內徑變化

表1 基底動脈校正內徑變化

注：?與假手術組比較，P<0.05；■與對照組比較，P<0.05。

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2.4 外周血NO 濃度比較。假手術組各亞組之間NO 濃度無明顯差異（P＞0.05）。對照組術后5 d 內NO 濃度進行性降低，術后5 d 達最低值，然后逐漸升高，術后7 d 仍低于假手術組（P＜0.05），術后14 d 與假手術組比較無統計學差異（P＞0.05）。HBO 組術后NO 濃度也降低，術后3 d 達到最低值，然后逐漸上升，術后7d 與假手術組比較無統計學差異（P＞0.05），術后3d、5d、7d 均較對照組高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 外周血NO 水平比較

表2 外周血NO 水平比較

注：?與假手術組比較，P<0.05；■與SAH 組比較，P<0.05。

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3 討論

SAH 后CVS 是大腦動脈血管在出血后理化因素共同作用下發生的病理性收縮，通常為可逆性的過程，而在臨床上遲發性CVS 對患者的預后有重大影響。CVS 在發病后3 天開始出現，7 天左右達到高峰，持續至14 天左右基本恢復。我們采用枕大池二次注血法建立SAH 后CVS 模型，通過對照組觀察，成功模擬了這一病理變化過程，也為進一步研究HBO 的作用及機制創造了條件[4]。CVS 的發生發展受到多重因素影響，氧合血紅蛋白的產生與分解為CVS 提供了物質基礎，過量的氧自由基產生并激活PKC 和Rho 激酶，激活平滑肌細胞膜上的鈣通道，導致平滑肌細胞收縮是其主要病理生理機制。另外，膽紅素氧化產物增加、不對稱二甲基精氨酸代謝異常及血管內皮細胞損傷及功能障礙共同導致的NO代謝障礙也是CVS 產生及持續的重要原因。

HBO 自上世紀90 年代開始用于治療動脈瘤性SAH 患者，報道稱HBO 結合適當擴容、高血壓可以減輕癥狀性CVS。繼而逐漸有文獻報道了HBO 有助于SAH 患者的臨床恢復[5]但是，對于其機制的研究大多集中在HBO 對腦缺血性損害及繼發性腦損害的作用上，而直接研究HBO 對CVS的作用及機制的報道較少。

我們的實驗結果表明，HBO 可以減輕SAH 后CVS 的程度，促進CVS 的恢復，而且，其對CVS 的作用與升高血、腦脊液NO 濃度有關。為了進一步明確NO 濃度升高的機制，我們采用免疫組織化學方法檢測了血管內皮細胞eNOS 表達情況，結果表明，CVS 發生后，血管內皮細胞表達eNOS 明顯減少，這與之前的研究結果一致[6]。而HBO 組CVS 減輕的同時，eNOS 染色強度也有所增加。這說明，HBO 可能通過提高痙攣血管內皮eNOS 的活性而促進NO 的合成。研究結果證實了HBO 對CVS 的作用，并初步解釋了其作用與NO 代謝的關系，研究結果支持HBO 在動脈瘤性SAH 術后患者的推廣應用，也有助于推動相關研究的進一步深入，為更安全高效的利用HBO 提供線索與依據。