茵陳飲片與茵陳標準湯劑的質量比較研究△

田芳，阮群珈，石星，吳孟華，張英，曹暉，馬志國*

1.暨南大學 嶺南傳統中藥研究中心，廣東 廣州 510632； 2.國家中藥現代化工程技術研究中心 嶺南資源分中心，廣東 廣州 510632； 3.暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632； 4.烏魯木齊質量計量檢測研究院，新疆 烏魯木齊 830000

茵陳為菊科植物濱蒿ArtemisiascoparzaWaldst.et Kit.或茵陳蒿ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，春季采收的習稱“綿茵陳”，秋季采割的稱“花茵陳”。味苦、辛，性微寒，具有清利濕熱、利膽退黃的功能，臨床用于黃疸尿少、濕溫暑濕、濕瘡瘙癢[1]。“綿茵陳”為臨床常用的飲片規格，其主要含有綠原酸、咖啡酸為代表的有機酸類成分[2-3]，《中華人民共和國藥典》2015年版一部茵陳項下規定“綿茵陳”中含綠原酸不得少于0.5%。茵陳在中醫臨床上多以復方入藥，關于茵陳飲片標準湯劑研究尚未見文獻報道。本實驗以茵陳飲片為對象，按照《中藥飲片標準湯劑研究策略》的相關要求[4]，進行茵陳飲片標準湯劑研究，以期為茵陳飲片標準湯劑的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀(G7115A型DAD檢測器、G7129A型自動進樣器和柱溫箱、G7111A型在線真空脫氣機)；FA 2204B 型萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；EX225DZH十萬分之一天平(美國奧豪斯儀器有限公司)；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸對照品(成都普瑞法科技開發有限公司，批號分別為：PRF7051143、PRF7041803、15020603、PRF7061112、15042210、15062011，純度均>98%)；對照品咖啡酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110885-200102，純度≥98%)；色譜純乙腈(上海麥克林生化科技有限公司)；實驗用水為純凈水[華潤怡寶飲料(中國)有限公司]；其他試劑均為分析純。

本研究共收集市售15批茵陳飲片，所有飲片樣品經暨南大學藥學院馬志國副教授鑒定為菊科植物茵陳ArtemisiacapillarisThunb.的干燥地上部分，均為“綿茵陳”。15批茵陳樣品信息見表1。

表1 茵陳樣品信息

2 方法與結果

2.1 茵陳飲片中綠原酸的含量測定

依照《中華人民共和國藥典》2015年版一部茵陳項下含量測定方法[1]，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)，柱溫30 ℃，體積流量1.0 mL·min-1；檢測波長327 nm為色譜條件測定綠原酸的含量。結果有12批樣品的綠原酸含量符合《中華人民共和國藥典》限量標準要求，見表2。另存在3批不合格樣品。

2.2 茵陳飲片標準湯劑的制備

參考文獻[4]，將12批茵陳樣品制備成標準湯劑。取茵陳飲片100 g，加12倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁熱過濾，藥渣再加10倍量水回流提取20 min，趁熱過濾，合并2次濾液，濃縮至500 mL，搖勻，得生藥質量濃度為0.2 g·mL-1的茵陳飲片標準湯劑。

2.3 茵陳飲片標準湯劑中綠原酸含量測定

供試品溶液的制備：取茵陳飲片標準湯劑，搖勻，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

色譜條件、對照品溶液的制備及測定方法，參考《中華人民共和國藥典》2015年版一部茵陳項下含量測定方法[1]，測定12批茵陳飲片標準湯劑中綠原酸的含量，結果見表2。

2.4 轉移率、出膏率計算

以綠原酸為指標成分，按公式(1)計算轉移率；取茵陳飲片標準湯劑適量，搖勻，精密吸取50 mL置已恒質量的蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定質量，按公式(2)得出膏率。見表2。

轉移率=茵陳飲片標準湯劑中指標成分質量/

飲片中指標成分質量×100%

(1)

出膏率=干膏質量/(取樣量×標準湯劑生藥質量濃度)×100%

(2)

表2 茵陳飲片及其標準湯劑的評價指標測定 %

2.5 茵陳飲片及其標準湯劑指紋圖譜的建立

2.5.1色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～20 min，7%～15%B；20～30 min，15%～20%B；30～35 min，20%B；35～45 min，20%～25%B)，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長330 nm，進樣量10 μL。

2.5.2供試品溶液制備 茵陳飲片和標準湯劑的供試品溶液分別按《中華人民共和國藥典》2015年版一部茵陳項下和2.3項下方法制備。

2.5.3精密度試驗 取同一批茵陳飲片標準湯劑(YC-06)的供試品溶液，按2.5.1項下條件連續進樣6次，以綠原酸(3號峰) 為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為<0.20%、<1.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩定性試驗 取同一茵陳飲片標準湯劑(YC-06)的供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、16 h 按2.5.1項下條件進樣測定，以綠原酸為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為<1.9%、<3.5%，表明茵陳飲片標準湯劑的供試品溶液在16 h內穩定性良好。

2.5.5重復性試驗 平行制備6份茵陳飲片標準湯劑(YC-06)的供試品溶液，按2.5.1項下條件進樣分析，以綠原酸為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別<1.7%、<3.7%，表明該方法的重復性較好。

2.5.6樣品檢測與分析 分別取12批茵陳飲片和飲片標準湯劑供試品溶液，按2.5.1項下色譜條件測定，記錄HPLC圖譜。將12批飲片和標準湯劑的供試品溶液的色譜圖分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012A版)軟件，采用中位數法，時間窗寬度0.1，分別生成飲片和標準湯劑的指紋圖譜(見圖1)，并生成各自的對照指紋圖譜(見圖2)，并以對照指紋圖譜為參照進行相似度評價。結果茵陳飲片指紋圖譜中有7個共有峰，茵陳標準湯劑指紋圖譜中有8個共有峰。12批茵陳飲片及其標準湯劑與共有模式對照指紋圖譜的相似度均高于0.96(見表3)。

2.5.7成分指認 將已配制好的7種對照品溶液(綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸和咖啡酸)、茵陳飲片及其標準湯劑的供試品溶液，分別按2.5.1項下色譜條件測定，通過保留時間結合紫外光譜圖對供試品溶液各色譜峰進行指認，見圖2。結果茵陳飲片和標準湯劑的指紋圖譜中共指認了7個共有峰，依次為新綠原酸(2號峰)、綠原酸(3號峰)、隱綠原酸(4號峰)、咖啡酸(5號峰)、1，3-二咖啡酰奎寧酸(6號峰)、3，4-二咖啡酰奎寧酸(7號峰)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(8號峰)。1號峰未指認，通過查閱文獻[5-6]，可能為1-咖啡酰奎寧酸，有待于進一步進行確認。

注：A.茵陳飲片；B.標準湯劑；2.新綠原酸；3.綠原酸；4.隱綠原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡酰奎寧酸；7.3，4-二咖啡酰奎寧酸；8.4，5-二咖啡酰奎寧酸。圖1 12批茵陳飲片及其標準湯劑指紋圖譜

注：A.茵陳飲片；B.標準湯劑；2.新綠原酸；3.綠原酸；4.隱綠原酸；5.咖啡酸；6.1，3-二咖啡酰奎寧酸；7.3，4-二咖啡酰奎寧酸；8.4，5-二咖啡酰奎寧酸。圖2 茵陳飲片和標準湯劑對照指紋圖譜

表3 12批茵陳飲片及其標準湯劑相似度

2.5.8飲片與標準湯劑共有峰的比較 通過比較12批茵陳飲片和標準湯劑的各共有峰的平均相對峰面積(見表4)，發現飲片與標準湯劑共有峰中，除了8號峰，其他共有峰的相對峰面積差別較大。以3號峰(綠原酸)為參比峰，進一步對比兩者的對照指紋圖譜發現，除了8號峰，其他共有峰在標準湯劑中的相對峰高均高于飲片。

表4 12批茵陳飲片及其標準湯劑共有峰的平均相對峰面積

3 討論

3.1 樣品來源

本實驗共收集了來自12個廠家的茵陳飲片15批，分別產于陜西、山東、甘肅、河南、山西5個產地。其中12批樣品中的綠原酸符合《中華人民共和國藥典》限量標準要求，另存在3批不合格樣品，編號為YC-13、YC-14、YC-15。因此，選取合格的12批茵陳飲片為研究對象進行茵陳飲片標準湯劑的研究。

3.2 供試品前處理及色譜條件優選

在茵陳飲片標準湯劑指紋圖譜供試品溶液制備方法的優選過程中，以色譜峰峰形、分離度、分析時間等為指標，對標準湯劑稀釋用溶劑的種類和稀釋倍數進行了考察。結果，稀釋用溶劑10%甲醇優于無水乙醇；稀釋10倍為最佳稀釋倍數。故選取10%甲醇稀釋倍數10倍為茵陳飲片標準湯劑的供試品溶液制備方法。

本實驗對色譜條件進行了優選，采用乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液分別對流動相系統進行液相色譜分離效果的考察，結果使用乙腈-0.1%甲酸可以使色譜峰達到更好的分離效果。同時考察了不同波長(240、283、330 nm)下各活性成分的吸收情況，發現波長330 nm能兼顧大部分色譜峰的檢測，最終確定2.5.1項下的色譜條件。

3.3 飲片與標準湯劑指紋圖譜的比較

茵陳標準湯劑指紋圖譜中含有8個共有峰，其中7個共有峰亦為茵陳飲片指紋圖譜的共有峰。通過指認，這些共有峰均為有機酸類成分，且它們之間多為同分異構體。文獻報道[7]，目前從植物中發現的綠原酸類異構體主要是單咖啡酰奎寧酸類(綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸)和二咖啡酰奎寧酸類(1，3-二咖啡酰奎寧酸、3，4-二咖啡酰奎寧酸和4，5-二咖啡酰奎寧酸)；綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸形成的酯，其分子結構中有酯鍵、不飽和鍵及多元酚3個不穩定部分，前者易發生水解，后兩者易被氧化，綠原酸可通過水解和分子內酯基遷移而發生異構化；若從酯鍵處斷裂，可產生奎寧酸和咖啡酰基的水解產物，咖啡酰基斷裂后在奎寧酸上的取代位置發生重排，可產生綠原酸的同分異構體。針對茵陳飲片和湯劑兩者的指紋圖譜的共有峰的相對峰高差異較大這一現象，結合相關文獻[8-9]，推測在煎煮過程中茵陳中的主要成分綠原酸(3號峰)和3，4-二咖啡酰奎寧酸(7號峰)可能發生了水解和異構化反應而含量降低，使得相應的異構體：新綠原酸(2號峰)、隱綠原酸(4號峰)、1，3-二咖啡酰奎寧酸(6號峰)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(8號峰)含量增加，從而造成兩者的指紋圖譜出現了差異。同時，綠原酸的轉移率為31.0%～62.4%，差異較大，平均轉移率僅為44.5%，也可能與煎煮過程中綠原酸的水解和轉化有關。因此，今后可對茵陳中有機酸類成分煎煮過程中的分解轉化規律進行研究，指導其標準湯劑制備過程中工藝參數的優選。在茵陳標準湯劑質控指標方面也可增加新綠原酸、隱綠原酸等指標成分，可更好地控制質量。