三種益生菌發酵劑固態發酵對豆粕營養品質的影響

王 梅，謝全喜*，侯楠楠，雷春紅，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態制劑省級重點實室，山東 泰安 271000）

豆粕是大豆經浸提脫油后的副產物，蛋白質和氨基酸含量較高，且其組成合理、均衡，是一種優質植物性蛋白源[1]，也是動物主要的蛋白質飼料之一，廣泛應用于動物養殖中[2]。但豆粕中含有多種抗營養因子，嚴重影響了動物機體對豆粕中營養物質的吸收和利用，對動物機體的某些器官造成影響和損傷[3]。豆粕經發酵后可顯著降低或鈍化其抗營養因子，將大分子蛋白分解為小肽或氨基酸，提高豆粕的消化率，降低飼料成本[4-5]。

發酵豆粕的首要任務是發酵菌種的選擇，一般篩選具有特殊能力的菌種，如能將淀粉等大分子分解為小分子的微生物，降解大分子蛋白較強的微生物，以及能夠產生特殊風味的微生物等[6]。趙彩艷等[7]選用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵豆粕制備益生菌飼料，篩選出適宜發酵的最優條件；史玉寧等[8]研究發現，選用米曲霉（Aspergillus oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）復合菌種發酵豆粕，粗蛋白含量提高21.27%、酸溶蛋白含量提高695.97%；曾亞桐等[9]選用枯草芽孢桿菌與產朊假絲酵母（Candida utilis）單菌和混合菌種發酵，發現混合發酵豆粕能夠大幅度提高降解抗營養因子的速度，其混合發酵的最佳時間為60～72 h；毛銀等[10]研究發現，利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵豆粕顯著提高了有機酸含量，改善了豆粕品質。

發酵豆粕一般采用固態發酵技術，固態發酵技術更接近自然條件，操作簡單，成本較低。目前，國內許多企業都在生產發酵豆粕，吳明海等[11]研究了好氧與厭氧兩種方式對發酵豆粕品質的影響發現，厭氧發酵粗蛋白、活菌數和色澤優于好氧發酵，更適合幼畜使用。張代等[12]研究了不同廠家發酵豆粕品質的差異，發現不同廠家發酵豆粕產品理化指標差異較大，可能與不同廠家發酵菌種和生產工藝不同。目前，市面上的益生菌發酵劑良莠不齊，生產工藝不同，生產的發酵豆粕品質差異較大[13]。本研究選用不同的益生菌組合發酵劑對豆粕進行固態厭氧發酵，對發酵后的豆粕的感官品質、pH值、有益微生物含量、營養指標及衛生指標進行分析比較，篩選出最適發酵劑，以此提高豆粕的營養價值，為發酵豆粕的生產加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

國產去皮豆粕：市場。黃色，無霉變，無結塊，無異味，粉碎后過篩。

1.1.2 益生菌發酵劑

益生菌發酵劑A：由乳酸菌、酵母菌、中性蛋白酶和酸性蛋白酶等組成，活菌總數≥30.0×108CFU/g；益生菌發酵劑B：由乳酸菌、芽孢菌和中性蛋白酶等組成，活菌總數≥20.0×108CFU/g；益生菌發酵劑C：由乳酸菌、釀酒酵母和中性蛋白酶等組成，活菌總數≥15.0×108CFU/g。其中A款和B款發酵劑為市場上銷售的兩款益生菌發酵劑，C款益生菌發酵劑由山東寶來利來生物工程股份有限公司提供。

1.1.3 培養基

MRS固體培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，瓊脂1.5 g/L，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。

酵母膏蛋白胨培養基、孟加拉紅選擇性培養基、伊紅美藍培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.4 試劑

氫氧化鈉（分析純）：天津凱通化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實業有限公司；硫酸（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：濟南匯豐達化工有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖（生化試劑）：山東祥瑞藥業有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C雷磁精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DHP-9082數顯恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：常州諾基儀器有限公司；KDN-103F自動定氮儀、HYP308消化爐：上海纖檢儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；SHB-ⅢS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海弛唐電子有限公司；SD120D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；SX2-4-10箱式電阻爐：龍口市電爐制造廠；LD5-2A低速離心機：北京京立離心機有限公司；LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本津島公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵豆粕的制作

準確稱取200 g粉碎豆粕，按料水比5∶4（g∶mL）加入蒸餾水，混勻，按豆粕質量的2‰接種發酵劑，以不接種任何發酵劑的空白料為對照，32 ℃恒溫密封發酵72 h后，65 ℃烘干粉碎，得到發酵豆粕樣品，備用。

1.3.2 發酵豆粕的感官評價

在光線正常且無異味的環境中，稱取發酵豆粕樣品于平皿中，通過眼觀、鼻嗅及手捻等方式對發酵豆粕顏色、氣味和手感特征等進行評價，具體評價標準參考NY/T 2218—2012《飼料原料發酵豆粕》中對發酵豆粕感官性狀的要求。

1.3.3 pH值測定

準確稱取10 g發酵豆粕樣品于90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接采用玻璃電極pHS-3C型pH計測定pH值。

1.3.4 發酵劑和發酵豆粕中微生物含量的檢測

分別按GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌》、GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗酵母菌計數測定》、DB32/T 2583—2013《飼料中飼用芽孢桿菌的測定》對發酵劑和發酵豆粕中的乳酸菌、酵母菌及芽孢桿菌的含量進行測定。其中乳酸菌計數選用MRS固體培養基，芽孢菌計數選用酵母膏蛋白胨培養基，酵母菌計數選用孟加拉紅選擇性培養基進行。

1.3.5 發酵豆粕營養指標的檢測

水分含量：按GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》測定；粗蛋白質含量（以干物質計）：按GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》測定；粗灰分含量（以干物質計）：按照GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分測定方法》測定；酸溶蛋白含量（以干物質計）：采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法測定；總酸含量（以乳酸計）：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定；有機酸含量：參照GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》，采用高效液相色譜法檢測；中性蛋白酶活性、酸性蛋白酶活性：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定》測定。

1.3.6 發酵豆粕衛生指標的檢測

大腸桿菌：按照GB/T 18869—2002《飼料中大腸菌群的測定》測定；霉菌：按照GB 4789.15—2010《食品微生物學檢驗測定》測定。其中大腸桿菌計數選用伊紅美藍培養基，霉菌計數選用孟加拉紅培養基。

1.3.7 數據處理與分析

試驗數據用Excel軟件進行初步處理后，采用SPSS13.0進行統計分析，采用One-way ANOVA進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 三種益生菌發酵劑的比較

表1 三種益生菌發酵劑的比較Table 1 Comparison of three probiotic fermentation starters

由表1可知，益生菌發酵劑C主要由乳酸菌和酵母菌兩種菌株組成，活菌總數為15.8×108CFU/g，中性蛋白酶活性為26 379.02 U/g，酸性蛋白酶活性未檢測出。與益生菌發酵劑C相比，益生菌發酵劑A在組成菌株類型上相同，但活菌總數高達26.0×109CFU/g，中性蛋白酶活性為36 891.12 U/g，酸性蛋白酶活性為23 282.80 U/g；益生菌發酵劑B組成菌株類型則不同，主要由乳酸菌和芽孢桿菌組成，乳酸菌活菌數（10.0×108CFU/g）相近，芽孢菌活菌數為12.5×108CFU/g，中性蛋白酶間差異不大。

2.2 三種益生菌發酵劑固態發酵對發酵豆粕感官性狀的影響

三種益生菌發酵劑固態發酵72 h后取樣觀察，發酵豆粕的感官性狀見表2。

表2 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕感官性狀的影響Table 2 Effects of three probiotic fermentation starters on sensory trait of fermented soybean meal

由表2可知，三種益生菌發酵劑發酵豆粕后顏色差異不大，均為淺黃色至淺棕色，且色澤均勻一致；益生菌發酵劑C發酵豆粕后具有酸香味，還有淡淡的酒香味。益生菌發酵劑A具有微酸味，而益生菌發酵劑B發酵豆粕后具有微臭味，可能與發酵劑B中的芽孢桿菌有關；除益生菌發酵劑B稍有粘黏外，其余兩種益生菌發酵劑發酵豆粕后均不黏連，這可能與益生菌發酵劑B中含有芽孢桿菌有關。

2.3 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕pH值和有益微生物的影響

三種益生菌發酵劑固態發酵對發酵豆粕pH值和有益微生物的影響見表3。

表3 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕pH值和有益微生物的影響Table 3 Effects of three probiotic fermentation starters on pH and beneficial microorganisms of fermented soybean meal

由表3可知，三種益生菌發酵劑均能夠顯著降低發酵豆粕的pH值，其中以益生菌發酵劑C最低（4.85），且顯著低于其余各組（P＜0.05）。有益微生物含量方面：乳酸菌以益生菌發酵劑C最高（6.61×108CFU/g），其次是益生菌發酵劑A（3.82×108CFU/g），益生菌發酵劑B（1.73×108CFU/g）最低，三種益生菌發酵劑均顯著高于對照組（P＜0.05）；酵母菌以益生菌發酵劑C最高（20.60×107CFU/g），其次是益生菌發酵劑A（7.55×107CFU/g），益生菌發酵劑B（2.6×106CFU/g）最低，三種益生菌發酵劑均顯著高于對照組（P＜0.05）；芽孢桿菌數量均＜106，其中益生菌發酵劑B中含有芽孢桿菌，說明芽孢桿菌未成功發酵。由pH值和有益微生物含量來看，益生菌發酵劑C固態發酵豆粕效果較優。

結果表明，三種益生菌發酵劑發酵豆粕，均能顯著降低pH值（P＜0.05），促進乳酸菌和酵母菌的生長繁殖。這與其他學者的研究報道一致[14]。酵母菌作為兼性厭氧菌，在發酵豆粕的前期利用豆粕提供的營養物質大量繁殖，消耗氧氣，為乳酸菌的生長繁殖制造厭氧環境[15]，有利于乳酸菌的生長。乳酸菌在發酵過程中能夠將豆粕中的葡萄糖或乳糖轉化為乳酸等有機酸，進而降低了發酵豆粕的pH值[15-16]。益生菌發酵劑B是由乳酸菌和芽孢桿菌復配而成，因此發酵效果不理想。

2.4 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕營養指標的影響

三種益生菌發酵劑固態發酵對發酵豆粕營養指標的影響見表4。

由表4可知，三種益生菌發酵劑對水分和粗灰分的影響無顯著性差異（P＞0.05）；粗蛋白含量以益生菌發酵劑C組最高（47.11%），顯著高于益生菌發酵劑B（44.86%）和對照組（44.31%）（P＜0.05），但與益生菌發酵劑A（46.10%）差異不顯著（P＞0.05），說明益生菌發酵劑C能夠顯著提高發酵豆粕的粗蛋白含量。與空白對照相比，三種益生菌發酵劑均能夠顯著提高發酵豆粕的酸溶蛋白含量（P＜0.05），但三種益生菌發酵劑間差異不顯著（P＞0.05）。益生菌發酵豆粕能夠改善豆粕的營養結構，其在繁殖過程中能夠將豆粕中的非蛋白氮轉化成營養價值更高的菌體蛋白，同時能夠將大分子蛋白質轉化成小分子肽，更有利于動物的消化吸收。SONG Y S等[17]研究發現，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵豆粕總蛋白含量提高23.4%；馬文強等[4]研究發現，使用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌混合對豆粕進行發酵，發酵后粗蛋白含量提高13.48%；侯楠楠等[18]研究表明，乳酸菌和酵母菌固態發酵豆粕使得粗蛋白質含量顯著高出空白對照組6.07%，酸溶蛋白含量是對照的3.87倍。本試驗與上述研究一致，三種益生菌發酵劑均能顯著提高發酵豆粕的粗蛋白和酸溶蛋白含量，以益生菌發酵劑C效果較優。

表4 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕營養指標的影響Table 4 Effects of three probiotic fermentation starters on nutritional index of fermented soybean meal

2.5 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕有機酸的影響

三種益生菌發酵劑固態發酵對發酵豆粕有機酸的影響見表5。

表5 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕有機酸的影響Table 5 Effects of three probiotic fermentation starters on organic acid of fermented soybean meal

乳酸具有維持腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進鈣質吸收的功能。乙酸是一種很好的抗微生物劑和酸味劑。酒石酸具有抗氧化和增強酸味的作用。檸檬酸具有抗氧化，增加酸味，抑制細菌生長的作用，是一種良好的食物酸味劑。琥珀酸可以產生酸味，可用作防腐劑使用。蘋果酸是一種很好的穩定劑，具有較好的抗氧化能力，在酸性條件下，殺菌性很強，能促進氨基酸的吸收。由表5可知，三種益生菌發酵劑發酵豆粕的總酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中益生菌發酵劑C最高（19.81 g/kg），其次是益生菌發酵劑A（18.40 g/kg），兩者差異均顯著（P＜0.05）；三種益生菌發酵劑發酵豆粕中主要有6種有機酸，其中以乳酸、乙酸、酒石酸和檸檬酸為主。與對照組未發酵豆粕相比，三種益生菌發酵劑發酵豆粕均能夠顯著提高乳酸、乙酸、酒石酸和琥珀酸含量（P＜0.05）。與益生菌發酵劑B相比，益生菌發酵劑A和益生菌發酵劑C均能夠顯著提高乳酸、乙酸、酒石酸和琥珀酸含量，在提高有機酸含量方面效果較優。與益生菌發酵劑A相比，益生菌發酵劑C能夠顯著提高有機酸乳酸、乙酸、酒石酸和檸檬酸含量（P＜0.05）。綜合比較，益生菌發酵劑C在提高發酵豆粕有機酸含量上效果較好。張明峰等[19]研究發現，發酵豆粕中乳酸含量提高，降低了發酵豆粕的pH值，改變了適口性；付亭亭[14]研究發現，使用產朊假絲酵母（Candida utilis）發酵豆粕后乳酸含量提高5倍，使用屎腸球菌（Enterococcus faecium）發酵豆粕后乳酸含量提高34倍。

2.6 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕大腸桿菌和霉菌的影響

三種益生菌發酵劑固態發酵對發酵豆粕大腸桿菌和霉菌的影響見表6。

表6 三種益生菌發酵劑對發酵豆粕大腸桿菌和霉菌的影響Table 6 Effects of three probiotic fermentation starters on Escherichia coli and mold of fermented soybean meal

由表6可知，三種益生菌發酵劑發酵豆粕中大腸桿菌及霉菌含量均顯著低于對照組（P＜0.05），且益生菌發酵劑A和C效果較優。分析原因可能是益生菌發酵豆粕由于大量乳酸菌的生長繁殖，產生乳酸等有機酸，使得pH值顯著降低，從而抑制大腸桿菌和霉菌等有害微生物的生長。侯楠楠等[18]研究表明，發酵豆粕較高的乳酸菌含量能夠抑制大腸桿菌和霉菌的繁殖；王龍昌等[20]研究發現，發酵豆粕抑制大腸桿菌的繁殖，降低肉雞的腹瀉情況。本試驗結果與上述研究相一致，使用復合益生菌乳酸菌和酵母菌復配發酵豆粕顯著降低了大腸桿菌和霉菌數量。

3 結論

益生菌發酵劑A和C對發酵豆粕的感官性狀影響不大，三種益生菌發酵劑均能夠顯著降低發酵豆粕的pH值、大腸桿菌和霉菌數量（P＜0.05），顯著提高有益微生物數量、粗蛋白、酸溶蛋白、總酸和有機酸含量（P＜0.05）。三種益生菌中以益生菌發酵劑A和益生菌發酵劑C效果即乳酸菌和酵母菌固態發酵豆粕效果較好，結合成本考慮優先選擇益生菌發酵劑C。