孕婦基因多態性和自發性早產發生風險的關聯性研究

龐一鳴 王佳楣 劉念 陳小蘭 劉曉紅 王斌 李智文

早產(preterm birth)是指妊娠不滿37周的分娩，其上限全世界是統一的，但下限各個國家有所不同，這與各國新生兒治療水平有關。中國采用的是妊娠滿28周作為早產的下限[1]。根據早產的臨床分娩特征，可以分為自發性早產(spontaneous preterm birth)和醫源性(誘發性)早產，前者包括了胎膜完好的自發性早產(spontaneous preterm with intact membranes)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of the membranes，PPROM)。又根據孕齡的不同[2]，分為早期早產(孕28～31周分娩)、中期早產(孕32～33周分娩)和晚期早產(孕34～36周分娩)，亦有極早早產(<孕28周分娩)這一分類。

早產是一個全球范圍內的重要公共衛生問題，是全球新生兒死亡的首要原因，且在近年來超過肺炎，發展成五歲以下兒童死亡的首要原因[3]。在所有早產的發病中，自發性早產所占比例超過6成[4]。自發性早產的確切病因尚不明確，有研究指出，孕婦基因多態性[5]是影響自發性早產的可能因素之一，環境空氣污染物，如PM2.5、二氧化氮等對孕期的健康影響也獲得了研究者的關注[6]。在國內，僅有有限的研究，研究漢族人群基因多態性與自發性早產，關于環境空氣污染與自發性早產的研究尚未見報道。因此，本文根據2013—2014年在北京市海淀區婦幼保健院開展的自發性早產病例對照研究，探究代謝酶基因多態性以及孕早期環境中空氣PM2.5污染暴露對自發性早產發生的影響，為進一步闡明早產的病因，從源頭上防治自發性早產提供新的思路。

對象和方法

一、對象

采用病例對照研究，以2013年3月—2014年12月在北京市海淀區婦幼保健院發生自發性早產的孕婦作為病例，每招募一個病例，會招募同期在本院分娩健康足月兒的孕婦作為對照。此次研究共募集到孕婦308名，排除實驗數據缺失者，共有306例孕婦進入本研究，其中病例組103例，對照組203例。

自發性早產的診斷標準為孕28～36周分娩，并排除妊娠并發癥等明確原因引起的早產者。病例組的入選標準為年齡20～40歲，懷孕期間一直生活在北京的單胎活產孕婦，排除孕期患有重大疾病者以及吸煙者。對照組的選擇為同一醫院自然分娩足月新生兒(孕周≥37周)的產婦，除滿足病例組的標準外，還應與病例組產婦年齡相差三歲以內，且嬰兒性別相同。研究對象的招募和血標本采集均經本人知情同意，研究方案通過北京市海淀區婦幼保健院倫理審查。

二、方法

1.孕婦基本資料采集：通過北京市海淀區婦幼保健院門診電子病歷系統采集，主要包括孕婦的一般情況、既往生育史、患病史和此次妊娠情況等，如孕婦年齡、身高和體重、職業、出生日期、文化程度和婚姻狀況；既往孕產史，有無重大疾病；末次月經日期、分娩日期、分娩孕周、新生兒性別以及單雙胎等。

2.標本采集、DNA提取和基因型鑒定：北京市海淀區婦幼保健院護士按照臨床操作規程采集孕婦肘部靜脈血5 ml，經乙二胺四乙酸抗凝后放入采血管中進行離心，吸去上層血漿后獲得孕婦血細胞樣本，并于-80℃凍存。孕婦血細胞樣本采用鹽析法提取DNA，其濃度和純度經紫外/可見分光光度計進行檢測，純度要求OD260/280在1.8～2.0之間。基因型由基質支持的激光釋放/電離飛行時間質譜分析(MALDL-TOF MS)。以對照組中測得的最高頻率的基因作為該基因位點的野生型基因，其他則作為突變型基因。為保證實驗質量，隨機抽取10%的樣品進行二次檢驗。

3.孕早期PM2.5暴露水平的計算：采用美國國務院公布的美國駐北京大使館監測北京市2012—2014年PM2.5每日逐時濃度[7]作為環境暴露指標來源。根據逐時PM2.5濃度計算24 h平均濃度作為每日PM2.5暴露濃度。計算以校正末次月經之日起90 d的每日PM2.5暴露濃度的平均值，作為PM2.5孕早期平均暴露濃度。

4.統計學處理：采用Epidata軟件進行數據平行雙錄入。在對SNPs進行統計學檢驗時，為降低多重比較產生的假陽性，需對檢驗水準進行Bonferroni校正，以P<0.05/SNPs數量為差異有統計學意義。使用PLINK 1.07軟件檢驗基因的Hardy-Weinberg平衡，等位基因頻率的分布和差異，以及基因型頻率和遺傳模型。

應用SPSS 20.0軟件中的χ2檢驗對研究對象一般情況進行描述和分析，以P<0.05為差異有統計學意義。采用 Logistic回歸模型進行分層分析，根據PM2.5暴露濃度的不同，以PM2.5濃度≤100 ng/m3為低暴露組，以濃度>100 ng/m3為高暴露組，檢驗不同暴露水平下代謝酶基因多態性與早產結果的關系。

結 果

一、一般人口學和妊娠情況

研究對象年齡21～38歲，平均年齡為(29.7±2.7)歲，平均孕周為(37.5±2.3)周。其中病例組平均年齡(29.8±3.0)歲，平均孕周(34.7±1.7)周；對照組平均年齡(29.7±2.6)歲，平均孕周(38.9±1.0)周。研究對象中， 88.9%(272/306)為初次生產，56.9%(174/306)為首次懷孕。在病例組中，晚期早產共84人(81.6%，84/103)，中期早產14人(13.5%，14/103)，早期早產5人(4.9%，5/103)，無極早早產發生。

兩組孕婦之間的一般人口學特征和妊娠情況比較，差異均無統計學意義，兩組間均衡可比。見表1。

二、SNPs的等位基因頻率和遺傳模型分布

1. 等位基因分型和Hardy-Weinberg平衡：本研究共檢測了3個一相代謝基因的5個SNPs位點以及3個二相代謝基因的3個SNPs位點。各位點等位基因檢測的應答率均為100%，MAF值均>1%，在對照組中進行的Hardy-Weinberg平衡檢測顯示各位點基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。見表2。

2.各SNPs等位基因在病例組和對照組的分布:各SNPs位點等位基因頻率的分布見表3。僅有rs2472304(CYP1A2)的等位基因頻率在兩組間的分布差異有統計學意義。由于共涉及8個SNPs位點，因此經Bonferroni校正后的檢驗水準P`=0.05/8=0.037。此時rs2472304組間差異有統計學意義，其他各SNPs組間差異均無統計學意義。

表1研究對象的一般人口學和妊娠情況 [例(%)]

Table1Comparison of maternal characteristics and pregnancy information between the control and case group [n(%)]

VariableControl(n=203) Case(n=103)Total(n=306)Age(year) ≤24 7(3.4)2(1.9) 9(2.9) 24<～<3094(46.3)48(46.6)142(46.4) ≥30102(50.3)53(51.5)155(50.7)BMI(kg/m2) <18.529(14.4)12(11.8)41(13.5) 18.5≤～<25144(71.2)75(73.5)219(72.0) ≥2529(14.4)15(14.7)44(14.5)Education Graduate degree and above56(27.6)26(25.3)82(26.9) University degree89(43.8)49(47.6)138(45.2) Junior college35(17.2)16(15.5)51(16.7) Senior high16(8.0)9(8.7)25(8.2) Junior high and lower 7(3.4)2(1.9) 9(3.0) Missing 01(1.0) 0Passive smoking Yes14(6.9)10(9.7)24(7.8) No189(93.1)93(90.3)282(92.2)Infant sex Male130(64.0)66(64.1)196(64.1) Female73(36.0)37(35.9)110(35.9)Parity Primipara181(89.6)91(88.3)272(89.2) Multipara21(10.4)12(11.7)33(10.8)Gravidity 1112(55.2)62(60.2)174(56.9) 255(27.1)26(25.2)81(26.5) ≥336(17.7)15(14.6)51(16.7)

表2 SNPs分型結果和Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

aThe detection rate of genotyping；bMinor Allele Frequency；cBased on the control group

表3各SNP位點等位基因在病例組和對照組中的分布

Table3The proportions of allele gene of SNP among cases and controls

SNP No.Minor alleleProportion in case (%)Proportion in control(%)Pars2472304A10.719.7<0.001rs2855658T14.115.50.64rs4646421A42.238.90.43rs4646425T6.38.40.36rs4646903G42.239.40.50rs1051740C43.239.20.34rs1695 G18.519.00.88rs2234922G8.38.10.96

aBonferroni correction: a sum of 8 SNPs was detected, therefore,P=0.05/8=0.037

3.rs2472304在兩組間的基因型頻率及不同遺傳模型下與早產的關系:發現該SNP的基因型在兩組間差異有統計學意義，進一步計算發現其與早產的發生存在關聯。其關聯在共顯性模型和顯性模型下差異均有統計學意義，但由于在計算共顯性模型時，rs2472304在病例組中的突變純合型(AA)數量為0，在計算時可能會存在假陽性的結果，因此，該SNPs的可能遺傳方式是顯性模型遺傳。在該模型下，攜帶AA/AG基因型個體較攜帶野生型基因(GG)基因型個體發生早產的危險度降低(OR= 0.52，95%CI：0.30～0.90)。見表4。

4.孕早期不同環境PM2.5暴露水平下rs2472304對早產的影響:

(1)PM2.5的暴露。研究對象孕早期PM2.5暴露濃度的中位數和四分位數間距(IQR)為101.1 [82.4，133.5]ng/m3，其中病例組為101.1 [82.4，118.2]ng/m3，對照組為101.1 [82.2，137.3]ng/m3，兩組的濃度差異經Mann-Whitney U秩和檢驗,差異未見統計學意義(P=0.732)。

(2)不同暴露水平下rs2472304對早產的影響。以顯性模型作為rs2472304的遺傳模型，對孕早期不同暴露環境下基因多態性與自發性早產發生風險做分層分析。在較低PM2.5暴露濃度時，rs2472304未見關聯(OR= 0.65，95%CI：0.30～1.37)；但在較高PM2.5暴露情況下，該SNPs與早產的發生有關(OR= 0.40，95%CI:0.18～0.92)，突變型對早產的發生有保護作用,經年齡和BMI調整后，差異仍保留統計學意義(OR= 0.39，95%CI:0.17～0.90)。見表5。

表4 rs2472304基因型頻率及不同遺傳模型下與早產的關系

表5 不同環境PM2.5暴露水平下rs2472304與自發性早產發生的分層分析

aAdjusted by age and BMI

討 論

環境因素是導致孕婦發生早產的重要因素，早產已被證明與PM2.5污染物的暴露存在關聯[8], 有研究指出，中國約30%～40%的早產率升高需歸因于PM2.5的高暴露，而同期美國僅有2%[9]。但是，關于自發性早產這一早產類型與環境PM2.5暴露的研究很少。本研究檢驗了這一關系，但并未發現PM2.5的孕早期暴露與自發性早產的發生存在關聯，這與2016年美國紐約開展的一項研究結果類似[6]。雖然本研究中并未發現PM2.5是導致自發性早產的危險因素，但既往有研究發現，該物質的暴露仍然會增加總早產和其他不良妊娠結局的發生風險[8]，孕婦在妊娠期也應全程減少暴露于過高濃度的PM2.5。

已有幾種基因被研究者證實影響了自發性早產的發生，其中一些參與編碼人體一相和二相代謝酶的SNPs發現與自發性早產的發生存在關聯[10-11]。本研究發現，CYP1A2基因中的rs2472304的多態性與自發性早產的發生有關，攜帶突變基因(AA/GA)的孕婦發生早產的風險降低。CYP1A2基因編碼細胞色素P450-1A2酶，是人體重要的一相代謝酶，參與體內多種藥物和環境有害物質代謝，其活性和表達水平可受多種因素影響，而其基因多態性起著重要的作用。既往的研究發現，rs2472304的 G/A突變會影響人體對外源性物質如某些精神類藥物的代謝，該位點攜帶突變基因A的研究對象相較于攜帶野生基因G的研究對象體內藥物濃度會顯著降低，說明該突變可以提高一相代謝水平，促進外源性物質的代謝[12]。本研究發現，該位點的突變對自發性早產的發生也存在一定的保護作用，可能與該突變增加了孕婦對體內污染物的代謝能力，減少污染物內暴露有關。本研究接下來的分層分析中發現，在PM2.5孕早期暴露水平較低的孕婦中，該突變并未觀察到作用；但在暴露水平較高的孕婦中，該突變顯示了減少早產發生的保護作用。這說明在較高濃度的PM2.5暴露下，相比于野生型基因，該突變引起的一相代謝速率提高使得孕婦機體得以更加迅速的清除體內的PM2.5以及伴隨的其他外來污染物，進而減輕了人體因暴露于PM2.5而引起的炎性反應和氧化應激反應，對預防早產的發生起到了一定的保護作用。值得注意的是，該基因在全球不同種族的人群中分布具有極大的差異性，根據國際千人基因組計劃的測定[13]，在早產發生率較低的白種人群中，突變基因A的基因頻率在0.6以上；而在早產發生率較高的亞非人群中，突變基因A的基因頻率不足0.16。雖然需要考慮到白種人群和亞非人群的巨大社會經濟差異，但基因頻率的差異在rs2472304在自發性早產的發生中起到的作用仍然值得進一步研究。

綜上所述，本研究發現，參與編碼CYP1A2的rs2472304的突變基因與自發性早產的發生存在關聯；在不同PM2.5暴露濃度下，該突變顯示出在較高污染暴露狀況下對自發性早產有保護作用。