拷貝數變異測序在胎兒先天性心臟病產前遺傳學診斷中的應用

鄧新娥 黃杏玲 王遠流 劉百靈 唐寧 黃際衛

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是最常見的出生缺陷，在活產新生兒中的發病率約為0.8%～1.0%,也是1歲以下嬰幼兒非感染性死亡的主要病因[1],中國衛生部門發布的出生缺陷數據表明，CHD占出生缺陷的26.7%[2]。CHD病因包括遺傳因素、環境因素或兩者兼之，疾病發生發展的病理機制復雜。研究表明，目前能解釋的CHD遺傳病因不超過30%，而染色體畸變是最常見的遺傳病因學之一[3-4]。近十幾年來，隨著分子遺傳檢測技術的迅猛發展，如染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)、下一代測序(next generation sequencing,NGS)技術的發展應用，為疾病致病基因組/基因的發現及基因型-表型關聯分析提供強有力的工具。本文采用拷貝數變異測序(CNV-Seq)技術對產前超聲提示為CHD的胎兒進行染色體核型分析及拷貝數變異(copy number varians,CNV)檢測，結合胎兒臨床表型分析染色體微缺失或微重復與胎兒CHD的關系，初步探討CNV-Seq技術在胎兒CHD產前遺傳學診斷中的應用價值。

資料與方法

一、資料來源

選取2017年1月～12月于早孕期(11～13+6周)或中孕期(20～28周)在廣西省柳州市婦幼保健院進行超聲頸項透明層的檢查或系統彩超或針對胎兒超聲心動圖檢查等被診斷為胎兒心臟異常伴或不伴心外異常的孕婦共87例。87例孕婦均為單胎妊娠，年齡19～44歲，平均年齡(29.8±5.3)歲；孕周為12～33周，平均孕周(24.1±3.8)周。本研究所有孕婦均進行產前遺傳咨詢，并被充分告知相關產前遺傳學診斷的必要性、局限性及風險，經患者知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1.介入性產前診斷：根據患者就診孕周不同，采用不同的介入性穿刺術,其中絨毛活檢5例，羊膜腔穿刺56例，臍血管穿刺26例。所有介入性操作均嚴格按照產前診斷管理辦法中的介入性產前診斷穿刺術[5]常規進行。

2.染色體核型分析：孕10～13+6周的孕婦選擇B超引導下經腹絨毛取材，胰酶及膠原酶預處理，接種于絨毛培養基中培養7～9 d；孕16～24周的孕婦則選擇羊膜腔穿刺取羊水20 ml，離心收集羊水細胞，接種于羊水培養基中培養7～9 d；對于孕24周以后的孕婦，選擇臍帶穿刺術，抽取臍靜脈血1～1.5 ml，接種于外周血培養基中培養3 d，以G顯帶染色(必要時加做C顯帶或N顯帶)制備染色體標本,每例標本按照ISCN(2016)標準[6],油鏡下分析20個分散好、中等長度的中期分裂相,發現嵌合體或異常核型時加數到100個分裂相[4]。

3.高通量測序基因組拷貝數變異分析：(1)提取基因組DNA。基因組 DNA提取使用 QIAGEN公司生產的基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行。(2)DNA文庫構建。將提取的基因組DNA在超聲打斷儀上打斷成小片段核酸；采用打斷后的基因組DNA為起始模板，構建文庫，通過PCR擴增的方法進行富集；采用磁珠純化的方法，對PCR擴增后的 DNA文庫進行純化，從而得到DNA小片段文庫。(3)測序。將構建好的DNA文庫在IlluminaHi Seq 5000測序平臺進行上機測序，最小精度在100 kb，測序深度1X。(4)生物信息學分析。將高通量測序結果經信息分析，將每個測序Reads匹配到其所在的染色體上，做相應標準化Z值分析，通過Z值進行染色體異常判定，然后通過檢索UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/)、DECIPHER(http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)、OMIM(http://www.omim.org)、ClinVar(https://www.clinicalgenome.org/data-sharing/clinvar/)、DGV(http://projects.tcag.ca/variation)、PUBMED(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=)等數據庫進行CNV臨床意義的確定。

4.統計學處理：采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，染色體核型分析檢出率與CNV-Seq技術檢出率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義

結 果

一、傳統G顯帶染色體核型分析

87例孕婦的樣本細胞培養均成功，并能發出報告，檢出染色體非整倍體或結構重排共有11例,占12.6%(11/87)，其中21-三體2例(圖1)，18-三體2例，13-三體1例,X染色體單體1例，1例為未知來源片段插入15q26.3；常見的心臟異常為室間隔缺損，5例合并有心外結構異常，如十二指腸梗阻、唇腭裂，雙側脈絡膜叢囊腫、單臍動脈等。另外還檢出3例染色體正常變異，其中2例為9號染色體p12q13臂間倒位，1例為15號染色體雙隨體，1例為22號染色體短臂可能有異染色質。結果見表1。

二、CNV-Seq技術CNV分析

CNV-Seq技術檢出染色體畸變為17.2%(15/87)，其中2例21號染色體三拷貝，2例18號染色體三拷貝，1例13號染色體三拷貝，1例X染色體單拷貝，1例6號q23.2遠端重復及15號q26.3遠端的大片段缺失；另外還檢出8例微缺失微重復，片段大小為0.46～5.86 Mb，通過檢索UCSC、DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV、PUBMED等數據庫進行CNV臨床意義確定，其中4例為明確致病性，包括22q11.2微缺失綜合征、22q11.2微重復綜合征、16p13.3微重復綜合征、1q43-44微缺失綜合征(圖2)；2例臨床意義不確定，2例為多態性(良性)。具體結果詳見表1。

三、傳統G顯帶染色體核型分析與CNV-Seq技術CNV分析在胎兒心臟發育異常病例中的比較

在87例的胎兒CHD中，兩種檢查方法共檢出染色體畸變18例，檢出率為20.7%(18/87)。其中染色體核型分析檢出率為12.6%(11/87)，CNV-Seq技術檢出率為17.2%(15/87)，染色體核型分析檢出率與CNV-Seq技術檢出率差異無統計學意義；傳統染色體核型分析正常但CNV檢出異常有8例(包括致病性、臨床意義不明及良性)，占9.2%(8/87)，CNV-Seq技術額外檢出了9.2%(8/87)的染色體畸變，但3例染色體核型多態性CNV-Seq分析未能檢出。

G-banding results showed trisomy 21 (excluding sex chromosomes)

圖2 微缺失del(1)(q43q44)的全基因組CNV-Seq結果

四、隨訪結果：電話隨訪87例胎兒妊娠結局，其中優生引產24例，包括7例染色體核型分析與CNV-Seq分析一致的致病性CNV(見表1中的序號為7、8、11、12、13、14、16的病例)及6例染色體核型正常但CNV異常的胎兒(見表1中的序號為1、3、6、9、10、17的病例)。分娩63例，新生兒一般情況良好，包括2例良性CNV(見表1中的序號為5、15的病例)。

表1 18例產前超聲診斷胎兒心臟異常的染色體畸變情況

Note:Nindicate that no chromosomal aneuploidy or more than 100 Kb of known CNVs has been detected.

討 論

一、胎兒CHD與染色體畸變的關系

胎兒CHD是一類具有高度異質性的疾病，絕大部分的病因仍未知，染色體畸變是最常見的遺傳學病因之一。染色體非整倍體是最早被確認的胎兒CHD 致病原因之一，Chaoui等[7]研究發現，22%胎兒CHD合并有染色體核型異常。CNV是引起復雜性發育畸形的因素，是胎兒CHD發生發展的重要分子病理機制之一。Mademont-Soler等[8]研究發現22q11.2微缺失綜合征在胎兒CHD核型結果正常者中占6.4%。Jansen等[9]研究經過排除染色體重排、22q11.2微缺失伴或不伴合并心外畸形的胎兒后，發現在胎兒單一心臟異常中有4.0%致病性CNV及6.0%的臨床意義不明變異。Zhu等[10]運用CMA和CNV-Seq技術對115例CHD胎兒的羊水細胞DNA進行檢測，發現18.3%胎兒CHD與致病性染色體畸變有關，其中單一的心臟異常占8.2%，心臟合并心外畸形的占28.6%，其中5例CNV與DiGeorge, Wolf-Hirschhorn，Miller-Dieker，Cri-du-chatand Blepharophimosis，Ptosisand Epicanthus Inversus 等綜合征相關，還發現4例罕見的致病性CNV。而在本研究中，胎兒CHD的染色體畸變檢出率為20.7%，其中傳統染色體核型分析檢出率為12.6%，CNV-Seq技術檢出率為17.2%，傳統染色體核型分析正常但CNV異常有8例，占9.2%，CNV-Seq技術額外檢出了9.2%的染色體畸變，與相關文獻報道相近。因此，對CHD胎兒進行染色體畸變檢查有助于對一些遺傳性CHD胎兒進行鑒別，為評估胎兒的長期預后提供依據，傳統的染色體核型分析方法會導致微缺失微重復的漏診，造成不良后果，CNV-Seq技術是檢測CNV有效途徑之一，可作為傳統染色體核型分析技術補充方法。

二、CNV-Seq技術在胎兒CHD遺傳學診斷中的應用

CMA是一種檢測基因組微小變異的有效工具，能同時檢測整個基因組亞顯微結構的CNV，已被廣泛應用于復雜性疾病基因組失衡包括CHD在內的研究中，但CMA通常需要150～250 ng基因組DNA才能滿足檢測需求，而且價格相對昂貴。NGS是近十年迅速發展起來的一種以高通量、低成本、速度快為主要特征的測序技術，此技術能在一次檢測中分析整個基因組范圍的CNV及其所影響的基因，并為疾病基因的發現及基因型-表型關聯分析提供強有力的工具,越來越廣泛的被作為檢測基因組失衡(染色體微缺失/微重復)的有效途徑之一[11-13]。利用下一代測序的CNV-seq技術可以在全基因組范圍內以較高的分辨率檢測CNV，與CMA相比可以增加不同的測序深度獲得更精確的信息，僅需要50 ng基因組DNA即能完成檢測，具有更加靈活、快速、準確、運行成本低等優點,對于產前的珍貴樣本檢測更具優勢。近年來，CNV-Seq技術已開始應用于胎兒CHD遺傳學診斷中，Zhu等[10]運用CMA和CNV-Seq兩種技術采用盲法進行檢測，結果顯示CMA與CNV-Seq對CNV的檢測敏感性和特異性相當。蔡莉蓉等[14]運用CNV-Seq技術對染色體核型正常的10例CHD胎兒進行遺傳學檢測，有8例共檢測到13處250 kb～13 Mb染色體片段的拷貝數變異，認為CNV-Seq技術用于胎兒CHD遺傳分析是可行的。在本研究中，應用CNV-Seq技術在CHD胎兒中檢出染色體畸變為17.2%，7例與染色體核型分析結果一致，這7例孕婦均選擇了優生引產。另外還檢出8例(9.2%)染色體核型正常但CNV結果異常的CHD胎兒，CNV-Seq技術額外檢出了9.2%的染色體畸變，其中1例為22q11.2微缺失綜合征，1例為22q11.2微重復綜合征，1例為16p13.3微重復綜合征(OMIM:613458),1例1q43-44微缺失綜合征(OMIM:612337)，這些綜合征表型具有高度異質性，還可表現為生長發育遲緩、智力障礙、神經系統異常等[7,15-16]；另2例數據庫比對結果為臨床意義不明變異，其中1例雖然未涉及OMIM致病基因，但是DECIPER數據庫有類似病例報道[17]，可表現為發育遲緩、語言發育遲緩、智力低下、手指的短指骨等，而本病例的超聲表現為法洛四聯癥、右位動脈弓。1例16號染色體p13.11處重復1.34 Mb區域，覆蓋了16p13.11 recurrent microduplication (neurocognitive disorder susceptibility locus)綜合征約90%區域，該綜合征所在重復區域為神經認知障礙易感區，臨床表現高度異質性，患者可能表現為運動和語言功能發育遲緩、學習障礙、注意缺陷、CHD等[18]，這6例孕婦均經過充分的知情告知情況下選擇了終止妊娠。另外，檢出了2例良性CNV，這2例良性CNV孕婦及其他未檢出已知的明確致病性CNV并選擇繼續妊娠的孕婦均已分娩，隨訪出生后的嬰兒尚未發現其他伴隨癥狀。研究還發現CNV-Seq技術不能檢出染色體平衡重排如9號臂間倒位、雙隨體等[19]。由此可見，CNV-Seq技術在胎兒CHD遺傳病因的研究中是一種有效的檢測方法，可檢測出全基因組范圍100 kb以上的微缺失微重復，可進一步了解胎兒CHD 的遺傳學病因及確定胎兒CHD新致病基因，從基因組水平研究其發病機制，為胎兒CHD的預防及干預性治療奠定基礎。但CNV-Seq技術仍然有它的局限性及風險，特別對于CNV結果為臨床意義不明的病例，對臨床咨詢是一個挑戰，咨詢醫師應充分做好孕婦及家屬病情告知及檢測技術的局限性的告知。

綜上所述，染色體畸變是導致胎兒CHD的重要遺傳因素，應用CNV-Seq技術可檢測與識別胎兒CHD亞顯微結構的染色體畸變，能發現新的潛在的致病CNV，可作為傳統染色體核型分析方法的有效補充手段，但考慮其局限性及風險，臨床咨詢醫師應充分告知患者檢測技術的局限性。