聯合探針錨定聚合測序法在遺傳性耳聾基因檢測中的臨床應用

周雪原 王杰 黃艷 侯東霞 李靈 侯麗青 冀云鵬 馬玉珍 王曉華

遺傳因素耳聾患者大約占耳聾人群的60%以上[1-2]。國內聽力殘疾流行病學研究表明，80%以上遺傳性耳聾患者攜帶的突變基因多集中在GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體12SrRNA上。目前臨床實驗室多用耳聾基因芯片檢測試劑盒來檢測遺傳性耳聾，基因檢測位點包含9個或15個位點，適用于臨床上的一般篩查。但是，對于罕見耳聾基因上的異常，以及大規模的新生兒耳聾基因篩查，芯片法有其明顯的不足。目前高通量測序是臨床醫學基因檢測的先進技術，適應于大規模的臨床基因檢驗，而且精準快速。但高通量測序技術應用于臨床進行遺傳性耳聾基因檢測，目前無實驗室開展，該技術及相應試劑盒無臨床檢驗資質。本研究擬通過應用基于高通量測序的聯合探針錨定聚合測序法來檢測臨床標本，對測序結果進行Sanger測序驗證，同時與目前流行的基因芯片法進行比對，綜合探索聯合探針錨定聚合測序法的臨床應用價值，為聯合探針錨定聚合測序法申報臨床檢驗資質提供有力數據。

對象與方法

一、對象

選取內蒙古自治區婦幼保健院遺傳優生科耳聾基因檢測標本庫已知為遺傳性耳聾基因檢測結果異常標本35例。35例患兒中女性15例，男性20例，出生體重均在2 500克以上，出生孕周≥37周。出生后48～72 h內采足底血制作干血滴濾紙片用于基因檢測。患兒父母或監護人均已簽署基因測序知情同意書。

二、方法

1.標本采集：采用干血滴濾紙片法，在患兒足跟部采血，并滴于采血紙片上，形成一個或數個均勻血斑，自然風干后即可進行檢測。標本如不能及時檢測，則暫時密封于-20 ℃冰箱中待檢。

2.干血片樣本基因組DNA提取：使用打孔器制作6 mm的干血片，放入1.5 ml離心管，使用Qigan干血片核酸提取試劑盒提取樣本基因組DNA，DNA濃度經測定，在20～50 ng/μl為宜，-20 ℃暫存。

3.聯合探針錨定聚合測序法分析：

(1)文庫制備。對提取的基因組DNA樣本通過打斷修復，接頭連接，PCR擴增進行文庫制備。配制打斷修復混合液，將基因組DNA打斷修復。按標本數量每個標本分別加入15 μl標簽接頭，接頭與模板DNA結合，使每個模板都有特定標簽并純化；對模板進行PCR擴增，PCR擴增程序：94 ℃ 120 s，1個循環；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，35個循環；72 ℃ 300 s，1個循環；12 ℃暫存。擴增產物純化并測濃度，濃度≥ 2 ng/μl為合格。

(2)測序反應。使用測序反應通用試劑盒(聯合探針錨定聚合測序法，湖北華大生物科技)在基因測序儀(BGISWEQ-500，深圳華大)上進行測序。

(3)數據分析。數據下機后進行信息分析。首先對下機的原始數據(raw reads)進行測序質量評估，去除低質量以及被接頭污染的reads。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner)與HG19/HG20進行序列比對，與此同時進行序列捕獲效果評價，用GATK軟件進行SNV(single nucletide variant)和Indel(insertion and deletion)的查詢，生成目標區域堿基多態性結果，隨后進行數據庫(NCBI dbSNP, HapMap, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults)的比對，并對找出的可疑突變進行注釋、篩選。應用遺傳性耳聾基因分析軟件，按照測序后數據分析標準流程操作，至少兩人對測序數據進行分析整理，并核對。

4.芯片法分析(十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒，博奧生物)：

(1)核酸擴增。將含有十五個突變位點的15組引物分裝在三組核酸擴增體系內，每組25 μl 擴增體系 (5 μl DNA模板)，PCR擴增程序：37 ℃ 600 s，1個循環；95 ℃ 900 s，1個循環；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，70 ℃ 45 s，35個循環；60 ℃ 600 s，1個循環。擴增產物12 ℃暫存。

(2)雜交。三個體系PCR產物各20 μl混勻，加入磁珠混懸液30 μl，靜止結合10 min，吸液；120 μl 0.1 M NaOH變性10 min，吸液；雜交盒溝槽加入100 μl超純水，雜交緩沖液20 μl，吹打混勻，取15.5 μl加到芯片點陣上，密封雜交盒，50 ℃芯片雜交儀60 min。

(3)洗滌，干燥。雜交結束前10 min配置吸液，洗滌并干燥后的芯片，進入芯片掃描儀(LurScan-10K/B)，在DeafTest-15系統中讀取雜交位點結果。

(4)結果判讀。結果由晶芯十五項遺傳性相關基因檢測分析系統自動判讀，由于產品對所檢測的15個位點野生型和突變型分別設計了引物和探針，因此該芯片可同時檢測到這15個位點的野生型和突變型結果。當探針的檢測信號值大于或等于該探針的覆蓋值時，判讀該探針為陽性；當探針的檢測信號值小于該探針的覆蓋值時，判讀該探針為陰性。

5.Sanger法驗證：對于所有發現的致病突變，在其所在片段上下游設計引物。進行PCR擴增，對產物做Sanger測序，所得結果與檢測基因標準序列進行比對，從而驗證基因芯片捕獲和高通量測序的結果。

6. 靈敏度計算公式：以Sanger測序結果為金標準，根據表1計算聯合探針錨定聚合測序法的靈敏度。靈敏度=A/(A+C)×100%。

表1 靈敏度計算用表

結 果

一、聯合探針法測序結果

應用聯合探針錨定聚合測序法對35例標本基因組DNA進行分析，35例結果均有異常，突變集中在GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA四個基因上。其中GJB2基因35delG、176_191del16、299_300delAT位點各有2例雜合突變，235delC位點雜合突變1例，純合突變1例；GJB3基因538C>T雜合突變2例；SLC26A4基因1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2168A>G、IVS15+5G>A和IVS7-2A>G位點各有2例雜合突變；線粒體12S rRNA基因1494C>T位點1例異質突變型，4例均質突變型，1555A>G位點1例異質突變型，3例均質突變型。見表2。

表2 聯合探針錨定聚合測序法35例標本的檢測結果

二、與Sanger測序方法檢測結果比較

應用Sanger測序對檢驗結果進行驗證，結果與聯合探針法檢測一致。聯合探針法靈敏度為100%。

三、與芯片方法檢測結果比較

應用芯片法檢測35例樣本，見圖1，結果與聯合探針法檢測一致。

討 論

一、目前耳聾篩查的策略

耳聾是一種普遍高發的聽力障礙性疾病，環境因素、遺傳因素均可導致耳聾的發生。遺傳性耳聾有幾個較為常見的熱點突變，其中中國人群常見耳聾突變主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體的12S rRNA基因突變[3-5]。近年來，臨床上采用聽力篩查與基因檢測相結合的方法，有助于臨床早期發現處于語前聽力損失、遲發性或藥物致聾型的高危患者，并通過及時干預與治療降低耳聾高危人群的發病率。基因檢測可快速診斷遺傳性耳聾病因，將耳聾基因檢測應用于新生兒聽力篩查與診斷、產前診斷、孕前體檢，是分子技術向臨床應用轉化的重要途徑[6]。

圖1 芯片檢測位點異常雜交結果

二、聯合探針錨定聚合測序法的原理與優勢

聯合探針錨定聚合測序法，根據遺傳性耳聾基因突變位點序列信息，設計特異性擴增引物，利用多重PCR技術，擴增基因組DNA中靶序列，同時引入用于樣本識別的樣本標簽序列。將PCR產物按比例混合成為一個文庫樣本，經過一系列文庫制備過程，每個文庫樣本中的DNA序列都加上了用于測序及文庫識別的接頭序列。將適量文庫樣本按等物質的量比例混合為一個測序樣本。基因測序儀對測序樣本DNA進行序列信息讀取，每一條DNA的測序結果經過文庫接頭序列及樣本標簽序列比對拆分后將被精確定位到每一個樣本中，將每個樣本的測序結果與人類基因組比對，并對耳聾基因的突變位點進行數據分析，從而確定耳聾基因位點的檢測結果。聯合探針錨定聚合測序法優點是：(1)高通量。可同時檢測上百個樣本，適用于臨床人口大范圍的耳聾基因篩查。(2)基因組水平的篩查。除了遺傳性耳聾涉及的常見基因及特定位點，聯合探針錨定聚合測序法可以覆蓋整個基因組，結合目前國內外所有報道過的耳聾基因序列，可設計特異引物，來篩查臨床難以發現的致病基因的遺傳性耳聾[7]。因此，聯合探針錨定聚合測序法可以根據臨床要求，調整待測基因引物，即可以大范圍地檢測耳聾基因panel，也可以根據患者臨床癥狀及病史，有針對性地檢測和表型相關的基因。這符合目前國家精準化醫療的理念。(3)對標本DNA含量要求低。聯合探針錨定聚合測序法的操作中有文庫制備，其目的是對標本中基因組DNA進行擴增，來增加測序的深度。這特別適合樣品采集困難的患者，比如對新生兒的足底干血片制作。

三．聯合探針錨定聚合測序法的局限

聯合探針錨定聚合測序法的主要局限是成本問題。由于高通量測序儀的使用及維護成本較高，該方法適宜于一次進行上百例的檢測。如果單次檢測量少，會增加檢測的費用。因此，該方法更適用于面對大人口基數檢測任務的耳聾基因篩查機構。

四、聯合探針錨定聚合測序法的臨床評估

本次試驗主要是應用臨床實驗室常用的耳聾檢測技術微陣列芯片技術(十五項)和基因測序“金標準”Sanger測序來分別驗證聯合探針錨定聚合測序法在遺傳性耳聾基因檢測方面的準確性、靈敏度[8-10]。聯合探針錨定聚合測序法的檢測結果顯示35例標本全部為陽性，涉及4個基因17個位點，與微陣列芯片檢測法結果一致，并經Sanger測序驗證，其靈敏度達到100%。

五、總結

本研究通過對聯合探針錨定聚合測序法的驗證試驗，證實了聯合探針錨定聚合測序法臨床實驗室檢測的可應用性，可進一步在省級以上耳聾基因檢測實驗室推廣，便捷的高通量檢測方法可以更好地服務臨床，為耳科醫生提供可靠數據支持，為患者提供更全面的檢測。