白三烯受體阻滯劑對大鼠哮喘模型肺部損害作用的實驗研究

戴吉成 畢文術 都玉敏 刁甜甜 任明永

過敏性慢反應物質白三烯(leukotriene；LTs)已被確認在支氣管哮喘發病中起較重要的作用[1]。LTs受體在人體和大鼠體內有二種，一種為半胱氨酰白三烯(cysteine leukotriene；Cys-LTs)受體，另一種為白三烯B4(leukotriene B4；LTB4)受體。Cys-LTs受體在肺支氣管平滑肌和巨噬細胞中有較強的表達，主要引起嗜酸細胞及淋巴細胞、單核細胞聚集并釋放淋巴因子，在肺氣管黏膜壁上大量聚集從而引起支氣管平滑肌痙攣。LTB4在肺組織中也有較強的表達，可引起中性粒細胞的趨化并聚集，產生支氣管黏膜壁的炎癥反應，從而使支氣管黏膜壁通透性增加，氣道分泌物增多。也有文獻報道稱可能有第三種或更多的受體亞類。目前，阻斷Cys-LTs受體的藥物主要為孟魯司特，而阻斷LTB4受體的阻滯劑還在研究階段。本實驗利用大鼠哮喘模型，觀察LTs受體表達后對肺臟的損害，以及阻滯LTs受體對肺部的影響。

材料和方法

1. 實驗材料:健康大鼠30只，雌雄不限，體重180～250 g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)購自美國Sigma公司，孟魯司特購自美國默沙東公司，霧化泵經由葛蘭素公司提供。

2. 哮喘模型的建立：將30只大鼠分為空白對照組8只，哮喘模型組22只。參照近期報道的辦法[2-4]，哮喘模型組在第0、7天，每只大鼠分別在腹腔內注射抗原混懸液(OVA1 mg、溶解于含10%氫氧化鋁的無菌生理鹽水0.5 ml配成混懸液)致敏。從第14天開始霧化1% OVA進行哮喘激發，每天1次，每次20 min。大鼠致敏激發后，即刻表現為呼吸急促，節律不規則，行動遲緩，嚴重者大小便失禁；連續激發表現為發音遲鈍、豎毛、毛色失去光澤。在大鼠哮喘模型中挑選喘息癥狀最為明顯者16只，再分成哮喘組和孟魯司特組，每組各8只。其中孟魯司特組在霧化第2天開始口服孟魯司特(4毫克/日)。空白對照組均用無菌生理鹽水代替。

3. 組織標本制備、留取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage fluid；BALF)：末次霧化激發后24 h麻醉大鼠，打開胸腔，暴露兩肺，觀察大體標本；然后經氣管插管以無菌生理鹽水3 ml進行全肺灌洗，重復3次后收集BALF作細胞學分類及淋巴細胞凋亡分析；以止血鉗夾閉右支氣管，切除右肺中葉用10%中性緩沖甲醛固定，留用組織病理學檢查。

4. 組織病理切片制備：常規石蠟包埋切片，HE染色后，留取觀察肺組織病理改變。

5. 細胞培養與白細胞計數：(1)將10×Binding buffer工作液加入無菌去離子水稀釋成1×Binding buffer工作液。(2) 對于懸浮細胞，500～1 000 g離心5 min收集細胞。對于貼壁細胞，要用不含EDTA的胰酶消化細胞，加入細胞培養液。將細胞輕輕吹打下來，轉移到離心管內，500～1 000 g離心5 min收集細胞。(3)收集細胞后，加入預冷PBS溶液后輕搖或移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細胞，共洗滌兩次。(4) 在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細胞，使細胞濃度達到1×106cell/ml。(5) 吸取100 μl細胞懸液至一新管中，加入5 μl Annexin V-FITC和5～10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min。(6)流式細胞儀檢測。染色孵育后，每管加入400 μl的 1×Binding buffer工作液，混勻后使用流式細胞儀檢測(1 h內檢測)。

6. 填加孟魯司特后淋巴細胞凋亡率的對比觀察：取對照組和哮喘組的細胞培養液各分成兩個亞組，一亞組在細胞培養液加入孟魯司特；另一亞組不加。37℃、5% CO2環境下培養20 h后進行淋巴細胞凋亡觀察。

結果

1. LTB4受體表達而Cys-LTs受體被阻斷后對哮喘氣道BALF細胞學的影響:哮喘組及孟魯司特組，BALF中白細胞總數均明顯高于對照組，其中哮喘組嗜酸粒細胞及淋巴細胞總數均明顯高于孟魯司特組。見表1。

2. LTB4受體表達，而Cys-LTs受體被阻滯后，對哮喘大鼠肺病理組織的影響:由圖1可看出，對照組肺外觀粉紅，未見有異常充血表現；而另外兩組，肺外觀暗紅，有充血、出血點表現。HE染色可見，哮喘組的肺病理切片顯示，支氣管黏膜下及肺泡間隔有大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸粒細胞(EOS)、淋巴、單核細胞浸潤為主，支氣管上皮腫脹部分黏膜脫落，支氣管平滑機增厚。孟魯司特組EOS、淋巴、單核細胞浸潤比哮喘組明顯減少，但仍可見中性粒細胞大量浸潤，支氣管上皮腫脹，痰栓及大量分泌物，氣道破壞腫脹改變。

3. 淋巴細胞凋亡的觀察:將對照組、哮喘組，留取BALF細胞培養液，每組均分兩份(即2個亞組)。一個亞組加孟魯司特，另一亞組不加孟魯司特。培養20 h后，觀察淋巴細胞的凋亡情況。結果顯示，加入孟魯司特后，哮喘組淋巴細胞凋亡率增高明顯 (P<0.01)，而對照組加藥前后淋巴細胞凋亡率變化不明顯。見表2。

討論

早在二十世紀三十年代發現的過敏性慢反應物質，現已被確認為是一種重要的脂質前炎癥介質。它是一種二十碳不飽和脂肪酸。由于其最初來源于白細胞，并且碳鏈中含有三個不飽和雙鍵，故稱為LTs。它在哮喘發作中起重要的作用，引起平滑肌痙攣，產生哮喘，是組胺的1 000倍。它主要分為兩類，一類是具有強烈的化學趨化活性的LTB4，一類為Cys-LTs[5-6]。作用于受體后LTB4主要對中性粒細胞具有較強趨化功能，而Cys-LTs主要對嗜酸性粒細胞淋巴細胞有強趨化作用。目前，在支氣管哮喘中，LTs的作用逐漸被認識，LTs受體阻斷劑在臨床的使用越來越廣泛，其中Cys-LTs受體拮抗劑孟魯司特在臨床中廣泛應用，并取得了肯定的效果[7-10]。Cys-LTs受體阻滯劑在預防支氣管哮喘中，有以下幾方面作用：(1)抑制炎癥細胞的聚集和增殖，同時也誘導炎癥細胞凋亡，作用于嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞；(2)對細胞因子及炎癥介質釋放的影響，降低氣道高反應性。另有報道，LTB4受體阻滯劑，可以抑制中性粒細胞聚集，降低毛細血管通透性和減少腺體黏液分泌，另外有抑制氣道重塑，抗肺纖維化作用。但在臨床中，孟魯司特單以Cys-LTs受體拮抗劑為主，不能使中性粒細胞產生的炎癥反應得以很好的控制，造成哮喘的恢復期時間長及炎癥滲出消退的時間緩慢。目前LTB4受體阻滯劑還未應用到臨床，其作用國內少有報道。

本實驗結果顯示，孟魯司特組哮喘大鼠嗜酸粒細胞及淋巴細胞總數比哮喘組明顯減少，而中性粒細胞總數無減少，這與Lee等[11-12]和Tenero等[13]研究報告相一致。與對照組相比，中性粒細胞總數確有顯著的增加。從病理結果來看，孟魯司特組淋巴細胞浸潤明顯比哮喘組細胞減少，但氣道內滲出物，痰栓卻無明顯變化，氣道黏膜仍有腫脹，破壞的表現。因此，單純的應用孟魯司特后氣管炎癥的損壞不能很快消除，中性粒細胞浸潤，不能完好的得到控制，所以有氣管痰栓、分泌物存留，甚至出現黏膜腫脹斷裂。這與拮抗Cys-LTs受體后，LTB4受體繼續表達有密切相關。哮喘組和對照組兩組大鼠BALF淋巴細胞培養20 h觀察淋巴細胞的凋亡情況，結果顯示，加入孟魯司特后，哮喘組淋巴細胞凋亡率增高明顯 (P<0.01) ，而對照組是否加藥淋巴細胞凋亡率無明顯差別。提示孟魯司特對BALF淋巴細胞的凋亡起促進作用[14-15]。從結果分析來看，Cys-LTs受體拮抗劑孟魯司特對大鼠哮喘模型活化淋巴細胞產生有效的抑制，加快淋巴細胞的凋亡，降低了炎癥反應，也會縮短氣道高反應的持續時間。

表1 三組大鼠BALF中白細胞計數

注：與對照組比較，*P<0.05；與孟魯司特組比較，▲P<0.05

表2 兩組大鼠細胞BALF培養液加與不加孟魯司特淋巴細胞凋亡率的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

本實驗顯示Cys-LTs被阻斷后，嗜酸粒細胞和淋巴細胞、浸潤明顯減少，提示Cys-LTs受體拮抗劑可以減少哮喘中重要介質的浸潤，在哮喘中起到明顯的控制作用。然而怎樣迅速減輕氣道炎癥的破壞，哮喘發作后減輕氣管炎癥的刺激，迅速恢復炎癥的改變，也是控制哮喘反復發作關鍵。LTB4受體拮抗劑是否會抑制中性粒細胞浸潤，防止氣管黏膜損壞，是將來研究的重要方向。Cys-LTs受體與LTB4受體拮抗劑的聯合應用，效果可能會更好。這都有待于今后進一步的研究解決。

圖1 哮喘大鼠肺病理組織HE染色