花鈴期棉花黃萎病抗病與感病品種對土壤細菌群落結構的影響

趙衛松，郭慶港，李社增，王培培，鹿秀云，蘇振賀，張曉云，馬平

（河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000）

0 引言

【研究意義】棉花黃萎病（cotton verticillium wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性維管束病害，一般造成棉花減產5%—10%，嚴重的高達20%—30%，甚至絕收[1]。該病在我國主要產棉區均有不同程度的發生，是導致棉花減產和纖維品質下降的主要土傳病害[2-3]。利用抗病品種是防治黃萎病的有效途徑之一。土壤微生物之間具有群體動態效應和復雜的群落結構，與植物的生長發育和抗病性之間存在著十分密切的關系，同時研究表明作物土傳病害的發生與土壤微生物群落結構密切相關[4-5]。通過研究不同抗病性品種土壤微生物多樣性，揭示棉花品種抗病性與土壤微生物的相互關系，可為棉花黃萎病的生物防治和生態防治提供理論依據，同時對指導其他土傳病害的防治也具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關棉花對黃萎病抗病的研究主要集中在組織結構[6]、生理生化（毒素、可溶性糖、酶、激素）[7]、抗病基因[8]等方面，而關于土壤微生物在抗黃萎病中的作用研究相對較少。微生物群落結構多樣性是維持土壤生態系統穩定和可持續的重要保障，是影響土壤微生態環境中生理活性最重要的因子[9-10]。研究表明，植物病害的發生與植物內生菌的群落結構密切相關，且植物不同生育時期的根際微生物群落結構存在差異并與品種抗病性存在十分密切的關系[11-13]。同時發現，棉花抗/感品種產生的根系分泌物種類及濃度存在差異，導致根際微生物種類和數量不同[14]。進一步研究表明，根系分泌物并不局限于對根際微生物的影響，可能對整個農田生態系統中土壤微生物環境造成影響[15-17]。土壤養分也顯著影響土壤微生物的群落結構[18]。【本研究切入點】鄂荊1號和冀863品種對黃萎病具有不同的抗性，這種抗性除了自身抗病基因外，是否與抗/感品種外界環境土壤微生物有關，以及抗/感品種間土壤微生物是否存在多樣性和種群結構的差異，目前尚未見報道。在國家實施“化肥、農藥雙減”的背景下，針對目前棉花黃萎病防治困難以及關于棉花抗/感品種在發病時期（主要為花鈴期）不同階段土壤細菌群落結構的組成變化及其與黃萎病的相互關系尚缺乏系統的研究。【擬解決的關鍵問題】以棉花抗/感黃萎病品種為研究材料，通過高通量測序（Illumina MiSeq）技術研究抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤細菌群落組成變化，分析細菌群落組成與土壤理化性質之間的關系，探討細菌群落組成和品種抗病性的關系，以期為棉花黃萎病的綠色防控提供新途徑和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗區域概況

河北省曲周縣位于冀南平原，是我國五大商品棉主要生產基地，年平均氣溫13.1℃，無霜期平均為210 d，平均降水量為556.2 mm，70%的降水集中在6—9月。棉花是當地主要的種植作物[19]。試驗在曲周縣槐橋鄉西漳頭村銀絮專業合作社開展。

1.2 試驗材料

供試棉花品種鄂荊1號（感黃萎病品種，EJ）和冀863（抗黃萎病品種，J863）均為晚熟品種，分別由河北省農林科學院植物保護研究所和曲周縣銀絮專業合作社提供。

1.3 試驗設計與土壤樣品采集

2018年4月20日播種棉花，每個處理3次重復，每小區面積為45 m2（長60 m，寬0.75 m），行距0.75 m，株距0.35 m，為了避免土壤環境因素導致的誤差，不同品種種植采用小區間隔排列。在棉花生長期間，按照當地生產技術進行肥水和蟲草害管理。分別在盛花期（7月19日）、開花后期（8月22日）和結鈴期（9月3日），按照“W”形采用多點取樣法，用取土器在棉花行間距離棉花根部10 cm采集0—20 cm耕作層的土壤，每小區采集約500 g土壤混勻裝于自封袋中，一部分于-80℃冰箱保存，用于后續土壤微生物群落分析，一部分用于土壤理化性質分析。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 黃萎病調查 在黃萎病發生時期（黃河流域主要從7月中旬至9月上旬），按照李社增等[20]分級標準于盛花期、開花后期和結鈴期分別調查不同品種的發病率和病情指數，分別用EJ-7、EJ-8、EJ-9和J863-7、J863-8、J863-9表示，并按照如下公式計算發病率和病情指數。病情調查標準如下，0級：棉株健康，無病葉，生長正常；1級：棉株1/4以下葉片發病，變黃萎蔫；2級：棉株1/4以上，1/2以下葉片發病，變黃萎蔫；3級：棉株1/2以上，3/4以下葉片發病，變黃萎蔫；4級：棉株3/4以上葉片發病，或葉片全部脫落，棉株枯死。

發病率（%）=（發病株數/調查總株數）×100；

病情指數（DI）=∑（相應病級×各級病株數）/（最高病級×總株數）×100。

1.4.2 土壤細菌群落高通量測序 土壤基因組DNA的提取按照FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒說明書進行，DNA的純度和濃度由NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）進行檢測。細菌16S rDNA的V3-V4區采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[21]進 行 擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對其目標片段進行切膠回收。文庫構建和高通量測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4.3 土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數量的測定在盛花期、開花后期和結鈴期，按照1.3方法采集耕作層土壤，提取DNA，將其作為模板進行實時熒光定量PCR反應，反應體系：2×Master Mix（德國DBI Bioscience公司）10 μL，大麗輪枝菌ITS上下游引物[22]（F：CCCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG；R：CGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC）各1 μL，DNA 1 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O補至20 μL。擴增程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，擴增40個循環。每個樣品重復3次，得到不同時間樣本的循環閾值（Ct），根據趙衛松等[23]前期建立的標準曲線計算土壤中大麗輪枝菌ITS基因的拷貝數量。

1.4.4 土壤理化性質測定 采用酸度計對土壤pH進行測定[24]；采用KCl浸提-靛酚藍比色法分別對銨態氮和硝態氮進行測定[24-25]；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法對速效磷進行測定[24]；以硫酸亞鐵為標準溶液采用分光光度法按照土壤有機質含量測定說明書步驟進行測定[24]。

1.5 數據分析

數據采用Microsoft Excel 2010進行整理，Origin 8.6進行作圖，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本T檢驗和鄧肯新復極差法（DMRT）多重比較統計分析。采用Canoco 4.5軟件對樣本微生物群落進行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA），并利用CanoDraw軟件進行作圖。

2 結果

2.1 花鈴期不同階段土壤理化性質測定

棉花抗/感品種在花鈴期不同階段對土壤理化性質存在不同程度的影響。除了土壤中無機磷含量外，感病品種EJ土壤的銨態氮、硝態氮、pH、速效磷和有機質在盛花期均高于抗病品種J863。由盛花期至結鈴期，銨態氮和速效磷含量呈現先顯著下降后上升的趨勢，硝態氮和有機質含量呈現顯著下降的趨勢，pH在感病品種中變化幅度較大且存在差異，而在抗病品種中差異不顯著，無機磷含量均呈現先顯著上升后下降的趨勢。其中，硝態氮和無機磷含量下降幅度較大，在感病品種EJ和抗病品種J863土壤中硝態氮含量分別由66.28、45.77 mg·kg-1降至2.70、7.31 mg·kg-1，無機磷含量分別由252.37、277.60 μg·g-1降至89.69、100.95 μg·g-1（表1）。

2.2 棉花抗/感品種黃萎病發生調查

在棉花盛花期、開花后期和結鈴期調查抗/感品種黃萎病的發病率和病情指數，由圖1可知，感病品種EJ發病率在不同時期均顯著高于抗病品種J863；而病情指數僅在開花后期和結鈴期顯著高于抗病品種J863。

2.3 棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌的數量

由圖2可見，感病品種EJ在開花后期和結鈴期土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數量顯著高于盛花期，分別提高了8.19%和8.38%；對于抗病品種J863，在開花后期和結鈴期土壤中病原菌ITS拷貝數量顯著低于盛花期，且分別降低了6.03%和8.86%；除了在盛花期外，抗病品種土壤中的大麗輪枝菌ITS拷貝數均低于感病品種。

2.4 土壤細菌多樣性分析

F檢驗結果表明（表2），EJ和J863在盛花期和開花后期土壤細菌的Chao1指數和ACE指數顯著高于結鈴期，而Shannon和Simpson指數在花鈴期不同階段差異不顯著；J863在盛花期和結鈴期的細菌豐富度Chao1和ACE指數均高于EJ，而均勻度Shannon和Simpson指數在花鈴期不同階段差異不顯著。

表1 土壤理化性質測定Table 1 Detection of soil physicochemical properties

圖1 棉花抗/感品種的黃萎病發生調查Fig.1 Investigation of verticillium wilt in cotton resistant/susceptible varieties

表2 棉花抗/感品種在花鈴期不同階段的細菌測序量和群落多樣性Table 2 Bacterial sequencing and community diversity of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

圖2 花鈴期不同階段棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數量Fig.2 ITS gene copy number of V.dahliae in soil of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

2.5 棉花抗/感品種細菌群落結構比較

抗/感品種樣本的細菌群落結構主成分分析表明（圖3），所有樣品在主成分坐標中位于不同的象限，說明抗/感品種在不同時期土壤樣品的細菌群落結構存在差異。進一步分析發現，門水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的59.5%和31.0%，2個主成分方差累積貢獻率達到90.5%，說明其能夠表征微生物群落組成的特征，感病品種EJ位于第三、四象限，抗病品種J863位于第一、二象限；屬水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的60.6%和19.3%，2個主成分方差累積貢獻率達到79.9%，說明其能夠表征微生物群落組成的特征，EJ位于第二、三限，J863位于第一、四象限，同一個橢圓代表品種在不同時期的微生物群落組成，品種之間不存在交叉重疊，說明抗/感品種的細菌群落結構存在差異。

圖3 棉花抗/感品種在門（A）和屬（B）水平下土壤細菌群落結構的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of soil bacterial community structure of cotton resistant/susceptible varieties at phylum (A) and genus (B) levels

門水平下抗/感品種土壤細菌群落組成的研究結果表明（圖4），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開花后期（EJ-8/J863-8）和結鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前15個豐度較高的菌群分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Rokubacteria、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Latescibacteria、Patescibacteria、裝甲菌門（Armatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和Entotheonellaeota，其相對豐度分別介于29.97%—34.66%、14.77%—20.97%、12.17%—20.37%、10.17%—12.87%、6.97%—8.69%、2.78%—4.04%、2.28%—3.72%、1.83%—2.49%、1.14%—1.64%、0.75%—0.95%、0.38%—1.23%、0.27%—0.69%、0.09%—0.22%、0.11%—0.20%和0.07%—0.18%。其中感病品種EJ的部分菌群平均相對豐度低于抗病品種J863，如放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門、Patescibacteria和裝甲菌門，平均降低幅度分別為16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%。

差異顯著性分析表明，在結鈴期，抗病品種土壤的變形菌門菌群的相對豐度顯著下降；在盛花期和開花后期，抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結鈴期，感病品種土壤的酸桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度呈顯著下降趨勢，而抗病品種表現為顯著上升，且抗病品種顯著高于感病品種。由盛花期至結鈴期，感病品種土壤的放線菌門、綠彎菌門和Patescibacteria菌群的相對豐度分別表現為顯著上升，而抗病品種表現為顯著下降，其中在盛花期，感病品種土壤的放線菌門菌群相對豐度顯著低于抗病品種，在結鈴期品種間差異不顯著；在盛花期，感病品種土壤的綠彎菌門菌群的相對豐度顯著低于抗病品種，而在開花后期和結鈴期顯著高于抗病品種。由盛花期至結鈴期，感病品種土壤的Rokubacteria菌群的相對豐度表現為顯著下降，而抗病品種差異不顯著。在不同生育時期，擬桿菌門、浮霉菌門、硝化螺菌門、疣微菌門、厚壁菌門和Entotheonellaeota菌群的相對豐度變化抗/感品種間差異均不顯著。

屬水平下抗/感品種菌群的相對豐度研究結果表明（圖5），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開花后期（EJ-8/J863-8）和結鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前20個豐度較高的菌群分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Haliangium、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Bryobacter、Iamia、Dongia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬（Blastococcus）、Luedemannella、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、Gaiella、類諾卡氏屬（Nocardioides）、Pontibacter、Ilumatobacter、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Gemmatirosa、微單孢菌屬（Micromonospora）和Solirubrobacter，其相對豐度分別介于12.84%—26.80%、5.79%—16.78%、6.07%—10.14%、4.41%—11.38%、6.18%—9.02%、4.71%—8.30%、2.00%—6.45%、3.13%—5.16%、2.81%—4.96%、2.25%—5.51%、2.14%—3.95%、2.01%—5.08%、1.87%—5.16%、1.23%—5.97%、1.19%—4.41%、2.03%—3.67%、0.70%—3.47%、1.13%—3.04%、0.87%—3.82%和0.71%—2.32%。其中，感病品種EJ的平均相對豐度低于抗病品種J863的菌群包括鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter，與抗病品種J863相比，上述菌群平均相對豐度下降幅度分別為5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。

圖4 棉花抗/感品種在門水平下細菌群落組成相對豐度變化（前15個）Fig.4 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at phylum level (top 15)

圖5 棉花抗/感品種在屬水平下細菌群落組成相對豐度變化（前20個）Fig.5 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at genus level (top 20)

差異顯著性分析結果表明，由盛花期至結鈴期，感病品種土壤中鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度表現為顯著下降，而抗病品種表現為顯著上升；在盛花期，上述菌群的相對豐度品種間差異不顯著，而在其他時期抗病品種顯著高于感病品種。感病品種土壤的溶桿菌屬菌群相對豐度呈顯著下降趨勢，而抗病品種呈現先顯著上升后下降的趨勢；在盛花期，感病品種該菌群的相對豐度高于抗病品種，在其他生育時期內抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結鈴期，感病品種Haliangium菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而在抗病品種呈顯著下降趨勢；在結鈴期，感病品種該菌群的相對豐度高于抗病品種，其他時期品種間差異不顯著。在生育期內抗/感品種硝化螺菌屬的相對豐度呈上升趨勢但差異不顯著。在結鈴期，抗病品種土壤Bryobacter和Iamia菌群的相對豐度顯著高于感病品種，其他時期品種間差異不顯著。在結鈴期，感病品種Dongia和Ilumatobacter菌群的相對豐度顯著高于抗病品種，其他時期品種間差異不顯著。在生育期內，Pseudarthrobacter和Luedemannella的相對豐度在品種間差異不顯著。在盛花期，抗病品種土壤的芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度均顯著高于感病品種，其他時期品種間差異不顯著。在結鈴期，紅色桿菌屬的相對豐度品種間差異不顯著，其他時期該菌群抗性品種顯著高于感病品種。在生育期內，感病品種土壤Gaiella菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而抗病品種差異不顯著，且感病品種高于抗病品種。在結鈴期，感病品種土壤類諾卡氏屬菌群的相對豐度顯著低于抗病品種，其他時期差異不顯著。在開花后期，鏈霉菌屬的相對豐度品種間差異不顯著；在盛花期和結鈴期，抗病品種的相對豐度顯著高于感病品種。在生育期內，抗病品種土壤Gemmatirosa菌群的相對豐度高于感病品種，且在抗病品種中呈顯著上升趨勢。

2.6 細菌屬水平群落組成與土壤理化性質的冗余分析（RDA）

屬水平土壤中優勢細菌群落與土壤理化性質的相關性分析表明（圖 6），優勢細菌群落對土壤理化性質的響應不同。其中，相對豐度較高的鞘氨醇單胞菌屬和溶桿菌屬與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈正相關，Bryobacter與無機磷、pH和有機質呈負相關，芽單胞菌屬與無機磷、pH和有機質相關性不大，Haliangium和硝化螺菌屬與銨態氮、速效磷呈正相關，硝化螺菌屬與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈負相關。

進一步研究表明，抗/感品種在花鈴期不同階段的細菌群落組成與土壤理化性質之間存在相關性。其中，感病品種EJ在盛花期（EJ-7）和開花后期（EJ-8）的細菌群落組成與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈正相關，結鈴期（EJ-9）與速效磷、銨態氮呈正相關；抗病品種J863在盛花期（J863-7）的細菌群落組成與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈負相關，在開花后期（J863-8）的細菌群落組成與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈正相關，在結鈴期（J863-9）的細菌群落組成與上述土壤理化指標之間相關性不大。

3 討論

3.1 不同抗性品種對土壤微生物群落的影響

雷娟利等[26]研究表明，抗枯萎病西瓜品種根際土壤細菌的均勻度和多樣性均高于感病品種，并且抗病品種的細菌數量高于感病品種，而真菌和放線菌數量在抗/感品種間不存在相關性；蔡秋華等[27]通過比較烤煙抗/感青枯病和黑脛病品種的根際土壤微生物變化，發現抗病品種與根際土壤細菌和放線菌呈正相關，而與真菌呈負相關；李洪連等[28]通過平板涂布法比較了棉花黃萎病不同抗/感品種與根際土壤微生物的關系，結果表明抗病品種的真菌種數多于感病品種，并且前者區系組成更為復雜，抗性品種與真菌數量呈正相關，而與細菌數量無顯著相關性。

圖6 土壤理化性質與細菌屬水平群落組成的冗余分析Fig.6 RDA analysis of soil physicochemical properties and bacterial communities at genus level

本研究結果表明，棉花黃萎病抗/感品種之間的土壤細菌群落多樣性、結構和組成方面存在差異。群落組成方面，在門水平上，抗病品種的放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門、Patescibacteria和裝甲菌門菌群的相對豐度高于感病品種；在屬水平上，抗病品種的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度高于感病品種，進一步驗證了前人的研究觀點，即抗病品種的土壤微生物群落結構優于感病品種[26,29]，而與李洪連等[28]通過選擇性平板法表明抗病性不同的棉花品種與根際細菌數量無明顯相關性的結論存在區別，本研究認為對微生物群落的研究方法存在區別可能是導致研究結果不同的主要原因之一。此外，抗/感品種的植物根系分泌物種類和含量不同[14]，且根系分泌物能夠影響土壤微生物群落結構[13,30-31]，推測根系分泌物是造成抗/感品種根際土壤微生物群落差異的原因之一。關于作物根系分泌物中的哪些物質通過何種代謝途徑對微生物造成影響，有待于進一步研究。

3.2 作物生育時期對土壤微生物群落的影響

已有研究表明，土壤微生物群落結構受作物生育時期的影響較為明顯[29-30]。BREIDENBACH等[29]比較了水稻不同生育時期對根際土壤和非根際土壤微生物群落組成的影響，發現在水稻生長早期草螺菌屬（Herbaspirillum）菌群的相對豐度較高，且根際土壤高于非根際土壤；INCEOGLU等[30]研究發現，馬鈴薯不同品種根際土壤微生物受作物生育時期的影響，其中幼苗期和開花期的根際土壤細菌群落結構顯著不同于衰老期；CHAPARRO等[13]比較了擬南芥苗期、抽薹期和開花期根際土壤細菌群落結構，結果表明幼苗期的土壤微生物群落明顯不同于其他時期，并且指出植物在不同的生育時期能夠招募特定的微生物種類；李洪連等[28]研究表明，抗/感黃萎病棉花品種在根際微生物區系組成的差異在苗期和現蕾期比較明顯，而在花鈴期差異則顯著降低，說明根際微生物對棉花抗病性的影響在生長前期較大，生長后期則較小；胡元森等[32]對黃瓜不同生育時期根際土壤微生物的研究發現，根際微生物主要類群的數量與其生長發育呈正相關，且根際微生物數量在花期或盛果期時達到最高峰，之后呈下降趨勢。

本研究結果表明，在盛花期、開花后期和結鈴期抗/感品種之間的土壤細菌群落多樣性差異性存在區別。對于抗病品種而言，由盛花期至結鈴期，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Pontibacter和Gemmatirosa菌群的相對豐度呈上升趨勢；溶桿菌屬菌群的相對豐度呈先上升后下降趨勢，Haliangium菌群的相對豐度呈下降趨勢。而對于感病品種而言，鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度呈下降趨勢，Haliangium和Gaiella菌群的相對豐度均呈上升趨勢。此外，由盛花期至結鈴期，Pseudarthrobacter、硝化螺菌屬和Luedemannella菌群的相對豐度在品種間差異不顯著。在結鈴期，Bryobacter、Iamia、Dongia、Ilumatobacter和類諾卡氏屬菌群的相對豐度存在差異，而在盛花期和開花后期差異不顯著。在盛花期，芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度存在差異，其他時期品種間差異不顯著。在結鈴期，紅色桿菌屬菌群的相對豐度品種間差異不顯著，其他時期差異顯著；在盛花期和結鈴期，鏈霉菌屬菌群的相對豐度在品種間存在顯著差異。抗/感品種由盛花期至結鈴期的病情指數呈逐步上升趨勢，本研究僅從對土壤細菌的群落組成變化進行了研究，而抗/感品種受黃萎病菌侵染后根際微生物和植物內生菌的組成及變化情況有待于進一步探究。

3.3 病原菌數量與作物品種抗病性的關系

許多學者從土壤和植株組織中的病原菌數量與作物品種抗病性的關系角度開展研究[33-35]。劉瓊光等[33]研究表明，根際土壤中青枯菌數量與番茄品種抗性之間相關性不高，而植物根內青枯菌數量與番茄品種抗性密切相關；王卉等[34]研究發現，青枯菌數量在番茄抗/感品種之間存在明顯差異，而病原菌數量在不同品種根部的吸附差異不顯著；吳傳德等[35]研究表明，棉花枯萎病抗病品種根際土壤中病原菌數量明顯少于感病品種。本研究結果表明，土壤中大麗輪枝菌的數量與黃萎病發生的相關性存在差異，其中土壤中病原菌數量與感病品種鄂荊1號的發病率和病情指數呈正相關，而與抗病品種冀863相關性不強。開花后期和結鈴期抗病品種冀863土壤中的病原菌ITS拷貝數低于感病品種鄂荊1號。

3.4 土壤理化性質與微生物群落的關系

土壤養分、pH、有機質等土壤理化性質是影響土壤微生物群落結構的重要因素[36-37]。ZHOU等[38]研究表明，連續多年施氮顯著影響了土壤細菌和真菌的群落結構變化，該團隊進一步研究發現土壤pH、有機碳和硝態氮含量是導致東北黑土中氨氧化古菌群落差異的主要因素[39]，SUN等[40]施氮后獲得了相似的研究結果。

菌群屬水平的研究結果表明，抗病品種許多優勢菌群的相對豐度高于感病品種，并且在特定時期微生物菌群的相對豐度在抗/感品種間存在顯著差異，如在開花后期和結鈴期，抗病品種土壤的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而感病品種反呈下降趨勢，且抗病品種高于感病品種。鞘氨醇單胞菌屬菌群與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈正相關，而與銨態氮和速效磷呈負相關。芽單胞菌屬和Gemmatirosa菌群與硝態氮呈正相關，而與其他理化性質呈負相關。此外，盡管溶桿菌屬菌群與硝態氮、無機磷、pH和有機質呈正相關，但抗/感品種間的相對豐度差異不顯著。類諾卡氏屬菌群與速效磷呈負相關，而紅色桿菌屬和鏈霉菌屬菌群與速效磷呈正相關；芽球菌屬菌群與土壤理化性質不具有相關性；微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群與銨態氮和速效磷呈負相關。

綜合分析抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤微生物群落組成與土壤理化性質之間的關系，可為合理施肥提高不同生育時期土壤優勢菌群的相對豐度，進而提高植物的抗病性提供科學依據。因此，通過施用不同類型的氮肥（銨態氮型和硝態氮型）來改善土壤特定優勢菌群的相對豐度是今后研究的內容之一。此外，土壤溫度和濕度亦是重要的環境因子[41-42]，其如何對土壤中微生物群落和病原菌數量產生影響亦有待于進一步研究。

4 結論

土壤中大麗輪枝菌的數量與棉花抗/感品種黃萎病發生的相關性存在差異，其中土壤中病原菌數量與感病品種鄂荊1號的發病率和病情指數呈正相關，而與抗病品種冀863相關性不強。抗病品種在盛花期、開花后期和結鈴期土壤的細菌群落結構優于感病品種，并且生育時期的優勢菌群存在不同程度的差異。土壤中細菌的多樣性、相對豐度和組成受有機質、pH、氮素類型、速效磷等指標影響。同時，棉花不同生育時期對土壤中細菌群落結構存在明顯影響。