通絡(luò)生骨膠囊對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用及其分子機制研究

李譯，林惠湦，陳妮，劉禮飛

(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺州 318000)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是由于外界的多種因素(如肥胖、機械損傷、炎癥等)引起的關(guān)節(jié)軟骨纖維化，軟骨層脫失以及軟骨下骨增生形成骨贅，以關(guān)節(jié)疼痛、行動受限為主要臨床癥狀的一種退行性疾病[1]。對于OA具體發(fā)病機制的研究目前還尚不明確，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的活率、炎癥的嚴重程度以及軟骨細胞的抗損傷能力均與疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。通過促進軟骨細胞的增殖，降低炎癥因子的表達，抑制過度炎癥對軟骨細胞損傷作用開發(fā)的藥物，均在臨床上取得了一定的治療效果[2]。通絡(luò)生骨膠囊是目前市場上用于治療股骨頭壞死的中藥單方，其主要成分是木豆葉水提物，前期的研究中發(fā)現(xiàn)通絡(luò)生骨膠囊具有活血健骨、解毒消腫、化瘀止痛，降低氧化損傷的作用[3]。袁捷等[4]研究發(fā)現(xiàn),木豆葉可降低木瓜蛋白酶誘導的兔骨關(guān)節(jié)炎癥狀，其含藥血清可以促進軟骨細胞增殖和細胞內(nèi)蛋白合成，提示其或可作為治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥進行開發(fā)。本實驗觀察通絡(luò)生骨膠囊對碘乙酸誘導的SD大鼠的骨關(guān)節(jié)炎模型進行干預，探討其對炎癥因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達影響。進一步通過通絡(luò)生骨膠囊干預IL-1β誘導的體外軟骨損傷模型，觀察干預后對Wnt/β-catenin和Nrf2/HO-1信號通路的影響，從中探討通絡(luò)生骨膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的作用和分子機制。

1 材料和方法

1.1 動物與材料

清潔級6～8周齡SD大鼠，由北京維通利華提供,許可證號：SCXK(浙)2018-0001，動物質(zhì)量合格證編號：11400700369590。動物飼養(yǎng)于聚丙烯塑料盒內(nèi)，每籠不多于5只，動物房空氣流通良好并有環(huán)境監(jiān)控裝置，溫度20 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%。日光燈照明，12 h明暗交替。籠具大小和動物管理符合浙江省實驗動物使用和管理指導原則。

SW1353細胞(ATCC)；通絡(luò)生骨膠囊(原料藥由海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號為J31709061)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、HEPES、0.25% Trypsin-EDTA(美國Gibco公司)；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；SuperReal PreMix Color (SYBR Green)[天根生化科技(北京)有限公司];IL-1β(R&D Systems)；細胞活性檢測試劑盒(美國普洛麥格公司)；Trizol(賽默飛世爾)；c-Fos、MMP-13、β-catenin(CST)；Tubulin(Sigma)。

1.2 引物序列

大鼠MMP-13上游引物：TGAC TATG CGTG GCTG GAA,下游引物：AAGC TGAA ATCT TGCC TTGG A。人Wnt4a上游引物：GCTC TGAC AACA TCGC CTAC,下游引物：TCGC CAGC ACGT CTTT AC。人β-catenin上游引物：AGC TCC CTC GCG GTT CAT,下游引物：GGG CGG CAC CTT CCT ACT TC。人GSK-3β上游引物：CCGA CTAA CACC ACTG GAAG CT,下游引物：AGGA TGGT AGCC AGAG GTGG AT。人 MMP-13上游引物：GCCT GCAC CACG GACG GTCG CTCC,下游引物：GAGG TGCC GGAT GCCA TTCA CGTC。人 ADAMTS4上游引物：ATGG CTAT GGGC ACTG TCTC,下游引物：GTGT TTGG TCTG GCAC ATGG。人 Nrf2上游引物：TCCA GTCA GAAA CCAG TGGA T,下游引物：GAAT GTCT GCGC CAAA AGCT G。人GCLC上游引物：ATGG AGGT GCAA TTAA CAGA C,下游引物：CTGC ATTG CCAC CTTT GCA。人NQO-1上游引物：CCTA GTTC GTCA TGGG TGTG AACC A,下游引物：GCCA GTAG AGGC AGGG ATGA TGTT C。大鼠β-actin上游引物：CCCA TCTA TGAG GGTT ACGC,下游引物：TTTA ATGT CACG CACG ATTT C。人GAPDH上游引物：ATGG CCTT CCGT GTTC CTAC C,下游引物：GCCC AAGA TGCC CTTC AGTG。

1.3 OA模型構(gòu)建與檢測

大鼠稱重，根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.33 mL/100 g)，仰臥位固定后，剪去右側(cè)膝關(guān)節(jié)處毛發(fā)，碘伏消毒，采用1 mL注射器對OA組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)注射MIA生理鹽水溶液(每只大鼠注射40 μL，含MIA 3 mg,過濾除菌)，對照組注射生理鹽水，注射處棉棒按壓數(shù)分鐘，防止藥液溢出。造模3 d后開始給藥,每日1次，分為對照組、模型組和不同濃度的通絡(luò)生骨溶液組(0.5、1和2 g/kg)。給藥3周后大鼠麻醉，眼眶靜脈叢采血；安樂死后，打開大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)，收取軟骨，液氮凍存。檢測血漿中IL-1β的含量，膝關(guān)節(jié)軟骨細胞中的MMP-13的mRNA表達水平以及c-Fos的蛋白表達水平。

1.4 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊對SW1353細胞活性的影響

取增殖良好的SW1353細胞以1 500個/孔的密度分別接種至96孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h。空白組及對照組加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥組分別加入濃度為1、5、10、50、100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液(10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基配制，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌)。每個濃度設(shè)置6個復孔，振蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，除空白組和對照組加入10 μL RPMI 1640培養(yǎng)基外，模型組及給藥組加入含200 ng/mL IL-1β的1640培養(yǎng)基10 μL，振蕩混勻后，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)8 h。每孔加入發(fā)光細胞活力檢測試劑100 μL，放置于恒溫振蕩器中室溫振蕩15 min，在酶標儀500 nm處檢測。實驗重復3次，取平均值。

細胞增殖率=(觀察組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.5 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊保護SW1353細胞的分子機制

取增殖良好的SW1353細胞以2×105個/孔的密度接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2、100%相對濕度細胞培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h。空白組、對照組及模型組孔加入10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，給藥組加入含10、50、100 μg/mL的通絡(luò)生骨膠囊溶液，振蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，模型組及給藥組加入含 IL-1β溶液使其終濃度為20 ng/mL ，振蕩混勻，37 ℃孵箱培養(yǎng)8 h后，孔板底部細胞加Trizol裂解后提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，利用熒光定量檢測試劑盒進行RT-PCR實驗，檢測細胞Wnt4a、β-catenin、GSK-3β、MMP-13、ADAMTS4、 Nrf2、GCLC和NQO-1的 mRNA表達水平。用Western-Blot的方法檢測β-catenin和MMP-13的蛋白表達水平。熒光定量PCR檢測按照熒光定量試劑盒說明書操作，Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀檢測，結(jié)果以相對表達定量(relative quantity，RQ)表示。

RQ=2-ΔΔCt

ΔΔCt=待測標本的ΔCt-對照標本ΔCt

ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)對照Ct值

Western-Blot方法：細胞培養(yǎng)結(jié)束后胰酶消化收集細胞，NP40裂解液裂解，等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，低溫轉(zhuǎn)印至PVDF膜，牛奶封閉1 h，再與相應(yīng)的一抗、二抗雜交各1 h，用凝膠成像系統(tǒng)對圖像進行拍照和分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)進行Dunnett’s test檢驗。P≤0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 通絡(luò)生骨膠囊對SD大鼠OA模型的治療作用

通絡(luò)生骨膠囊給藥21 d后，大體解剖觀察關(guān)節(jié)腔發(fā)現(xiàn)：對照組中關(guān)節(jié)腔未見明顯積液，滑膜未見充血、腫脹，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，色澤明亮；模型組中關(guān)節(jié)腔積液明顯增多、滑膜增生、充血、腫脹，軟骨表面粗糙，色澤灰暗，表面出現(xiàn)裂隙深達軟骨中層，部分樣本軟骨缺損；通絡(luò)生骨中、低劑量組：關(guān)節(jié)腔積液較模型組減少，滑膜中度增生，軟骨表面粗糙，色澤灰暗，表面出現(xiàn)裂隙深達軟骨中層，未見軟骨缺損；通絡(luò)生骨高劑量組：關(guān)節(jié)腔積液減少，滑膜輕度增生，軟骨表面粗糙，軟骨表面出現(xiàn)小裂隙，未見軟骨缺損。

給藥21 d后，不同劑量的通絡(luò)生骨膠囊(0.5、1、2 g/kg)均能有效抑制血漿中碘乙酸誘導的IL-1β的分泌、降低軟骨組織中MMP-13 mRNA的表達水平以及c-Fos的蛋白表達水平，呈顯著的劑量依賴性，結(jié)果見圖1。

2.2 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊對SW1353細胞的保護作用及對Wnt/β-catenin信號通路的影響

在SW1353細胞中，與對照組相比，20 ng/mL IL-1β可一定程度上損傷細胞，細胞活率為78%。與模型組相比，10、50、100 μg/mL通絡(luò)生骨膠囊組細胞活率顯著性增加，結(jié)果見圖2A，提示通絡(luò)生骨膠囊顯著性降低 IL-1β對軟骨細胞的損傷作用。進一步檢測IL-1β誘導的Wnt/β-catenin信號通路發(fā)現(xiàn)：通絡(luò)生骨膠囊顯著性的抑制IL-1β激活的Wnt4a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表達水平，結(jié)果見圖2。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01圖1 通絡(luò)生骨膠囊對碘乙酸誘導的骨關(guān)節(jié)炎的治療作用

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01圖2 通絡(luò)生骨膠囊對對Wnt/β-catenin信號通路的影響

2.3 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊對金屬蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的影響

在SW1353細胞中，與對照組相比，20 ng/mL IL-1β極顯著的誘導金屬蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的表達。與模型組相比，不同劑量(10、50、100 μg/mL)的通絡(luò)生骨膠囊顯著性的抑制IL-1β激活的MMP-13、ADAMTS4的mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果見圖3。

2.4 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊對抗氧化信號通路Nrf2/NQO1的影響

在SW1353細胞中，與對照組相比，20 ng/mL IL-1β顯著的抑制抗氧化損傷信號通路激活。與模型組相比，(10、50、100 μg/mL)不同劑量的通絡(luò)生骨膠囊顯著性的激活I(lǐng)L-1β抑制得的Nrf2、GCLC和NQO1的mRNA表達，結(jié)果見圖4。

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01圖3 通絡(luò)生骨膠囊對金屬蛋白酶MMP-13、ADAMTS4的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01圖4 IL-1β模型中通絡(luò)生骨膠囊對抗氧化信號通路Nrf2/NQO1的影響

3 討論

軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞類型，是軟骨內(nèi)骨化的骨骼發(fā)育、關(guān)節(jié)軟骨保護和關(guān)節(jié)運動功能維持的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)表明，軟骨細胞受到過度自由基和炎癥因子的損傷發(fā)生調(diào)亡與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。炎癥因子中IL-1β是誘導軟骨細胞發(fā)生損傷調(diào)亡的一大重要誘因，IL-1β可以通過抑制軟骨細胞增殖、改變軟骨細胞的正常功能，刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶(MMPs)使軟骨基質(zhì)發(fā)生異常降解最終導致骨關(guān)節(jié)炎的形成。通過抑制IL-1β生成，從而降低其誘導的下游生物學反應(yīng)可以有效緩解軟骨的破壞，延緩OA的發(fā)展進程，減少患者的痛苦[8]。

碘乙酸注射SD大鼠膝關(guān)節(jié)腔誘導的骨關(guān)節(jié)炎模型是研究OA治療藥物的經(jīng)典模型，可以有效用于驗證化合物治療OA的療效和作用機制。本次研究中采用碘乙酸模型驗證通絡(luò)生骨膠囊對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。通過骨關(guān)節(jié)的大體觀察發(fā)現(xiàn),不同劑量組的通絡(luò)生骨膠囊可以有效改善碘乙酸導致的軟骨組織缺損，滑膜增生等現(xiàn)象。且與模型組相比，通絡(luò)生骨膠囊各給藥組中大鼠血液中IL-1β的含量顯著性降低，關(guān)節(jié)軟骨細胞中的MMP-13和c-Fos的含量也顯著下降，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

近年來，在骨關(guān)節(jié)炎信號通路研究中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路引起了廣泛關(guān)注[9]，成年小鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中β-catenin的條件激活會導致關(guān)節(jié)軟骨破壞，促進了終末軟骨細胞的分化[10]。Ellie BM Landman等[11]研究發(fā)現(xiàn),使用Wnt小分子抑制劑可以有效抑制IL-1β誘導的軟骨降解，IL-1β誘導軟骨細胞表達Wnt5a，Wnt7a，導致細胞外基質(zhì)中的金屬蛋白酶MMPs表達增強，使得關(guān)節(jié)軟骨降解[12],由此證實Wnt/β-catenin信號通路參與IL-1β誘導的軟骨降解過程。

Nrf2是抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過增強HO-1、GCLC、NQO-1等II相抗氧化酶的表達，拮抗OS形成，減弱OS對軟骨細胞的損傷，在骨關(guān)節(jié)炎的形成過程中發(fā)揮重要的作用[13]。Qian Tang等[14]研究發(fā)現(xiàn),IL-1β通過激活Nrf2/HO-1、GCLC的表達從而抑制NF-κB信號的活化，降低IL-1β誘導的軟骨細胞調(diào)亡。

本次研究中采用了IL-1β體外損傷模型進一步研究通絡(luò)生骨膠囊治療OA的可能分子機制。發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)生骨膠囊可以有效緩解IL-1β對軟骨細胞的損傷作用，提高軟骨細胞的活率。進一步檢測Wnt/β-catenin信號通路及其下游金屬蛋白酶的表達水平，發(fā)現(xiàn)通絡(luò)生骨膠囊顯著性抑制IL-1β誘導活化的Wn4a、β-catenin以及GSK-3βmRNA表達水平，降低MMP-13、ADAMTS4的mRNA和蛋白表達水平，從而有效緩解IL-1β導致的軟骨降解，發(fā)揮治療OA的作用。通過對IL-1β介導的下游Nrf2/HO-1信號通路的研究觀察到通絡(luò)生骨膠囊可以有效增強Nrf2、GCLC、NQO-1的mRNA表達水平，降低IL-1β誘導的細胞損傷作用。

可見，通絡(luò)生骨膠囊通過減少OA狀態(tài)下IL-1β等炎癥因子的分泌，抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化，降低下游基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13等蛋白的表達水平，從而減弱對軟骨的降解作用；同時還通過誘導Nrf2/HO-1信號通路的活化，激活下游GCLC、NQO-1等II相抗氧化酶的表達，拮抗炎癥因子以及OS等對軟骨的損傷作用，發(fā)揮治療OA的作用。