5-羥甲基糠醛及其二聚體OMBF引發Ⅰ型超敏反應毒性評價與機制初探

李恩燦，范瀟予，林 琳，郝瑞瑞，林 生，賀玖明，靳洪濤,3*

(1.中國醫學科學院，北京協和醫學院藥物研究所，新藥安全評價研究中心，北京 100050；2.中國醫學科學院，北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；3.北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司，北京 100176)

I型超敏反應又稱速發型超敏反應(immediate hypersensitivity)，主要由特異性IgE抗體介導，高親和力的IgEFc受體(FcεRI)是反應發生的重要膜分子，其中肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面含有大量的FcεRI[1]。I型超敏反應通常包含兩個階段，即致敏階段和激發階段。當抗原初次進入機體后，初次應答產生的IgE抗體與細胞膜表面FcεRI高親和力的結合，使細胞處于致敏階段。當相同的抗原再次入侵時，與細胞膜上的IgE抗體結合，致使相鄰的FcεRI發生橋連，從而觸發細胞內一系列的生物化學反應[1]。

5-羥甲基糠醛(5-HMF, C3H6O3)是由一個呋喃環組成的小分子化合物，六碳糖在高溫的條件下發生美拉德反應可生成5-HMF[2-3]。5-HMF通常被認為是高溫滅菌過程中產生的副產物[4]，存在于各種含糖類的食品和藥物制劑中。此外，5-HMF在高溫下易通過聚合反應生成其二聚體產物，即雙(5-甲?；啡?醚(OMBF)。本實驗室前期通過報告抗原腘窩淋巴結試驗 (RA-PLNA)證實，5-HMF和OMBF可誘導小鼠發生免疫反應[5]?；谙惹瓣P于5-HMF和OMBF的研究,本研究將進一步對5-HMF及OMBF的免疫毒性進行評價并初步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

無特定病原體(SPF)級的6周齡雄性Brown Norway(BN)大鼠21只，(170 ± 20)g，購自維通利華生物技術公司[SCXK(京)2016-0006]。將其隨機分為不同的給藥組及對照組。在實驗之前，使大鼠在含有玉米芯的聚碳酸酯籠中適應環境一周，并且可以自由獲取通過反滲透系統凈化的水和實驗室動物飼料，環境溫度為(23 ± 2)℃，相對濕度為(50 ± 5)%，12 h光照/黑暗循環。動物飼養于北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司動物中心[SYXK(京)2015-0021]，該設施已經通過AAALAC認證。動物處理程序經北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司實驗動物倫理委員會批準，倫理委員會批準文號：2018-002(研)。實驗期間按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.1.2 細胞系

大鼠嗜堿性白血病細胞系(RBL-2H3)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心

1.2 主要試劑與儀器

卵清白蛋白、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、5-HMF(CAS：67-47-0；純度：99%)、4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基糖苷酶、1,2-苯二甲醇(CAS：612-14-6；純度：97%)、Anti-DNP-IgE、DNP-HSA、二甲基亞砜(DMSO，細胞培養級)均購自Sigma-Aldrich公司(美國)；MEM/DMEM培養基、谷氨酰胺、非必須氨基酸、丙酮酸鈉、胰酶溶液0.25%、胎牛血清、PBS均購自Thermo Fisher 公司(美國)；甲醇、二甲苯、乙醇、鹽酸(36%～38%)、氫氧化鈉(≥99.8%)、碳酸氫鈉(≥99.8%)、碳酸鈉(≥99.8%)、檸檬酸(≥99.8%)、檸檬酸鈉(≥99.8%)均購自北京化工廠(中國)；ELISA試劑盒包括大鼠IgE、IgG、白細胞介素-4 (IL-4)、C5b-9、谷胱甘肽過氧化物酶-1(Gpx-1)等指標均購自深圳達科為有限公司(深圳)；Western blot所用抗體購自Cell Signaling Technology (美國)；PierceTMBCA蛋白檢測試劑盒等其他Western blot相關試劑均來源于Thermo Fisher公司(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

大鼠嗜堿性白血病細胞系(RBL-2H3)培養在10%胎牛血清的MEM培養基中，加入100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素。將細胞在37℃，5% CO2的條件下在培養箱中培養。

1.3.2 OMBF的制備

使用Larousse概述的程序[6]制備OMBF，純度大于98%，采用高效液相色譜法進行檢測。OMBF: m.p. 110℃～112℃;1 hNMR (500 MHz, CDCL3) δ: 9.66 (2 H, S, 2CH=O), 7.26 (2H, d,J=3.5 Hz), 6.61 (2 H, d,J=3.5 Hz), 4.65 (4 H, S, -CH2OCH2-); ESIMSm/z235 [M+H]+。OMBF的制備與鑒定由中國醫學科學院藥物研究所林生研究員課題組完成。

1.3.3 劑量選擇

根據中國藥典，5%葡萄糖注射液中5-HMF含量不應超過11.8 μg/mL[7]。根據每天最大輸注量為2000 mL，5%葡萄糖注射液中5-HMF的限量為每人每天23.6 mg。使用體表面積系數公式將人體數據轉換為大鼠，大鼠的等效劑量為2.5 mg/kg。在前期實驗的基礎上，本研究選擇5 mg/kg為低劑量，25 mg/kg為高劑量進行動物實驗。

細胞實驗根據MTT實驗結果(數據未展示)，本研究選擇0.0502 mM、0.502 mM為5-HMF的低、高劑量，表示為5-HMF-L、5-HMF-H；0.0338 mM、0.338 mM為OMBF的低、高劑量，表示為OMBF-L、OMBF-H。選擇作用時長為1 h，在該時間范圍內，細胞存活率與正常未加藥組無顯著性差異。

1.3.4 Ⅰ型超敏反應體內實驗設計

將21只SPF雄性BN大鼠隨機按體重分為7組，分別為生理鹽水對照組(NS)，佐劑對照組(Adj.)，卵清白蛋白組(Model)，5-HMF-L，5-HMF-H，OMBF-L和OMBF-H。在適應環境一周后，于第1天、第3天和第5天，給藥組每天一次尾靜脈注射藥物，使動物致敏。于第19天，腹主動脈采血，離心取血清，測定各項指標。對照組給予0.9%生理鹽水，使用弗氏完全佐劑(FCA)對給藥組BN大鼠進行第一次致敏和刺激，使用弗氏不完全佐劑(FICA)進行第二次和第三次致敏。陽性藥組大鼠給予5%卵清白蛋白溶液(致敏濃度2.5 mL/kg)致敏。給藥組將相應濃度的5-HMF和OMBF溶液與等體積的佐劑混合并尾靜脈給藥，激發劑量是致敏劑量的兩倍。

給藥30 min后用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，腹主動脈采血并收集到含有凝血劑的冷凍管中。2500 r/min，4℃離心10 min，分離血清，-20℃保存，一個月內進行ELISA檢測。

1.3.5 Ⅰ型超敏反應體外實驗設計

大鼠含藥血清的制備與I型超敏反應體內實驗前期步驟相同，但是沒有經過激發直接腹主動脈采集血清，并用ELISA試劑盒檢測IgE濃度。

取RBL-2H3對數生長期的細胞，每毫升1×105個，接種到24孔板內。5% CO2，37℃孵化后，隨機分為空白對照組，佐劑對照組，裂解組，模型組(Anti-IgE-DNP為抗體，以DNP-BSA為抗原)，5-HMF組(低、高)，OMBF組(低、高)。待細胞貼壁后，吸棄各組培養基，用相應的培養基稀釋4倍的致敏血清刺激細胞24 h，使細胞處于致敏狀態，模型組用750 ng/mL的Anti-DNP-IgE致敏。24 h后用改良臺式液清洗兩遍，加入改良臺式液配置的不同濃度的藥物，模型組加入1 μg/mL的DNP-BSA 200 μL，正常組加入200 μL改良臺式液，裂解組加入200 μL濃度為1% 的TRItonx-100。在37℃，5% CO2條件下刺激1 h，取細胞上清。將細胞上清液和裂解液儲存在-20℃下以用于后期實驗指標的測定。

1.3.6 甲苯胺藍染色

取對數生長期RBL-2H3細胞，調整細胞密度至每毫升1×105個，均勻鋪在含有細胞爬片的6孔板內。待細胞貼壁后，將培養基配置的750 ng/mL的Anti-DNP-IgE孵育模型組細胞，佐劑對照組及各給藥組分別加入培養基稀釋4倍的血清孵育。24 h后用1 mL改良臺式液洗滌兩遍以清除殘存培養基。后分別加入改良臺式液配置的含有相應濃度藥物的溶液200 μL，對照組用相同量的改良臺式液替換，模型組加入200 μL DNP-BSA(1 μg/mL)，刺激1 h后，冰浴使反應停止后，取出細胞爬片，立即置于95%乙醇中，細胞固定后取出細胞爬片滴入甲苯胺藍染色溶液進行染色。在顯微鏡下觀察細胞脫顆粒形態并拍照。

1.3.7 β-氨基糖苷酶(β-HEX)釋放率的測定

在普通96孔板中，取50 μL各組別細胞上清，每組3個復孔，每孔加入100 μL酶底物，37℃恒溫孵育箱中孵育45 min，后加入終止液(NaHCO3/Na2CO3)200 μL中止反應。使用酶標儀(DIALAB GmbH，Vienna，Austria)在405 nm的波長下測量光密度(OD)。β-氨基糖苷酶釋放率(%)=(給藥組OD-空白對照組OD)/(裂解組OD-空白對照組OD)×100%。

1.3.8 組胺(His)釋放率測定

在全黑96孔板中，取100 μL各組別細胞上清，每組3個復孔，每孔加入20 μL NaOH溶液，20 μL組胺底物，37℃恒溫孵育箱中孵育15 min，加入終止液3% HCl溶液20 μL中止反應。使用酶標儀(DIALAB GmbH，Vienna，Austria)在Ex/Em=460/350 nm的波長下測量熒光強度。組胺釋放率(%)=(給藥組熒光強度-空白對照組熒光強度)/(裂解組熒光強度-空白對照組熒光強度)×100%。

1.3.9 Western blot

選取對數生長期的RBL-2H3，調整細胞密度至每毫升1×105個，均勻鋪在6孔板內。待細胞貼壁后，將培養基配置的750 ng/mL的Anti-DNP-IgE孵育模型組細胞，佐劑對照組及各給藥組分別加入培養基稀釋4倍的血清，正常組選擇培養基繼續培養。孵育24 h后用1 mL改良臺式液洗滌兩遍以清除殘存培養基。模型組及各給藥組分別加入改良臺式液配置的1 μg/mL DNP-BSA及各濃度藥物200 μL，對照組加入200 μL改良臺式液。孵育1 h后用冷的PBS清洗細胞兩遍，用細胞刮刮下各組細胞放入不同的1.5 mL Ep管中，離心后棄上清加入100 μL細胞裂解液在冰浴中裂解30 min，12 000 r/min離心取上清。取少量含蛋白的裂解液稀釋10倍后使用BCA蛋白測定試劑盒進行蛋白定量。應用Western blot法檢測在Ⅰ型超敏反應期間p-JNK，JNK，p-ERK，ERK，p-p38，p-38蛋白表達情況的改變。按照Kim描述的方法進行操作，并重復實驗3次[8]。使用Image-Pro Plus分析軟件(Media Cybernetics, Inc., MD, USA)進行進一步的圖形分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 5-HMF和OMBF誘導的體內I型超敏反應

采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清中IgE、IgG以及IL-4的變化(見圖1)。圖1A顯示5-HMF組和OMBF組的IgE含量與對照組相比均有顯著增長。佐劑組與生理鹽水對照組相比無明顯變化。圖1B顯示，IgG水平的改變主要體現在5-HMF高劑量組以及OMBF劑量組。在圖1C中，除佐劑組外，所有組均較生理鹽水對照組有明顯的增長。實驗結果表明5-HMF及其二聚體OMBF在低、高劑量下均可誘導I型超敏反應的發生。

2.2 5-HMF和OMBF誘導的體外 I 型超敏反應

2.2.1 BN大鼠血清中IgE的測定結果

ELISA測定含藥血清中IgE的含量(見圖2)，結果顯示，除佐劑組，其余各組與生理鹽水組的IgE含量相比均顯著性增高，可用于后續實驗對細胞的致敏刺激。

注： BN大鼠血清中IgE(A)、IgG(B)、IL-4(C)的含量測定；與NS組相比，*P<0.05。圖1 BN大鼠血清中I型超敏反應相關指標的測定Note. The determination of IgE (A), IgG (B), and IL-4 (C) in the serum of BN rats.Compared with the NS group,*P<0.05.Figure 1 The determination of related indexes of type I hypersensitivity in serum of BN rats

注：與NS組相比，*P<0.05。圖2 含藥血清中IgE含量測定Note. Compared with the NS group,*P<0.05.Figure 2 The determination of IgE in drug-containing serum

2.2.2 TB染色結果

甲苯胺藍(Toluidine Blue O)是一種常用的人工合成染料，可以與肥大細胞的細胞質內肝素、組織胺等物質發生特異性染色[9]。

染色結果顯示，佐劑組RBL-2H3細胞呈長梭形，邊緣完整，結構致密，未見脫顆粒。而脫顆粒的細胞體積增大，邊緣不整，出現大量的空泡或顆粒樣結構。RBL-2H3細胞脫顆粒形態觀察(見圖3)，模型組脫顆粒明顯，可見大部分細胞膜破裂，有顆粒樣物質滲出。5-HMF及OMBF低劑量組部分細胞結構保持完整，仍可見大量脫顆粒細胞。5-HMF及OMBF高劑量組大部分細胞均出現了脫顆粒的現象，細胞邊緣不整，細胞密度減低，出現顆粒樣尾狀結構。由上述結果可知，RBL-2H3細胞在OMBF高劑量作用下脫顆粒較為嚴重，即OMBF的免疫毒性高于單體5-HMF。

2.2.3 β-氨基糖苷酶釋放情況

β-氨基糖苷酶(β-HEX)被認為是間接反映細胞脫顆粒情況的重要指標[10-11]。通過測定細胞上清中β-HEX的含量，計算各給藥組釋放率來判斷各給藥組產生的免疫毒性的強弱。實驗結果顯示(見圖4)，各給藥組除佐劑組外均出現了顯著性差異，且OMBF高劑量組誘導細胞上清中的β-HEX的釋放量高于5-HMF。

2.2.4 組胺的釋放情況

組胺(Histamine)在人體中分布廣泛，主要存在于肥大細胞以及嗜堿性細胞中，由組氨酸經組氨酸脫羧酶(HDC)脫羧而產生,是反映細胞脫顆粒嚴重程度的重要指標[10,12]。實驗結果顯示(見圖5)，給藥組刺激RBL-2H3細胞，高劑量組和模型組出現了顯著性差異。提示較高劑量的5-HMF及其二聚體均能誘導細胞脫顆粒產生免疫毒性。

2.3 Western blot結果

蛋白免疫印跡法檢測用于研究在Ⅰ型超敏反應期間p-JNK，JNK，p-ERK，ERK，p-p38，p38在RBL-2H3細胞中的表達，結果以磷酸化蛋白和總蛋白的表達量比值呈現(見圖6)。與空白對照組相比，ERK，JNK和p38的磷酸化水平表達均上調。在5-HMF和OMBF的作用下，蛋白表達上調的水平未表現出明顯的劑量差異性，但從JNK和p38的磷酸化蛋白表達結果分析，OMBF比5-HMF更能促進磷酸化蛋白的表達，表現出了更強的免疫毒性。

注：上行顯示的是RBL-2H3細胞的正常形態及佐劑和陽性藥作用后的細胞形態，下行顯示的是RBL-2H3細胞經不同劑量的5-HMF及OMBF刺激后的細胞形態。圖3 RBL-2H3細胞脫顆粒形態觀察Note. The upper line shows the normal morphology of RBL-2H3 cells and the morphology of the cells stimulated by adjuvant and positive drugs. The next line shows the morphology of RBL-2H3 cells stimulated by different doses of 5-HMF and OMBF.Figure 3 The observation of RBL-2H3 cells

注：與Blank組相比，*P<0.05。圖4 RBL-2H3細胞上清中β-HEX釋放率的測定Note. Compared with the Blank group,*P<0.05.Figure 4 Determination of β-HEX release rate in supernatant of RBL-2H3 cells

注：與Blank組相比，*P<0.05。圖5 RBL-2H3細胞上清液中His釋放率的測定Note. Compared with the Blank group,*P<0.05.Figure 5 Determination of His release rate in supernatant of RBL-2H3 cell

3 討論

先前的研究發現5-HMF具有抗氧化、抗組織缺氧等生理藥理作用[13-15]。然而，研究表明該物質具有毒理學特性，5-HMF具有皮膚、粘膜和呼吸道刺激性[16]。此外，關于5-HMF的致突變性和致癌性尚且存在爭議[17-20]。基于上述原因，中國藥典和美國藥典將葡萄糖注射液在加熱和貯存過程中產生的5-HMF視為有害雜質。同樣，在一定條件下，5-HMF會發生聚合生成其二聚體產物OMBF，已經發現部分中藥注射劑中同時含有5-HMF和OMBF[21]。然而，到目前為止，關于OMBF的潛在毒性的研究很少，值得確認和探索可能的毒性與機制。

我們采用體內實驗與體外實驗相結合的方式，在體內實驗中，采用免疫系統發達的Brown Norway(BN)大鼠作為研究對象，通過測定給藥前后血清中IgG、IgE和炎性因子的含量變化探究藥物的免疫毒性。除了IgG之外，還可以更精準的測定IgG1的含量，在今后的相關實驗中我們將加以考慮。體外實驗采用大鼠嗜堿性粒細胞(RBL-2H3)系，RBL-2H3細胞表面Fc受體大量表達，是用于研究I型超敏反應的常用細胞系。眾所周知，I型超敏反應需要致敏和激發兩個階段，我們通過獲取大鼠含藥血清，孵育細胞24 h使細胞致敏，后加入相應濃度藥物，模擬機體I型超敏反應的全過程。通過甲苯胺藍染色觀察細胞脫顆粒形態，直接反映藥物免疫毒性的強弱。通過測定細胞上清中典型指標β-氨基糖苷酶及組胺的釋放量，通過比較給藥組與空白對照組釋放率的差異來判斷藥物免疫毒性的強弱。MAPK信號通路的激活在I型超敏反應中起重要作用，是抗過敏藥物的靶點，其特征在于活化后，磷酸化蛋白表達增多。MAPK信號通路與炎性介質的釋放息息相關，而過敏反應中IL-4等炎性介質顯著升高。因此，本研究在免疫毒性評價的基礎上，對5-HMF及其二聚體OMBF引起的MAPK通路中p-JNK，p-ERK和p-p38這三種蛋白表達量的變化進行了研究，以此確定5-HMF及其二聚體OMBF產生免疫毒性可能的作用通路。

通過體外和體內實驗模型，本研究發現5-HMF和OMBF作為小分子過敏原均可誘導I型超敏反應的發生。5-HMF及OMBF組內低、高劑量之間并未表現出顯著的差異性，這可能與引發免疫反應的物質量效關系不明顯有關，在今后我們的相關研究中會對其進一步觀察和驗證。從甲苯胺藍染色的結果來看，OMBF誘導細胞脫顆粒的嚴重程度明顯高于5-HMF，表現出了更強的免疫毒性。從Western blot的結果也可以看出，OMBF誘導RBL-2H3細胞p-p38以及p-JNK的表達量高于5-HMF組的表達量，從蛋白表達上進一步證實了5-HMF聚合生成OMBF后毒性增加，且二者產生的免疫毒性與MAPK家族蛋白磷酸化表達上調有關。結合本課題組前期研究結果，表明5-HMF和OMBF可同時導致過敏反應以及類過敏反應的發生，且產生相似的癥狀[22]，于是我們提出了新的假設，認為過敏反應與類過敏反應在作用通路上存在相同的地方，我們將會進一步完善二者的機制通路，因此二者在機制上的區別和聯系將會成為下一步研究的重點。