宮內發育遲緩對胰腺發育的影響

湯 琦，李 睿，張 然，陳小川

(西南大學動物科技學院，重慶 400715)

宮內發育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)是由于子宮內外不利因素使胎兒生長發育緩慢，在妊娠期結束后導致出生體重降低的一種現象[1]。IUGR使新生兒早產并發癥頻發、死亡率增加[2]，并且IUGR胎兒在成年后有肥胖和患有代謝綜合征的傾向[3]。胰腺作為體內最重要的內分泌器官，IUGR可通過損害胰腺發育來影響出生甚至成年后的胰腺內、外分泌功能。胰腺各發育階段主要由多種轉錄因子共同調控，IUGR可通過干預胰腺發育各階段轉錄因子的表達而影響胰腺結構和功能。因此，研究IUGR對胰腺各發育階段的潛在分子機制有利于找到合適的治療靶基因，在準確的時間用合適的藥物來預防和減緩IUGR的發生，有利于減少后代死亡率和代謝綜合征發病率。

1 IUGR產生原因

胎兒宮內發育遲緩主要是母體、胎兒和胎盤這三方面共同作用的結果，并且IUGR的嚴重程度取決于圍產期受損程度和持續時間。母體營養水平和不良生活習慣均可誘發IUGR。母體飲食中缺乏維生素B6，B9和B12容易造成高同型半胱氨酸血癥[4]，而缺鋅容易使母體血清C反應蛋白(CRP)、TNF-α和IL-8三種重要炎性細胞因子升高以及胎盤中炎性細胞因子的調節因子NF-kB被激活[5]，最終導致IUGR。煙草中的有害物質，如尼古丁、CO等穿過胎盤并進入胎兒循環，使胎兒的氧氣供應減少，臍動脈中的碳氧血紅蛋白水平增加，抑制細胞氧氣輸送而使胎兒缺氧，也容易產生IUGR[6]。由于人類妊娠時間長和營養種類需求復雜，母體營養不良成為誘發IUGR的重要原因。

胎兒感染以及多胎也容易誘發IUGR。胎兒感染病毒，如弓形蟲病，梅毒，風疹，巨細胞病毒和皰疹是造成IUGR的常見原因[7]。另外，臨床上也發現雙胎IUGR發生率明顯升高，并且采用助孕技術受孕的雙胎IUGR發生率明顯高于自然妊娠胎兒[8]。胎盤作為連接母體和胎兒的中間調節者，在胎兒的生長發育過程中起重要作用。胎盤結構異常[9]、胎盤血管化減少[10]或胎盤功能不全降低了胎盤血流量，限制了胎兒對營養物質(如：氨基酸、葡萄糖等)、生長因子和激素的利用率[11]，使胎兒處于低氧和低血糖生長環境，從而在妊娠期間延遲生長導致IUGR。

2 IUGR對后代內、外分泌胰腺的影響

IUGR是胎兒早產后圍產期死亡的第二大原因，生長受限胎兒在出生前有一半以上沒有被發現或發生宮內死亡[12]。研究發現，IUGR新生兒經常出現各種圍產期并發癥，雖然IUGR個體在后天表現出追趕性生長以達到正常體重水平，但這些個體仍表現為智力和運動水平低下[13]。成年后，IUGR個體患2型糖尿病(T2DM)、肥胖、高血壓、血脂異常和代謝綜合征的風險顯著增加[14]，這表明IUGR對新生兒的影響延續整體生命周期。1991年Lucas[15]提出了“代謝程序化”這個概念，Lucas認為如果胎兒在發育的關鍵或敏感時期受到刺激或損害，就會對生物體的結構或功能產生長期或永久的影響。IUGR可以持久性的損害胰腺發育來使胎兒消化和代謝系統等出現功能上的缺陷。胰腺由內分泌胰島和外分泌腺泡組成，胰島內分泌功能主要集中在β細胞，β細胞分泌的胰島素是體內唯一降血糖的激素，而外分泌功能主要集中在腺泡細胞，腺泡細胞分泌的胰液有消化蛋白質、脂肪和糖的作用。

IUGR使內分泌胰島細胞體積減小、β細胞質量減少，造成β細胞功能受損，從而導致胰島素分泌較低，葡萄糖耐量降低以及成年后發生2型糖尿病的機率增加[16]。研究發現母體營養不良誘導的IUGR仔鼠β細胞質量明顯減少，哺乳期正常喂養也不能恢復β細胞質量[17]。在妊娠后期高熱誘導的IUGR胎羊中發現，由于β細胞有絲分裂速率降低，造成胰島素陽性細胞面積減少，β細胞質量和增殖減少[18]。IUGR對外分泌胰腺發育的影響還研究得比較少，目前研究可以確認IUGR會導致外分泌腺泡細胞功能受損。Kolacek等[19]發現IUGR胎兒的胰凝乳蛋白酶濃度較低，Lebenthal等[20]發現母體胎盤血流量減少導致妊娠晚期胎鼠的淀粉酶和脂肪酶濃度選擇性降低。此外，胰腺外分泌異常與1型糖尿病(T1DM)的相關性在很大程度上被忽視，T1D患者存在外分泌功能不全和腺泡萎縮，且患有較長期1型糖尿病(>1年)患者的腺泡變小且酶原耗盡[21]，非內分泌胰腺糖尿病被美國糖尿病協會和世界衛生組織列為繼發性或3型糖尿病(T3DM)[22]。這些研究雖然沒有直接揭示IUGR與外分泌胰腺發育的關系，但也提示IUGR可能通過影響胰腺外分泌發育而導致胰腺外分泌功能受損。

3 常見IUGR動物模型

與胰腺研究相關的IUGR動物模型的構建方法主要有低能量飲食法(CR)、低蛋白飲食法(LP)、子宮動脈結扎法(UAL)和熱應激法，前三種動物模型主要用于大、小鼠這樣的嚙齒動物，而熱應激模型主要用于綿羊等類型的大動物。CR和LP是在妊娠期間減少母體對飼料的攝入量或減少母體飲食中的蛋白質含量，從而減少母體對胎兒的營養供應和限制胎盤生長而導致IUGR。研究表明，自妊娠11 d起限制母鼠飲食(予正常50%)至妊娠結束，導致IUGR新生大鼠胰腺發育受損和胰島面積減少[23]。在大鼠妊娠期或哺乳期或兩個時期都進行LP喂養，所有情況下的蛋白質限制都導致β細胞面積減少和哺乳期結束時的胰島形狀不規則，并且出生后蛋白質限制導致β細胞和胰島數量有更大程度的減少[24]。UAL是通過對動物子宮動脈進行結扎來減少子宮胎盤血流灌注量、胎盤營養物質和氧氣的供應，產生突然的全身營養和氧限制而導致IUGR。在妊娠后期高熱誘導的綿羊胎兒中發現，低氧血癥和高兒茶酚胺血癥可能有助于降低胰島素陽性細胞面積，減少β細胞質量和增殖[18]。像綿羊和人類的胰腺在產前就已經發育成熟，而嚙齒動物的胰腺發育在出生后仍在繼續，如表1所示。因此，嚙齒動物的胰腺在相對不連續的階段發育，使得嚙齒動物模型的β細胞受損能夠與不同階段的發育轉變聯系起來，而綿羊模型更接近人類胰腺的發育。

4 IUGR對胰腺各發育階段的影響機制

胰腺的發育是許多轉錄因子在時空上選擇性表達的結果(見表2)，根據胰腺發育各階段特定祖細胞的形成順序可以將胰腺發育分為胰腺發生、胰腺祖細胞分化和胰腺內分泌祖細胞分化這三個階段[25-27]。胰腺發生階段決定了胰腺是否發生，胰腺祖細胞分化階段是祖細胞向內分泌祖細胞和腺泡祖細胞分化的過程，胰腺內分泌祖細胞分化階段是內分泌祖細胞向胰島α、β、δ、PP細胞分化的過程。IUGR對胰腺發育的影響主要是通過調控胰腺發育各階段相關轉錄因子，這些轉錄因子之間相互作用，同時還受表觀遺傳學(如DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA修飾等)的影響。

4.1 IUGR對胰腺發生的影響

IUGR通過延遲或抑制胰腺發生導致最后的胰腺體積減小甚至胰腺缺失。胰十二指腸同源盒基因-1(pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX-1)的表達是胰腺開始形成的標志，Pdx-1可促進腸內胚層背側及腹側的胰腺萌芽的生長分化。研究顯示早在生長發育遲緩開始24 h后，IUGR胎鼠的Pdx-1 mRNA水平降低50%以上[28]。雖然Pdx-1在IUGR胎兒胰腺發生時期的變化沒有直接研究，但IUGR可以通過調控轉錄因子Pdx1來控制胰腺發生。

表1 胰腺發育關鍵時期的物種比較

注：E：embryonic day，胚胎日；dGA：days of gestational age，天胎齡；wGA，weeks of gestational age，周胎齡；G：fraction of gestation，妊娠分數。

表2 人和小鼠胰腺正常發育各階段相關轉錄因子

4.2 IUGR對胰腺祖細胞定向分化的影響

IUGR通過損害胰腺祖細胞的增殖和胰腺祖細胞向內分泌、外分泌細胞分化之間的平衡，造成胰腺祖細胞增殖減少，內分泌祖細胞和外分泌腺泡祖細胞形成能力降低，最終可能導致胰腺發育畸形、胰島和腺泡數量減少、內分泌胰島和外分泌腺泡功能受損。Pdx-1在早期外分泌腺泡發育、成熟和生長中也起重要作用，研究顯示在小鼠胎齡13.5～14 d(E13.5～E14)，Pdx-1表達抑制導致腺泡數量減少且腺泡發育不成熟[29]。因此，IUGR胎兒胰腺中Pdx-1表達的持續降低會抑制外分泌腺泡形成。

成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，FGFs)作為細胞間信號分子能刺激DNA的合成和細胞分裂來促進細胞增殖和細胞分化，Fgfr2IIIb、Fgf7和Fgf10促進胰腺祖上皮細胞增殖[30]，在IUGR胎羊胰腺中發現Fgf7和Fgfr2IIIb的mRNA表達水平降低，并且胰腺祖上皮細胞減少[31]。

發狀分裂相關增強子1(hairy and enhancer of split，HES1)能夠抑制胰腺內分泌細胞分化而促進外分泌腺泡細胞分化。研究表明，Hes1缺陷的小鼠存在內分泌細胞提前發育而早熟，而外分泌腺泡細胞發生凋亡而發育不全的現象[32]。IUGR能顯著增加母體和胎兒的糖皮質激素水平[33]，糖皮質激素通過上調外分泌轉錄因子Hes1的表達而有利于外分泌腺泡分化，同時使內分泌轉錄因子Pdx-1、Pax-6和Nkx6.1的表達下調而抑制胰腺祖細胞向內分泌細胞分化[34]。因此，IUGR可以通過上調糖皮質激素水平來增加Hes1濃度，從而調節胰腺內分泌和外分泌細胞分化之間的平衡，最終促進胰腺外分泌分化而抑制內分泌分化。

4.3 IUGR對胰腺內分泌祖細胞分化的影響

IUGR通過降低胰島細胞增殖或破壞內分泌祖細胞譜系向α、β、δ、PP細胞分化的平衡，使胎兒胰島面積減小、胰島數量減少、胰島細胞功能障礙以及β細胞質量降低。神經元素3(neurogenin-3，NGN3)是胰腺內分泌祖細胞標記物，決定胰腺內分泌細胞分化命運。Ngn3的下游靶基因包括Neurod1、Pax4、Arx、Insm1、Rfx6、Nkx2.2，這些轉錄因子與內分泌分化相關。研究發現，Ngn3基因敲除的小鼠沒有胰腺內分泌細胞[35]，且Pdx1啟動子下的Ngn3異常表達誘導胰腺祖細胞過早分化為主要是α細胞的內分泌細胞[36]。在妊娠期低能量飲食的胎鼠胰腺中發現Ngn3陽性細胞數量在E15時減少[37]。以上研究提示，IUGR通過下調Ngn3的表達而抑制胰島細胞形成或損害內分泌祖細胞分化。

Pdx-1能抑制胰島細胞凋亡，研究表明在Pdx-1敲除的胰島細胞中抗凋亡蛋白減少而凋亡相關蛋白活性增強[38]，說明IUGR可以通過下調Pdx-1水平使胰島細胞凋亡增加。此外，血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)在胰島中的作用是使胰島增生和血管內皮細胞增加。在低蛋白飲食(LP)胎兒的研究發現，β細胞質量減少與β細胞增殖受損和晚期胰島血管形成減少有關[35]。IUGR通過下調VegfA的表達使早期胰島血管密度降低，從而導致胰島發育受損[39-40]。

肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A(macrophage-activating factor A，MAFA)是β細胞特異性轉錄因子，其特異性歸因于MafA啟動子特異性結合Pdx1、Nkx2.2和Foxa2[41]，而這些轉錄因子又與胰腺內分泌祖細胞的分化相關。同時，研究發現MafA既可以增強Pdx1將Ngn3陽性內分泌祖細胞誘導β細胞形成的能力，還能夠使Pdx1將定向的胰高血糖素陽性α細胞轉分化為β細胞[42]。在IUGR大鼠胚胎后期直至出生時的胰腺中，MafA的mRNA和蛋白質的表達量一直降低[43]。因此，IUGR可以通過降低MafA表達來抑制β細胞形成。

4.4 IUGR對β細胞增殖分化和存活的影響

除了早期胰腺在宮內的發育之外，已有大量的研究證明在出生后的β細胞生長過程中，IUGR通過增加β細胞凋亡、降低β細胞增殖和存活，最終使β細胞數量減少或質量降低。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)可以通過改變β細胞復制和凋亡的平衡來調節β細胞增殖分化和存活，而它們的結合蛋白(IGFBPs)可以抑制或增強IGF活性。在綿羊上的研究發現，IUGR胎兒胰腺中IGF-1的mRNA表達水平降低，而IUGR胎兒胰島中IGF-2的mRNA表達水平升高[31]。另一項研究也表明，促進細胞生長和存活的生長因子IGF2、IGF1R和IGF2R在IUGR胎兒胰島中均上調，而IGF2BP1則減少了2.9倍[44]。IGFBPs水平的降低有助于增強IGF與IGF-1R/2R的相互作用而降低IGF濃度，而IGF-2水平的升高可以通過抑制糖原合成酶激酶3而部分抑制β細胞凋亡，促進新生大鼠胰島β細胞存活[45]。以上研究提示，IUGR一方面通過降低IGF-1來抑制β細胞增殖和分化，而另一方面IGF-2的局部升高可能是對β細胞再生的一種補償調控。

Pdx-1表達對于胰島β細胞增殖、分化和存活也是必需的。Pdx-1的表達在IUGR胎兒的β細胞中永久性地減少[46]，其主要影響機制為表觀遺傳修飾中的甲基化和乙酰化。從IUGR胎兒中分離的胰島顯示在Pdx-1的近端啟動子處的H3和H4的脫乙酰化而失去USF-1結合，USF-1是Pdx-1轉錄的關鍵激活劑，其結合減少顯著降低Pdx-1轉錄[47]。此外，在IUGR動物β細胞中組蛋白甲基轉移酶(SET7/9)與Pdx-1的近端啟動子的結合喪失，其導致Pdx-1區域中H3K4的甲基化顯著減少，Pdx-1的轉錄被抑制，其表達量降低[27]。因此，IUGR可以通過在妊娠后期持續性的抑制Pdx-1表達來降低β細胞增殖。

5 展望

IUGR成因復雜且對人類疾病和動物生產影響巨大。目前，IUGR對胰腺發育的研究主要集中在內分泌β細胞，而外分泌腺泡和導管占據胰腺大部分結構，其外分泌功能異常會造成胰腺炎、胰腺癌和3型糖尿病等疾病，因此IUGR是否通過損害外分泌胰腺發育來影響外分泌功能仍然值得深入研究。與此同時，由于Pdx-1在胰腺各發育階段都發揮重要作用，因此目前胰腺發育相關轉錄因子的研究主要圍繞Pdx-1展開，然而胰腺發育受損是多種轉錄因子共同作用的結果，因此除Pdx-1之外的其他重要轉錄因子在IUGR上的變化還有待進一步的研究。此外，miRNA是一類在轉錄后水平上調控基因表達的小分子RNA，miRNA可以通過結合特定的轉錄因子來抑制其表達，從而影響胰腺發育。已經有大量的研究證明miRNA與胰腺發育和β細胞存活有關[48-49]，因此，表觀遺傳修飾除了DNA甲基化和組蛋白修飾外，miRNA修飾可能是IUGR調節胰腺發育相關轉錄因子表達的一種新機制，也是未來研究的新方向。