過敏性疾病小鼠動物模型建立及表型變化的研究進(jìn)展

白夢天，胡竹林*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，眼科，昆明 650032； 2.云南省眼科研究所，昆明 650032；3.云南省第二人民醫(yī)院，眼科，昆明 650032； 4.姚克專家工作站，昆明 650032)

過敏性疾病在發(fā)達(dá)國家、部分發(fā)展中國家及地區(qū)已具有較高的發(fā)病率，這與當(dāng)?shù)亟?jīng)濟因素、環(huán)境因素密切相關(guān)。不同個體致敏后，其抗體對于抗原的敏感性存在差異，且不同個體之間可能存在不同的臨床表現(xiàn)，使得過敏性疾病的的臨床表現(xiàn)及治療存在較大差異[1]。為了更有效方便地研究過敏性疾病，過敏性疾病小鼠模型已經(jīng)被廣泛運用，并且取得了豐碩的成果。同時，研究者正嘗試將成果服務(wù)于臨床[2]。盡管不同的過敏性疾病發(fā)病機制不同，但構(gòu)建過敏性小鼠模型時卻常采用相同的方式，即抗原系統(tǒng)性致敏，其后進(jìn)行局部激發(fā)。而常用的抗原包括卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、豚草花粉(ragweed pollen, RW)、屋塵螨(house dust mites，HDM)等。致敏小鼠以發(fā)生I型和IV型過敏反應(yīng)為主。包括嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、肥大細(xì)胞脫顆粒、抗原特異性IgE的產(chǎn)生，Th細(xì)胞的活化、Th1/Th2失衡等[3]。本文將對過敏性結(jié)膜炎、過敏性哮喘、特應(yīng)性接觸性皮炎、食物性過敏的小鼠動物模型構(gòu)建以及表型變化進(jìn)行綜述。

1 過敏性結(jié)膜炎

據(jù)統(tǒng)計，過敏性結(jié)膜炎全球患病率約10%～30%，但真實患病率可能高于當(dāng)前統(tǒng)計結(jié)果，可能的原因在于其缺乏特征性臨床體征且部分患者未及時就診。過敏性結(jié)膜炎作為一種免疫系統(tǒng)疾病，其與過敏性哮喘、食物性過敏具有相似的免疫學(xué)機制[4]。

過敏性結(jié)膜炎動物模型的建立首先需全身致敏，而后進(jìn)行眼部抗原激發(fā)(表1)。目前認(rèn)為，特異性IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的IV型超敏反應(yīng)與過敏性結(jié)膜炎具有密切關(guān)聯(lián)。當(dāng)機體處于致敏狀態(tài)下，變應(yīng)原與眼表肥大細(xì)胞膜FcεRI上的IgE結(jié)合，啟動早期相反應(yīng)(early phase reaction，EPR)，引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放一系列細(xì)胞因子，如嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(eosinophilic chemotactic factor)、組胺(histamine)以及白三烯(leukotrienes)等[10]。當(dāng)進(jìn)入晚期相反應(yīng)(later phase reaction，LPR)時，則可見大量嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞浸潤，并釋放細(xì)胞因子、趨化因子，引起角結(jié)膜組織的炎性損傷。

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)可將變應(yīng)原收集并運輸至淋巴結(jié)，激活T細(xì)胞，造成Th1/Th2漂移，Th2細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4、IL-5、IL-6、IL-13可促進(jìn)IgE的產(chǎn)生，并促進(jìn)IgE與肥大細(xì)胞膜FcεRI的結(jié)合，引起炎癥損傷[11]。2000年IL-37被首次提出[12]，IL-37屬于IL-1基因家族成員，IL-1家族包含7個促炎因子(IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、 IL-36γ)，4個抗炎因子(IL-1R 拮抗因子、IL-36R拮抗因子、IL-37、IL-38)[13]。IL-37能夠與IL-18競爭性結(jié)合IL-18Rα，招募孤兒受體IL-1R8。IL-1R8能夠抑制先天性和獲得性免疫，并且上調(diào)抗炎相關(guān)信號通路，如AMPK、JAK/STAT，下調(diào)促炎相關(guān)通路如NF-kB、NLR3等[14]。由于小鼠體內(nèi)并不能檢測到IL-37，因此無法使用基因敲除技術(shù)構(gòu)建IL-37缺陷小鼠，但隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，IL-37轉(zhuǎn)基因(IL-37 -transgenic, IL37-tg)小鼠已經(jīng)成為過敏性疾病中研究IL-37常用的動物模型[15]。此外，經(jīng)重組IL-37處理的野生型(wild-type, WT)小鼠同樣能夠發(fā)揮抗免疫作用[16]。當(dāng)前，IL-37已經(jīng)成為多種過敏性疾病研究的新熱點。然而，IL-37在過敏性結(jié)膜炎的研究中還鮮有報道。

表 1 過敏性結(jié)膜炎小鼠造模方法及表型變化

注：RW：豚草花粉； OVA：卵清蛋白；SWR：短豚草花粉。

Note. RW, ragweed pollen. OVA: Ovalbumin. SWR:short ragweed pollen.

2 過敏性哮喘

由于小鼠致敏程度高、繁殖能力強且適合大規(guī)模飼養(yǎng)，因此成為該類疾病常用的模型動物。但有研究者[17]認(rèn)為，過敏性哮喘小鼠不會自發(fā)地表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)，需要在模型成功建立的基礎(chǔ)上使用支氣管收縮劑，其原因為小鼠氣道直徑相對較大，不易出現(xiàn)可逆性氣流阻塞，并不能直接反應(yīng)氣道受阻情況，但仍能觀察到嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增加，CD4+細(xì)胞表達(dá)增高，特異性IgE表達(dá)增高等，Th1/Th2失衡等現(xiàn)象。

過敏性哮喘小鼠模型的建立分為致敏階段和效應(yīng)階段，在致敏階段需全身致敏，效應(yīng)階段則多采用霧化吸入方法激活效應(yīng)細(xì)胞，從而引起過敏反應(yīng)(表2)。在EPR階段，IgE激活肥大細(xì)胞，使支氣管平滑肌收縮，黏蛋白分泌增加以及炎性因子增加。在LPR階段，隨著炎性細(xì)胞遷移至肺組織和氣道上皮細(xì)胞，引起氣道平滑肌肥大、氣道上皮脫落、杯狀細(xì)胞化生以及上皮纖維化[23]。在過敏性哮喘小鼠模型中，IL-4主要作用于B淋巴細(xì)胞，增強肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞中IgE受體的親和力，從而促進(jìn)抗原特異性IgE的產(chǎn)生。IL-5主要激活和招募骨髓組織中嗜酸性粒細(xì)胞。IL-13主要引起氣道上皮細(xì)胞高反應(yīng)性、杯狀細(xì)胞化生以及激活巨噬細(xì)胞等[24]。

IL-37廣泛分布在人體的各個器官和組織中，如肺、淋巴結(jié)、胸腺等，此外，人和小鼠的上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞有IL-18Rα。 給予過敏性哮喘小鼠rhIL-37滴鼻，在其肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)Th2相關(guān)細(xì)胞因子顯著下降，同時出現(xiàn)哮喘癥狀的明顯改善[25]。而敲除IL-18Rα后，則無法觀察到IL-37的抗炎作用[26]。提示IL-18Rα對于IL-37效應(yīng)的發(fā)揮具有重要。IL-37發(fā)揮抗過敏性哮喘作用的機制也是研究者目前關(guān)注的熱點。有研究認(rèn)為在過敏性哮喘動物模型中，IL-37通過抑制IL-4/IL-6誘導(dǎo)的CCL1的產(chǎn)生而發(fā)揮作用[27]。Robuffo等[28]認(rèn)為，IL-37通過抑制髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，進(jìn)而抑制TLR通路而發(fā)揮作用。而Lunding等[25]發(fā)現(xiàn)IL-37可通過直接抑制Th2型細(xì)胞而發(fā)揮作用。IL-37對抗過敏性哮喘的機制可能涉及多靶點、多通路，但何種靶點或通路發(fā)揮了主要作用目前尚不得而知。

表 2 過敏性哮喘小鼠造模方法及表型變化

注：HDM：屋塵螨；AHE：曲霉菌絲提取物；BALF：支氣管肺泡灌洗液；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；SOD：超氧化物歧化酶。

Note: HDM, house dust mite. AHE, aspergillus hyphal extract. BALF, bronchoalveolar lavage fluid. iNOS, inducible nitric oxide synthase. SOD, superoxide dismutase.

3 變應(yīng)性接觸性皮炎

變應(yīng)性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis, ACD)是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型(IV型)超敏反應(yīng)，其致敏原為被稱為半抗原(分子量小于500×103)。半抗原并不具備抗原性，但可與載體蛋白形成半抗原-載體蛋白復(fù)合體，皮膚的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)可將其捕獲并移行至淋巴結(jié)。

抗原的呈遞使T淋巴細(xì)胞致敏分化為不同亞群，如Th1細(xì)胞、Tc1細(xì)胞。當(dāng)機體再次接觸到過敏原后，Th1/Tc1細(xì)胞被激活并產(chǎn)生IFN-γ，并激活臨近角質(zhì)細(xì)胞而產(chǎn)生炎性反應(yīng)[29]。

ACD動物模型又稱為接觸性超敏反應(yīng) (contact hypersensitivity，CHS)，其半抗原主要有二硝基氟苯(dinitrofluoroben-zene，DNFB)、惡唑酮、三氯乙烯、甲苯二異氰酸酯、熒光素-5-異硫氰酸鹽和硝基氯代苯(Trinitrochloro-benzene，TNCB)、等。目前經(jīng)典的ACD小鼠動物模型建立方法為采用DNFB腹部涂抹，待小鼠全身致敏后，DNFB耳廓或背部涂抹激發(fā)(表3)。

目前已發(fā)現(xiàn)DCs三種亞群，即朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells，LCs)、CD103-DCs、CD103+DCs。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，皮膚中含有大量LCs、易于和抗原復(fù)合物結(jié)合且具有抗原呈遞功能，其應(yīng)該為誘導(dǎo)Th1/Tc1的主要細(xì)胞。但研究者敲除LCs基因后，發(fā)現(xiàn)CHS無明顯改變；而敲除CD103+DCs基因后，CHS反應(yīng)明顯下降[35-36]。而Edelson等[37]又發(fā)現(xiàn)Batf-/-小鼠(先天性缺乏CD103+DCs基因)的CHS又未受到影響。因此DCs調(diào)控CHS的具體機制還需進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，維生素D可通過抑制Toll樣受體抑制炎性反應(yīng)，增強IL-10的產(chǎn)生，抑制DCs活化，降低Th1相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生以及抑制B細(xì)胞活化和IgE的產(chǎn)生來發(fā)揮免疫抑制作用[38-39]。Malley等[40]觀察到，缺乏維生素D的雄性小鼠對ACD更為敏感，而在雌性小鼠中無此現(xiàn)象存在。這提示維生素D可能確實存在抑制ACD作用，但目前此方面報道尚少，確切機制尚不清楚。

表 3 接觸性皮炎小鼠造模方法及表型變化

注：TNCB: 2,4,6-三硝基氯苯；ASCs: 脂肪組織源性多能干細(xì)胞；SADBE: 接觸敏化劑; DNCB:二硝基氯苯; Ox: 惡唑酮; DNFB: 2，4-二硝基氟苯。

Note. TNCB, 2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene. ASCs, adipose tissue-derived multipotent mesenchymal stem cells. SADBE, contact sensitizer. DNCB, dinitrochlorobenzene. Ox, oxazolone. DNFB, 2, 4-Dinitrofluorobenzene.

4 食物性過敏

食物性過敏(food allergy，F(xiàn)A)的發(fā)病率僅次于呼吸系統(tǒng)過敏，且多為IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)。目前，被國際免疫學(xué)會認(rèn)定的食物性過敏原超過100種，但90%的食物性過敏由牛奶、雞蛋、魚類、貝殼類、花生、大豆、小麥、堅果8類食物引起。在美國，兒童發(fā)病率高達(dá)8%，成年人高達(dá)2%～3%[41]。

同過敏性哮喘、過敏性結(jié)膜炎動物模型類似，F(xiàn)A小鼠模型也需全身致敏(多為腹腔注射)，再予以口服抗原激發(fā)(表4)。由于食物中蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)在胃腸道中會發(fā)生改變，其致敏性被降低，采取腹腔注射可更好的保證致敏原分子結(jié)構(gòu)的完整性。此外，F(xiàn)A小鼠模型常會出現(xiàn)體溫下降、腹瀉等表現(xiàn)[46]。

在FA動物模型中，Th1相關(guān)因子(IFN-γ)含量顯著下降，而Th2相關(guān)因子(IL-4、IL-5、IL-13)含量上升，出現(xiàn)Th1/Th2失衡，即“Th1/Th2漂移”現(xiàn)象。Liotta等[47]發(fā)現(xiàn)Notch通路被阻斷后，IL-4含量降低但I(xiàn)FN-γ顯著上升，且小鼠過敏癥狀明顯減輕。這與Sauma等[48]的研究結(jié)果一致。提示Notch通路可能通過下調(diào)Th2，而上調(diào)Th1改善FA小鼠過敏癥狀。此外，Jiang等[49]在FA小鼠模型中使用Notch通路抑制劑后，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞和脾單個核細(xì)胞中NICD、Hes-1表達(dá)下降，T-bet(Th1轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子)表達(dá)上升，而Gata-3(Th2轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子)表達(dá)降低。猜測Notch可能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)FA。但具體機制仍不清楚。

在FA動物模型中，研究者可排除眾多混雜因素，因此可以精確地評估致敏原、找到治病因素并采取有效的干預(yù)措施。但FA是一種全身性疾病，它與遺傳因素、環(huán)境因素以及個體易感性等均有很大關(guān)聯(lián)，因此很難精確判斷個體的發(fā)病情況，嚴(yán)重程度以及持續(xù)時間。但盡管如此，研究者仍不斷在動物模型的基礎(chǔ)上盡可能找到可能出現(xiàn)的過敏原，明確其危害程度與暴露因素，并在此基礎(chǔ)上避免具有易感體質(zhì)的個體接觸該類過敏原。

5 小結(jié)與展望

由于人類生活環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，過敏性小鼠動物模型可能無法完全模擬過敏性疾病的流行病學(xué)、致病因素、疾病發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，但其能夠較好地揭示相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等信息。我們應(yīng)該更為客觀、科學(xué)地看待此種局限性，盡管實驗動物研究已取得豐碩的結(jié)果，但向臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化仍然任重道遠(yuǎn)。值得肯定的是，構(gòu)建過敏性小鼠模型尋找過敏性疾病的潛在治療靶點仍是當(dāng)前研究的熱點。此外，隨著高通量測序的使用成本逐步下降，使得非編碼RNA研究的不斷深入，又為過敏性疾病的深入研究提供了有力的工具和理論基礎(chǔ)。目前已知，外泌體廣泛存在于細(xì)胞及體液中，其可攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA以及脂質(zhì)等物質(zhì)，作為細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)而參與到機體免疫應(yīng)答、抗原呈遞、細(xì)胞遷移、分化等生物學(xué)現(xiàn)象中。盡管外泌體在腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)中已廣泛研究，但其在過敏性疾病研究中還需要進(jìn)一步深入，如能深入挖掘過敏性疾病中外泌體與非編碼RNA、外泌體與蛋白組學(xué)的互相調(diào)控關(guān)系，外泌體與不同分子之間的直接交互作用導(dǎo)致分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改變對于疾病的影響，則可能對過敏性疾病的治療提供新的思路和靶點。

表 4 食物性小鼠造模方法及表型變化

注：BLG: β-乳球蛋白。

Note. BLG, β-lactoglobulin.