老年和青年SD大鼠外周血及免疫細胞分型測定分析

管博文，盧延華，石桂英，蘇路路，王玉全，王 衛，魏 強，白 琳，孟愛民

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，北京 100021)

中國是世界上老年人口最多的國家，給當今社會和經濟發展帶來了巨大挑戰。在老齡化過程中機體穩態平衡被打破，身體各系統機能不斷減退，成為各種老年病的重要危險因素，嚴重影響老年人的生活質量。衰老有很多種理論，包括自由基損傷，端粒酶縮短，DNA損傷和免疫衰老等。其中免疫衰老學說的核心觀點是機體衰老是免疫衰老，神經衰老，內分泌紊亂共同導致的。機體的衰老導致免疫器官的萎縮，進一步導致淋巴細胞功能的下降，對應激的應答減弱，反過來導致機體的進一步衰老。神經細胞和免疫細胞有相同的細胞因子受體，存在著相互作用，神經系統的衰老也會導致內分泌系統的紊亂，最終導致整個機體的衰老加快[1-3]。

相比低等動物，嚙齒類動物在身體結構功能上和基因上都與人更加接近，其中大鼠在神經，毒理和代謝上更接近人類，有利于未來制作基因修飾的早衰大鼠模型[4-5]。所以本文選用老年大鼠檢測外周血、脾免疫細胞分型及免疫細胞衰老指標，并與對青年大鼠進行比較分析。進一步分析各項指標的性別差異，為研究老齡化改變及老年病提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級青年SD大鼠，8周齡，共10只，雌雄各半，雄性體重265～285 g，雌性體重199～205 g；SPF級12月齡SD雄性大鼠10只，體重720～970 g，雌性大鼠10只，體重范圍360～490 g。SD大鼠均購于北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。青年與老年大鼠均飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所動物房屏障環境[SYXK(京)2015-0035]，溫度為20℃～26℃，內外壓差大于10帕斯卡，相對濕度為40%～70%，12 h進行一次晝夜交替，照明強度為15～20勒克斯，動物自由取食飲水。本實驗經過中國醫學科學院醫學實驗動物研究所IACUC的批準，批準號為MAM17001。并依照實驗動物倫理和福利要求使用實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器

流式抗體CD25-PE、CD3-FITC購于eBioscience；CD8 PE-Cy7、Mac-PE購于Thermofisher scientific；CD4-APC、CD161-FITC、CD45RA-APC、CD3-FITC、CD45RA-APC購于BioLegend；紅細胞裂解液購于Invitrogen公司；EasySepTMRat T Cell Isolation Kit購于STEMCELL Technologies；大鼠脾單個核細胞分離液試劑盒由索萊寶提供；外周血計數及分類由全自動血液分析儀PentraDX120(ABX)分析；血細胞免疫分型應用BD流式分析儀(BD FACSAria II)檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血細胞計數及分類

大鼠稱重腹腔注射2%戊巴比妥鈉，麻醉后腹主動脈取血，醫用抗凝采血管收集，用于外周血計數及白細胞分類。取血后安樂死[6]。

1.3.2 免疫臟器系數

大鼠安樂死后，取胸腺、脾和大腦分別稱重，計算胸腺系數和脾系數。胸腺系數=胸腺重量(g)/大鼠大腦重(g)，脾系數=脾重量(g)/大鼠大腦重(g)[7-8]。

1.3.3 外周血免疫細胞和脾淋巴細胞分型檢測

將大鼠脾研磨制備脾細胞懸液。取一定量脾懸液和外周血分別加入紅細胞裂解液室溫裂解8 min，加入PBS終止裂紅，并離心洗滌一次，離心條件為400 g，4℃，5 min。棄上清重懸加入對應抗體4℃孵育。PBS洗滌并重懸，離心條件同上。用流式細胞儀分別進行外周血和脾淋巴細胞的免疫分型檢測[9]。

1.3.4 脾T細胞分離及P16 mRNA表達量檢測

利用試劑盒采用密度梯度離心法分離大鼠脾單個核細胞、免疫磁珠法富集T細胞。具體步驟如下：取適量脾細胞懸液體積調節為3 mL，緩慢加到ficoll分離液上，室溫1500 r/min離心25 min。離心后取單個核細胞層，用不含鈣鎂Hank’s液洗滌2次。用含有2%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1 mM EDTA的PBS重懸并計數，將濃度調節為每毫升5×107個。在樣品中按50 μL/mL加入Cocktail混合抗體，混勻，室溫孵育10 min。孵育結束后在樣品中按50 μL/mL加入磁珠(RapidSpheres),并加入含2% FBS和1mM EDTA的PBS補齊至5 mL。放入磁鐵分離器中孵育，室溫10 min。孵育后其他細胞被磁珠包被吸附在管壁，細胞懸液中為T細胞。收集細胞懸液，離心重懸計數，按每1×106～5×106個細胞加入1 mL TRIzol保存，由上海歐易生物醫學科技有限公司采用RT-qPCR檢測P16 mRNA表達量[10]。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 外周血計數及分類

外周血計數結果顯示，與青年大鼠相比，老年大鼠白細胞計數降低(降低28.7%，P<0.05)，紅細胞計數、血紅蛋白含量升高(分別為P<0.01，P<0.05)。分類結果顯示淋巴細胞百分比下降(降低18.8%)；粒細胞百分比、嗜酸性粒細胞百分比和嗜堿性粒細胞百分比升高(分別升高40.2%、104.4%和28.9%，P<0.01、P<0.01和P<0.05)；血小板和單核細胞百分比未見差異。提示了老年大鼠淋系和粒系細胞分化偏移。結果如表1所示。

2.2 免疫臟器系數

由于老年大鼠與青年大鼠、兩組大鼠不同性別之間體重有明顯差異，常規的臟器系數(臟器/體重比)無法真實的反映臟器的變化，故免疫臟器系數以大鼠胸腺、脾重量與大腦重量比表示[8]。分析結果顯示，老年組與青年組大鼠胸腺指數和脾指數未見顯著性差異。結果見圖1。

表1 老年大鼠與青年大鼠外周血計數比較

注：與青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.

2.3 外周血免疫分型

流式細胞術檢測外周血輔助T細胞(CD4)、調節性T細胞(CD4 CD25)、細胞毒性T細胞(CD3 CD8)、B細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)和單核細胞，各種細胞分析門的設置見圖2。

流式結果顯示，與青年大鼠比較，老年組大鼠的輔助T細胞、調節性T細胞、自然殺傷細胞和單核細胞升高，B細胞降低，細胞毒性T細胞未見明顯差異。相較于青年組，老年組輔助T細胞從(32.34 ± 1.93)%上升到(39.67 ± 1.75)%(P<0.05)；老年組調節性T細胞從(2.30 ± 0.42)%上升到(6.58 ± 0.93)%，(P<0.01)；老年組自然殺傷細胞從(3.02 ± 0.36)%上升到(6.21 ± 0.66)%(P<0.01)，老年組單核細胞從(0.43 ± 0.11)%上升到(1.00 ± 0.15)%(P<0.05)；相較于青年組，老年組B細胞從(39.14 ± 2.30)%下降到(31.50 ± 1.88)%(P<0.05)。細胞毒性T細胞未見明顯差異，見圖3。

2.4 脾免疫細胞分型

流式細胞術分析脾淋巴細胞CD3+和CD45RA+比例。見圖4。

結果顯示，與青年組相比，老年組CD3細胞比例未見明顯差異，CD45RA從(46.42 ± 3.65)%降低到(38.69 ± 5.52)%，差異有極顯著性(P<0.01)。結果見圖5。

2.5 脾T細胞P16 mRNA表達量檢測

為了檢測老年大鼠T淋巴細胞P16 mRNA表達量的改變，分離T細胞，RT-PCR檢測P16 mRNA表達量。結果顯示，相比于青年雄性大鼠，老年雄性大鼠P16 mRNA表達量明顯升高，從1.03±0.28上升到4.74±2.05(P<0.05)。結果見圖6。

圖1 老年大鼠與青年大鼠免疫臟器系數比較Figure 1 Comparison of organ coefficient between aged and young rat

圖2 外周血細胞流式分析門的設置及示意圖Figure 2 Representative gating strategy for peripheral blood immune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：與青年大鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。圖3 老年大鼠與青年大鼠外周血免疫細胞分型比較Note. Compared with young rat，*P<0.05，**P<0.01.Figure 3 Comparison of immune cell typing in peripheral bloodbetween aged and young rat

圖4 流式分析脾免疫細胞門的設置及示意圖Figure 4 Representative gating strategy for splenicimmune cell phenotypes analyzed by flow cytometry

注：與青年大鼠相比，**P<0.01。圖5 老年大鼠與青年大鼠脾免疫細胞分型比較Note. Compared with young rat，**P<0.01.Figure 5 Comparison of splenic immune cell typing between aged and youngrat

注：與青年雄性大鼠相比，**P<0.01。圖6 老年雄性大鼠和青年雄性大鼠脾T細胞的P16 mRNA表達比較Note. Compared with young male rat,**P<0.01.Figure 6 Comparison of P16 mRNA expression in splenic T cells between agemalerat and young male rat

3 討論

本研究對老年大鼠外周血計數、免疫細胞分型、臟器系數以及T細胞P16表達水平進行檢測，并與青年大鼠進行比較分析。

老年大鼠外周血檢測結果顯示白細胞減少，紅細胞升高；淋巴細胞比例減低，中性粒細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞比例升高，提示老年大鼠天然免疫功能下降，淋系與髓系比例發生改變出現，分化偏移，變態反應性增強，與老年人出現的改變類似。與研究人員前期檢測老年小鼠的結果相同[9]。而在林洪燕和張海潔等[11-12]的研究中，老年人群外周血紅細胞和血紅蛋白都是趨于降低。胡雄飛等[13]的研究中，相較于青年大鼠，老年大鼠只有白細胞和血紅蛋白是升高的，其余各項均無顯著性差異。李長雷的研究中，則是紅細胞，中性粒細胞百分比，嗜堿性粒細胞百分比和單核細胞百分比上升，血小板，淋巴細胞百分比下降[14]。老年大鼠外周血的變化測定結果不一致，可能與測定實驗室條件不同有關，但老年大鼠外周血白細胞計數下降、淋巴細胞比例降低、中性粒細胞比例升高的結果比較一致。這可能與老年人易出現髓系白血病有關[15]。

外周血免疫分型中，老年組大鼠T細胞比例升高，B細胞比例明顯下降，CD4/CD8比例升高，調節T細胞顯著升高；B細胞下降與脾淋巴細胞分型檢測結果一致，提示老年大鼠在白細胞降低、淋巴細胞比例下降的基礎上，中樞淋巴器官和外周血B細胞水平降低，可能與老年人接種疫苗免疫反應性下降，抗感染能力降低有關[16]。但這與課題組前期研究發現老年小鼠外周血僅有CD4比例降低不同[9]。

調節性T細胞通過主動調節的方式抑制存在于正常機體內潛在的自身反應性T細胞的活化與增殖，防止自身免疫性疾病的發生；測定結果發現，老年大鼠調節T細胞比例升高，則可能與老年人出現免疫抑制，免疫監視功能下降，腫瘤高發及轉移有關[17]。今后還要進一步確認這是否為老年SD大鼠的特有的T細胞表型改變。

檢測結果顯示老年組大鼠的NK細胞和單核細胞比例有明顯升高。這是在外周血白細胞比例下降的基礎上的升高，還需進一步檢測NK細胞和單核細胞功能，探討這種改變的臨床意義。在于昉等[18]的研究中，老年人NK細胞的比例沒有明顯變化，但是在NK細胞毒活性明顯降低。鄧憲等[19]的研究中，老年人單核細胞數上升，與青年人群中單核細胞上升意義不同，在老年人群中可能代表機體衰老和凋亡細胞增多，單核細胞反應性升高。

P16由p16INK4a基因編碼的細胞周期抑制劑，也是一種腫瘤抑制蛋白[20]。研究人員發現老年雄性大鼠脾T細胞P16 mRNA表達明顯高于青年雄性大鼠。老年小鼠中除了脾之外，在腦、心臟、肺和睪丸中也有明顯升高[21]。老年人T細胞p16INK4a的表達量隨年齡的增長呈指數增長[22]。在Melk等[23]的研究中顯示，人腎臟皮層按照年齡分為青年，成年和老年三組，P16的表達量與增齡成正相關。本文與兩個研究結果一致。同時也有文章報道，B淋巴細胞的衰老是由p16INK4a和Arf介導的[24]。在Krishnamurthy等[25]研究認為Ink4a的表達可以作為一種衰老標志物。在Wood等[26]的研究中用T細胞P16表達作為化療和干細胞移植患者的干細胞功能和治療效果的生物學檢測指標。

本文對不同年齡段的大鼠進行外周血和免疫細胞分型測定分析，并與老齡人群進行比較醫學分析，驗證了老年大鼠衰老標志物p16INK4a升高，初步表明增齡對大鼠免疫系統產生了巨大的影響，為研究免疫衰老及老年病提供基礎數據。