復方一枝蒿顆粒離乳前SD大鼠非臨床安全性評價研究

田義超，周 莉，龐 聰，毛閃閃，崇立明，李 俊，李 艷，冷英莉，孫祖越*

(1.湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司，武漢 430075； 2.上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調節藥物毒理檢測中心，上海 200032； 3.新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，烏魯木齊 830013)

兒童處于生長發育的特殊時期，器官的生理功能尚未發育成熟，對藥物的毒性敏感性與成年人具有較大差異[1-2]。近年來，兒科用藥的安全性評價越來越受到重視，2017年國家食品藥品監督管理局藥品審評中心頒布了《兒科用藥非臨床安全性研究技術指導原則(征求意見稿)》[3]，對兒科用藥非臨床安全性評價方案的設計提供了參考依據。復方一枝蒿顆粒為抗感冒的純中藥制劑，主要組成為新疆一枝蒿、板藍根和大青葉等，具有解表祛風、涼血解毒的作用，多年臨床應用表明其對感冒的治療具有顯著療效，在新疆具備良好的民眾基礎和認知度[4-5]。目前，已有文獻報道復方一枝蒿顆粒對剛離乳大鼠非臨床安全性評價的研究，可支持3歲以上兒童用藥的臨床申報[6]，為了擴大用藥人群至1歲以上兒童，充分評價復方一枝蒿顆粒的安全性，本研究選取離乳前SD大鼠為研究對象，并遵照藥物非臨床研究質量管理規范(GLP)進行試驗，為兒童用藥提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD孕鼠(GD15，妊娠第15天)43只，體重360～440 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-002]，幼鼠160只，于PND15開始給藥，體重35～50 g。飼養于湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司屏障系統[SYXK(鄂)2016-0090]，環境溫度20℃～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，換氣次數每小時≥15次，光照每12小時明暗交替。實驗動物的使用遵循3R原則，動物使用前向本機構的動物福利倫理委員會提出申請，批準編號：IACUC(準)-2018-044。

1.2 主要試劑與儀器

復方一枝蒿顆粒干膏粉(新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號：T180422)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，湖州展望藥業有限公司，批號：20170701)；戊巴比妥鈉(德國默克公司，批號：CK1604BM)；血清生化與血液學檢測試劑(希森美康生物科技有限公司)；凝血檢測試劑(美國Instrumentation Laboratory公司)；電解質檢測試劑(梅州康利高科技有限公司)；尿液檢測試劑(長春迪瑞醫療科技股份有限公司)；激素檢測試劑(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

BX-3010全自動生化分析儀、XN-1000IV全自動模塊式血液體液分析儀(日本SYSMEX公司)；Klite8G多參數電解質分析儀(梅州康利高科技有限公司)；ACL TOP300 CTS全自動凝血分析儀(西班牙沃芬公司)；H800干化學尿液分析儀(長春迪瑞醫療科技股份有限公司)；ASP300S全自動脫水儀、RM2235輪轉切片機(德國Leica公司)；Mb-Ⅱ全自動包埋儀(武漢賽爾思科技有限公司)；BX53生物顯微鏡(日本Olympus公司)；iMark酶標儀(美國Bio-RAD公司)；UltraFocus小動物骨密度儀(美國Faxitron公司)；JLBehv-LAG-4自發活動分析系統(上海吉量軟件科技有限公司)；ZH-300B大鼠轉棒式疲勞儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)；1056004大鼠避暗實驗視頻分析系統(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 離乳前大鼠單次給藥毒性實驗

亂作為的背后，往往是扭曲的政績觀在作祟。為了能迅速樹立自己的“能人形象”，充分展示自己的“治理能力”，少數干部特別熱衷上項目，搞工程。而進一步梳理中央“打虎”榜單，我們還不難發現，那些“政績項目”“形象工程”的背后，也往往隱藏著權錢交易的魅影。

圖1 以5只雄性胎仔為例交叉撫育設計舉例Figure 1 Examples of fostering design for 5 male juvenile rats

給藥期結束及恢復期結束，各劑量組血液學和凝血指標與溶媒對照組比較均未見毒理學意義上的差異。

1.3.2 離乳前大鼠重復給藥毒性實驗

購入的36只孕鼠分娩后，其中20窩符合交叉撫育要求(每窩出生的幼鼠數至少4♀4♂)，將母鼠及其幼鼠進行交叉撫育分組，PND1-2仔鼠和母鼠按交叉撫育表分入各窩，各窩按照母鼠編號隨機分為復方一枝蒿顆粒低、中和高劑量組(17.6、44.0和70.4 g/kg)，為藥效學起效劑量的88、220、352倍)和溶媒對照組(0.5% CMC-Na)，每窩含幼鼠4♀4♂，每組幼鼠20♀20♂。幼鼠PND15開始給藥，每天灌胃1次，連續28 d，給藥體積20 mL/kg。每天觀察動物一般癥狀；給藥第1周隔天測1次體重，之后每周測2次；離乳后每周測2次攝食量；指定時間點進行行為學、陰道張開、動情周期、睪丸下降和龜頭包皮腺裂開檢測；解剖前進行眼科和尿液檢查；給藥結束及恢復期結束，分別剖殺2/3和1/3動物，進行血液學、凝血、血液生化、電解質、睪丸精子頭計數、性激素、生長激素、骨骼系統、免疫指標、臟器重量和臟器系數等指標的檢測，并剖檢進行組織病理學檢查。

The ideality factor of the CuInGeSe4/n-Si heterojunction is actually extracted from the slope of the linear part of ln I against the V feature with the aid of the subsequent equation[25]:

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 離乳前大鼠單次給藥毒性實驗

2.2.13 臟器重量及系數

2.2 離乳前大鼠重復給藥毒性實驗

2.2.1 一般癥狀觀察

例3：某高校重大事項未嚴格依法依規進行決策，涉及金額681.9萬元。某高校經校長辦公會研究決定“同意啟動新校區一至六飯堂和舊校區飯堂統一招標工作”，收取承包費。3年合計收取承包管理費 （折舊費）681.9萬元。上述事項雖經集體討論決定，但決策結果不符合教育部《關于進一步加強高等學校學生食堂工作的意見》第二點規定的高校內食堂的建筑設施由該高校統一提供，對承包經營都實行零租賃，免收管理費。

給藥期及恢復期所有大鼠外觀體征、行為活動、姿勢、飲水和被毛，對外界刺激反應、腺體分泌物和呼吸狀態等均正常。

自然科學類、社會科學類說明文閱讀，是廣東語文高職高考的一項重要考查內容，有9分的分值，以選擇題的形式出現?；谄吣陙韽V東省語文高職高考的真題，筆者認為，只要掌握一定的閱讀和答題方法，拿到滿分并非難事，現總結出一些閱讀方法和答題技巧，以供參考。

2.2.2 體重

正因如此，GE Digital的“三步走”發展策略，即GE For GE、GE For Customers、GE For World是很務實的。在邏輯上，前兩步都正確，但第三步踩了“知識壁壘”的紅線，“For World”哪是那么容易？這中間恐怕省略了“For Other Industries”“For USA”等重要步驟，以及為了驗證和優化這些重要步驟所必需的長期沉淀與反復打磨。GE Digital多跨出去的那一步，就是導致其業務停擺的短板——知識壁壘。

高劑量組雄鼠體重第3天至第27天均低于溶媒對照組，高劑量組雌鼠體重第3天至第20天均低于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.01)，其他時間點與溶媒對照組比較無統計學差異(P>0.05)，見圖2。

注：a：雄鼠體重；b：雌鼠體重；與溶媒對照組比較，**P <0.01。圖2 復方一枝蒿顆粒對大鼠體重的影響Note. a, Weight of male rats. b, Weight of female rats. Compared with solvent control group,**P <0.01.Figure 2 Effect of compound Yizhihao particles on body weight of rats

2.2.3 攝食量

2.2.4 生長激素

雌雄鼠各劑量組攝食量與對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。

下次適應算法NF(Next Fit)：最簡單也是最早研究的算法是NF算法。它的特點是至始至終保持一個當前打開的箱子，在要將貨品裝入到箱子時，查看這個貨品能不能裝入到當前打開的箱子，如果可以則裝入。如果沒有辦法裝進去，就新打開一個空的箱子作為當前的箱子，將貨品裝入。這個算法裝箱的效率不高，原因是只有現在打開的箱子和空的箱可以作為選擇裝入貨品。

雌雄鼠各劑量組生長激素與對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。

2.2.5 眼科檢查

給藥期結束及恢復期結束，對各組動物眼睛進行檢查，未發現眼瞼、結膜、角膜、瞳孔和虹膜等組織異常變化。

從表4可以看出不同入料壓力下大直徑旋流器的分級效果。入料壓力為0.09 MPa時，旋流器溢流中小于0.125 mm粒級含量為32.46%，底流中大于0.25 mm粒級含量為67.87%，小于0.125 mm粒級含量為10.74%；旋流器溢流中細粒級含量高，底流中細粒級含量低，說明分級效果良好。

2.2.6 行為學測試

給藥中期、給藥期結束和恢復期結束前，分別進行平衡協調能力、自發活動和學習記憶能力測試，各劑量組行為學指標與溶媒對照組比較均未見毒理學意義上的差異。

2.2.7 生殖功能

給藥期結束及恢復期結束，分別進行性激素水平(雌二醇、睪酮)檢測和雄鼠睪丸精子頭計數，各劑量組生殖功能指標與溶媒對照組比較均未見毒理學意義上的差異。

給藥期結束，雄鼠高劑量組頂臀長和脛骨長小于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.05)，見表1。給藥期結束和恢復期結束，各劑量組骨密度和骨礦含量與溶媒對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.2.8 性發育標志

廣汽新能源智能生態工廠于2017年9月正式開工建設，總投資47億元，占地面積703畝（約46.9萬平方米），是廣汽智聯新能源汽車產業園的首個項目，發揮著帶動產業集聚的龍頭作用。首期生產能力為20萬輛/年，計劃于2019年5月投產。

各劑量組雌鼠陰道張開時間、動情周期數和雄鼠睪丸下降時間、龜頭包皮腺裂開時間與溶媒對照組比較無統計學差異(P>0.05)。

2.2.9 骨骼系統

社區管理者隊伍整體素質的高低，直接關系到社區建設的質量，關系到社區管理科學化水平。如果社區管理者能自覺做到以身作則，勤政廉潔，必將進一步強化服務意識，更好地承擔起黨和人民賦予的光榮使命，為廣大居（村）民服好務。

2.2.10 血液學和凝血

購入的7只孕鼠分娩后，其中5窩滿足交叉撫育要求(每窩出生的幼鼠數至少5♀5♂)，選擇其中3窩(每窩幼鼠體重平均值接近，且體重無統計學差異，剩余2窩淘汰)，見圖1，按照母鼠的隨機號分為復方一枝蒿顆粒低、高劑量組(70.4、88.0 g/kg)和溶媒對照組(0.5% CMC-Na)，每窩含幼鼠5♀5♂，見圖1。幼鼠PND15開始給藥，24 h內單次給藥，給藥體積為20 mL/kg。觀察第1、2、3、5、7、10和14天動物的體重、死亡情況及毒性反應。實驗過程中出現死亡的動物及時進行大體解剖，其他動物在觀察期結束后進行大體解剖，當肉眼觀察組織器官出現體積、顏色、質地等改變時，進行組織病理學檢查。

2.2.11 血液生化、電解質和免疫

給藥期結束及恢復期結束，各劑量組血液生化、電解質和免疫指標與溶媒對照組比較均未見毒理學意義上的差異。

(4)分級機分級效率與磨礦細度之間關系。分級機的分級效率越高，磨機產量和效率也越高；反之，出現過磨現象，導致磨機產量和效率降低，對后續工藝流程影響也很大。

(5)病者困劇身體痛，則謂鬼持杖毆擊之，若見鬼[把]椎鎖繩立守其旁，病痛恐懼，妄見之也。(東漢《論衡》)

2.2.12 尿液

給藥期結束前進行尿液檢測，中、高劑量組尿膽紅素陽性比例高于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.01)，見表2?；謴推诮Y束，各劑量組各尿液指標與溶媒對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。

動物死亡情況：給藥第2天(24 h)高劑量組3只動物(1♂2♀)死亡。雄鼠體重：給藥第2天至第14天低、高劑量組體重出現明顯下降，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.05或P<0.01)。雌鼠體重：給藥第2天低、高劑量組體重出現明顯下降，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.05)，其他時間點未見統計學差異。大體解剖：對給藥第2天死亡的動物進行大體解剖，均可見胃內充滿棕褐色疑似藥物的液體，氣管、食管和肺未見異常；對觀察期結束的動物進行大體解剖，各組織臟器均未發現肉眼可見異常。在本實驗條件下，SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復方一枝蒿顆粒干膏粉的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg。

高原反應極可能造成兒童死亡，并且多為突發癥狀。急診治療和護理高原反應要求護理人員專業，及時，且能夠根據患兒癥狀采取最佳的護理方案。降低反應影響程度，確保患兒健康。對高原反應急診就診患兒護理的具體要求如下。

給藥期結束，低、中和高劑量組肝臟體比及臟腦比均高于溶媒對照組，中、高劑量組肝臟體比高于溶媒對照組，高劑量組肝臟腦比高于溶媒對照組，與溶媒對照組比較具有統計學差異(P<0.05或P<0.01)，見表3?；謴推诮Y束，各劑量組各臟器重量及臟器系數與溶媒對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。

2.2.14 組織病理學檢查

與溶媒對照組相比，高劑量組各臟器未見明顯與受試物相關的病理改變，恢復28 d后，亦未見明顯延遲性毒性病理改變。

表1 復方一枝蒿顆粒對雄鼠骨骼系統的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表2 復方一枝蒿顆粒對大鼠尿液指標的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

表3 復方一枝蒿顆粒對大鼠臟器重量及系數的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.05。

Note. Compared with the solvert control group,*P<0.05,**P<0.05.

3 討論

常規的非臨床毒理學研究通常采用嚙齒類動物(大鼠)和非嚙齒類動物(犬、小型豬等)。大鼠作為實驗模型具有充分的經驗，擁有大量的背景數據，大鼠相應的發育階段，可涵蓋中樞神經系統、骨骼系統、生殖系統、心血管系統、肺臟系統、腎臟系統和免疫系統等靶器官的所有出生后發育階段。同時，復方一枝蒿顆粒的藥效學資料表明對模型大鼠有效[7]，根據原國家食品藥品監督管理總局制定的《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》(2014年)[8]和《兒科用藥非臨床安全性研究技術指導原則(征求意見稿)》(2017年)[3]對動物選擇的建議，本研究采用大鼠作為實驗動物。

幼齡動物非臨床安全性研究受多種因素的影響，最典型的是年齡，初始給藥時動物的發育年齡需與兒科用藥目標人群的年齡相匹配[9-10]。復方一枝蒿顆粒臨床擬用人群為1歲以上幼兒，幼鼠PND15(離乳前)首次給藥，此時動物年齡與臨床擬用兒童年齡相當[11]。

離乳前大鼠非臨床研究中窩的構成(窩內幼鼠的分配方法)有窩內設計(within litter design)、窩間設計(between litter design)、1只幼仔/性別/窩(One pup per sex per litter design)和交叉撫育設計(fostering design)。其中，交叉撫育設計為幼仔出生后，立刻由新的母鼠撫養，每窩的構成都是由其他窩的幼仔組成；新的撫育窩內，無任何同性兄弟姐妹；所有幼仔接受同樣的給藥處理，該設計將窩效應和遺傳傾向最小化[12]，故本研究采用交叉撫育設計方法。

離乳前大鼠單次給藥毒性實驗：①給藥第2天觀察到復方一枝蒿顆粒高劑量組(88.0 g/kg)出現3只幼齡動物死亡，大體解剖胃內有藥液，但肺、食管、氣管未見異常，與灌胃操作失誤無關，與供試品的毒性相關；低劑量組(70.4 g/kg)和溶媒對照組無動物死亡。②給藥第2天低、高劑量組雌雄幼鼠體重出現明顯下降，認為幼齡動物死亡和體重下降原因與大劑量給予受試物后的毒性相關。離乳前SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復方一枝蒿顆粒的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg。

離乳前大鼠重復給藥毒性實驗：①雄鼠高劑量組第3天至第27天體重及雌鼠高劑量組第3天至第20天體重均低于溶媒對照組(P<0.01)，認為大劑量灌胃給予復方一枝蒿顆粒28 d，可減緩雌雄幼齡大鼠的體重增長。②給藥期結束，雄鼠高劑量組頂臀長和脛骨長均小于溶媒對照組(P<0.05或P<0.01)，結合給藥期雄鼠體重明顯下降，認為灌胃給予復方一枝蒿顆粒28 d，可導致雄鼠頂臀長和脛骨長降低。③給藥期結束，雌雄幼齡大鼠中、高劑量組BIL陽性率高于溶媒對照組，結合參考文獻[6]，同樣發現中、高劑量組動物尿液BIL陽性率偏高，但均未檢測到肝組織病理學以及相關血液學和血液生化指標的異常變化。盡管BIL的變化考慮與受試物無關，但建議臨床大劑量長期給予受試物時注意監測這些指標的變化。④給藥期結束，雄鼠低、中和高劑量組肝臟體比及臟腦比與雌鼠中、高劑量組肝臟體比及雌鼠高劑量組肝臟腦比高于溶媒對照組(波動范圍9.2%～20.2%)，結合參考文獻[6]，同樣發現高劑量組動物肝臟體比及臟腦比偏高，本試驗血清ALT、AST等相關指標無異常，肝組織病理學亦未見明顯異常，且恢復期結束肝重量和系數均可恢復，推測該變化為微粒體酶的誘導作用，即肝的適應性反應，而與受試物毒性無關。

綜上所述，在本試驗所設定的條件下，離乳前SD大鼠(PND15)單次灌胃給予復方一枝蒿顆粒的最大耐受量(MTD)為70.4 g/kg，重復灌胃給予復方一枝蒿顆粒28 d毒性實驗的最大無毒反應劑量(NOAEL)為44.0 g/kg。