雌性大鼠生育力與早期胚胎發育毒性陽性模型建立及比較

王 蓉，王 永，駱永偉，許 麗，周 莉，孫祖越

(上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調節藥物毒理學檢測中心，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室，復旦大學生殖與發育研究院，上海 200032)

2012年，參考人用藥品國際協調組織及美國食品藥品監督管理總局等指南[1-4]，原國家食品藥品監督管理總局藥品審評中心頒布了我國的《藥物生殖毒性研究技術指導原則》。依據該指導原則，I段生殖毒性試驗由交配前到交配期直至胚胎著床給藥，而Ⅱ段生殖毒性試驗自胚胎著床至硬腭旨閉合給藥，主要目的在于評價受試物對生殖細胞、受孕和妊娠等親代生殖機能是否產生不良影響，是新藥非臨床安全性評價中判定外源性因素生殖毒性的標準方法[1-5]。

考慮到生殖毒性實驗主要有以下幾個特點：1、SD大鼠交配、接受受試物時間以及分娩時間不同步；2、毒性表現的形式具有蓄積性、遷延性、滯后性和整體性；3、檢測指標及其統計處理呈現多樣性和復雜性；4、窩效應和窩大小不均一等。因此，數據采集、處理、解釋和分析具有一定的復雜性和難點。而陽性對照的設立可以屏蔽干擾因素，平衡非實驗因素對于實驗結果的影響，以利于充分觀察毒性效應。為了對每一次實驗都能做到認真和謹慎，我們認為建立一個良好的陽性模型對大量實驗數據的分析以及對實驗結果的解釋才會充分、真實和可信，是保證實驗順利進行的重要環節[6-7]。

環磷酰胺對動物胎仔的致畸性已得到廣泛接受，常被設定為Ⅱ段生殖毒性實驗的陽性對照受試物。同時，可作為Ⅱ段生殖毒性實驗陽性對照的還有敵枯雙、阿斯匹林、維生素A和反應停等，本研究室也對此進行了系統研究[8]，而鮮有人進行I段生殖毒性實驗陽性對照物敏感性高低的對比研究。現有的文獻報道顯示，CTX的I段生殖毒性研究集中于其對雄性大鼠精子及睪丸生精細胞等毒性[9]，少見對雌性動物毒性的報道。因此，本研究在GLP實驗室條件下，比較雌性SD大鼠于交配前給予不同劑量和頻次的CTX后生殖和發育指標的變化，發現生育力與早期胚胎發育毒性實驗(Ⅰ段)標準化陽性對照模型的建立方案。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠150只，雌雄各半，雌鼠體重170～190 g，6～8周齡；雄鼠體重380～400 g，12～14周齡(均為接收時體重)，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供 [SCXK(滬)2018-0006]，合格證序號0034062。動物飼養于上海市計劃生育科學研究所(中國生育調節藥物毒理檢測中心)SPF級動物房內[SYXK(滬)2018-0017]，室溫20℃～26℃，濕度40%～70%，12 h/12 h光照/黑暗，換氣每小時12次，全新風，自由飲水攝食。本試驗所涉及的動物管理、使用和相關操作均經過中國生育調節藥物毒理檢測中心實驗動物管理和使用委員會(IACUC)批準并嚴格遵循實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷，批準號為(IACUC-20150315-01)。

1.2 主要試劑與儀器

BH-2生物顯微鏡，Olympus公司；PL1501-S電子天平，梅特勒-托利多公司；Zenith 200st酶標儀，Anthos公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及處理

SD大鼠根據體重隨機分為3組，分別為溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和CTX 100 mg/kg組，每組50只，雌雄各半。

溶媒對照組雌性大鼠交配前連續腹腔注射給予生理鹽水14 d至GD7停藥；CTX 100 mg/kg組雌性大鼠于交配前14 d一次性腹腔注射給予100 mg/kg的CTX；CTX 20 mg/kg組雌性大鼠于交配前14 d腹腔注射給予20 mg/kg的CTX，每日1次連續5 d。給藥體積均為10 mL/kg。

1.3.2 體重和攝食量測定

每天觀察1～2次SD大鼠外觀體征、行為活動及死亡等情況，發現死亡或瀕死動物，及時剖檢。每周測定2次體重，每周測定1次攝食量(交配期除外)。

1.3.3 性周期和激素測檢測

式中：Pploss為場景k下的有功損耗；Ri為支路i的電阻；λ為懲罰因子；Pi、Qi分別為支路i的有功、無功功率；Vlim取值滿足當Vi Vimax時，Vlim=Vimax。

各組雌性大鼠按1∶1比例與正常雄性大鼠合籠交配，連續交配2周，每天上午8∶00～9∶30進行陰道涂片檢查，查到精子或陰栓時定為GD0，觀察其性周期(動情間期、動情前期、動情期和動情后期[10])及是否含有精子，計算SD大鼠交配成功的平均合籠時間和交配率；妊娠SD大鼠于GD14處死，2周內仍未交配成功的雌性大鼠于交配結束后24 h處死，處死前采集外周血約2 mL，分離血清，ELISA法測定睪酮(testosterone, T)、雌二醇(estradiol, E2)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone, FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone, LH)和孕酮(progesterone, P)含量。

1.3.4 妊娠終末檢查

孕鼠于GD14處死后記錄黃體數、著床數、子宮連胎重、活胎數、死胎數、吸收胎數，檢查卵巢、子宮以及胎盤、胎鼠外觀，肉眼觀察有異常時進行組織病理學檢查。計算交配率、妊娠率、著床前丟失率(1-著床數/黃體數)、著床后丟失率(1-活胎數/黃體數)、平均著床率、活胎率、死胎率和吸收胎率。2周內未交配成功雌鼠，除不檢查胎鼠、胎盤外，其它解剖后處理方法同交配成功雌鼠。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般狀況及體重

給藥后第5天開始，環磷酰胺組部分雌性SD大鼠均出現眼角、鼻周分泌物增多現象，至給藥后第7天，全部SD大鼠出現該異常，均持續3 d左右基本恢復，CTX 100 mg/kg組2只大鼠伴嘴角潰爛現象，給藥后第10天時其中1只死亡，另一只于給藥后3周基本恢復。溶媒對照組雌性SD大鼠外觀體征、行為活動均未見明顯異常，未出現SD大鼠死亡。

溶媒對照組和CTX 20 mg/kg動物交配前體重均呈逐漸升高趨勢，20 mg/kg組呈升-降-升趨勢，其中第8天和第11天時與溶媒對照組相比降低(P<0.01和P<0.05)，詳見表1。

如表2所示，妊娠期間，溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組增重均呈U型變化趨勢，提示環磷酰胺造成的體重降低可恢復；GD0～GD3至GD10～GD14時，CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組與溶媒對照組相比無明顯差異(P>0.05)。

2.2 攝食量

交配前第1周，CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組雌性SD大鼠攝食量均明顯低于溶媒對照組(P<0.01)；妊娠期第2周，CTX 20 mg/kg組攝食量與溶媒對照組相比降低(P<0.01)，詳見表3。

2.3 性周期

交配期間，溶媒對照組、CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組交配成功及未交配成功雌性SD大鼠均未見明顯性周期異常。上述各組交配成功的平均合籠時間分別為3.83、3.09和3.00 d，與溶媒對照組相比均未見明顯統計學差異。

2.4 激素水平

如表4所示，與溶媒對照組相比，僅CTX 20 mg/kg組T顯著降低(P<0.01)，其它指標均無統計學差異，提示20 mg/kg的CTX給藥方案可能會影響孕鼠卵泡內膜細胞和腎上腺皮質網狀帶細胞睪酮的產生。

2.5 妊娠結局

如表5所示，與溶媒對照組相比，僅CTX 100 mg/kg組著床后丟失率明顯升高(P<0.01)，與CTX處理組妊娠率、著床前丟失率、著床率、平均黃體數和平均著床數均無統計學差異，提示CTX 100 mg/kg的給藥方案僅影響妊娠母鼠著床后參數，不會影響著床前相關參數。

CTX 20 mg/kg組子宮連胎重和CTX 100 mg/kg組的平均活胎數、活胎率、吸收胎率與溶媒對照組相比有統計學差異(P<0.05或P<0.01)，表明CTX 兩種給藥方案均可導致母體黃體功能不足進而無法維持妊娠后子宮內膜的正常生理作用，引起著床后相關指標的異常。

表1 環磷酰胺對交配前SD雌鼠體重的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05,**P<0.01。aCTX 100 mg/kg D11時n=24。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.aCTX 100 mg/kg group withn=24 (D11).

表2 環磷酰胺對SD孕鼠體重的影響

表3 環磷酰胺對SD雌鼠攝食量的影響

注：與溶媒對照組相比，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表4 環磷酰胺對SD孕鼠激素的影響

注：與溶媒對照組相比，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

表5 環磷酰胺對SD雌鼠妊娠結局的影響

注：與溶媒對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P< 0.01.

3 討論

CTX作為一種常見的烷化劑類免疫抑制劑，可以引發SD大鼠體重下降、攝食減低、骨髓抑制、感染甚至死亡等諸多全身毒性癥狀，但除死亡外其他癥狀停藥一定時間后均具有可恢復性[11]。本研究表明，雌性大鼠以2種不同的給藥方案(CTX 100 mg/kg，腹腔注射給藥1次和20 mg/kg，腹腔注射給藥5次)給予CTX后，體重和攝食降低；并出現明顯的眼角、鼻周分泌物增多，偶見皮膚潰爛和死亡，考慮與CTX所致的全身毒性及其恢復性相關。

CTX 20 mg/kg組睪酮顯著低于溶媒對照組，孕酮高于溶媒對照組。據Jarrell等報道[12]，CTX對卵巢具有潛在的毒性作用，對大鼠的急性影響表現為血清雌二醇和孕酮水平降低。結合本研究中SD大鼠激素的變化，認為該給藥方案可輕度影響雌性大鼠卵巢分泌功能，與文獻報道具有較好一致性。

CTX 20 mg/kg和100 mg/kg組總黃體數、平均黃體數、總著床數和平均著床數雖與溶媒對照組相比無統計學差異，但均呈減少趨勢。據朱長林等報道[13]，CTX可使早期胚胎細胞數減少并可影響早期胚胎發育的毒性閾值，但若達到一定閾值，則導致桑椹胚無法生存，呈蛻變狀。因此，本研究采用的兩種給藥方案均可抑制雌性大鼠卵巢排卵數目，進而減少其著床數，與文獻報道具有一致性。另外，兩種給藥方案均可導致吸收胎率和著床后丟失率明顯升高，活胎率和子宮連胎重明顯降低，表明CTX兩種給藥方案均可嚴重影響早期胚胎發育，延緩其生長速度或直接導致其死亡。

綜上，在GLP實驗室條件下，SPF級雌性大鼠于交配前14 d按20 mg/kg和100 mg/kg分別腹腔注射給予CTX 5 d和1 d，每天1次，均可以成功地建立SD雌性大鼠生育力與早期胚胎發育毒性陽性模型。比較兩種給藥方案引發的雌性大鼠妊娠結局發現其中100 mg/kg 腹腔注射給予1次的給藥方案可以導致更多的陽性指標變化(著床后丟失率明顯升高，活胎率和子宮連胎重明顯降低)和更明顯的陽性特征，可以作為雌性大鼠生育力與早期胚胎發育毒性陽性模型的標準化構建方案。

目前，有文獻報道CTX作為烷化劑誘導卵巢功能發生異常[14]，少數實驗室甚至對其進行了比較全面的雌性生殖功能評價研究[15]，雖然彼此間所用的動物品系、給藥途徑、給藥階段、給藥劑量甚至實驗室條件有所不同，得到的陽性指標也不盡相同，但這些陽性結果和本研究得到的相關結果均表明了CTX對I段生殖毒性生殖和發育指標影響的可能。鑒于本研究中仍有一些諸如性周期、激素等指標沒有得到很明顯的陽性結果，因此CTX的給藥途徑、給藥階段和給藥劑量等仍有進一步優化的可能，各實驗室間特別是GLP實驗室間的比對研究也顯得尤為迫切，CTX成為公認的標準化陽性對照受試物，仍然需要進一步的探索研究。