流式細胞儀在GLP體系下性能驗證方法的建立

牟文波，李 慧，安會蘋，程紅旭，王鳳華，靳洪濤,2*，魏金鋒,2*

(1.北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司，北京 100176； 2.中國醫學科學院藥物研究所新藥安全評價研究中心，北京 100050)

流式細胞儀(flow cytometer)主要應用于生命科學的基礎醫學研究，如免疫學、細胞生物學、分子生物學及微生物學等；在臨床醫學應用中，能輔助多種疾病診斷，尤其是白血病的診斷、分型和療效評定；在藥物安全性評價應用中，主要用于免疫細胞和細胞因子的檢測，目前已經成為這些領域研究不可缺少的基本儀器。GLP體系是新藥非臨床安全性評價的一套標準質量規范，目的是保證數據的真實性、準確性和可靠性。根據《藥物非臨床研究質量管理規范》(國家食品藥品監督管理總局令第34號)的規定，研究機構根據研究工作的需要配備相應儀器設備，同時應當進行相應的儀器性能驗證。由于儀器性能驗證是新提出來的要求，目前在GLP體系下還沒有比較成熟的可參考方案，本研究以我國醫藥《YY/T 0588-2017流式細胞儀》[1]為依據，建立了流式細胞儀在GLP體系下性能驗證的方法，主要解決GLP體系下流式細胞儀的驗證問題，符合國內國際最新的要求，為流式細胞儀整體性能評價提供可靠、準確、穩定的依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用SPF級SD大鼠雌雄各一只，雌性動物體重205 g，雄性動物體重261 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]，動物飼養條件為實驗動物設施持續保持屏障環境標準，主要環境指標的控制范圍：室溫20℃～26℃，相對濕度40%～70%，最小換氣次數15次/小時，光照明：暗=12 h：12 h。普通級Beagle犬雌雄各一只，雌性動物體重7.8 kg，雄性動物體重8.1 kg，購自北京瑪斯生物技術有限公司[SCXK(京)2016-0001]；食蟹猴雌性動物體重3.3 kg，雄性動物體重3.6 kg，購自北京協爾鑫生物資源研究所有限責任公司[SCXK(京)2015-0011]。Beagle犬和食蟹猴動物飼養條件均為實驗動物設施持續保持普通環境標準。主要環境指標的控制范圍：室溫16℃～26℃，相對濕度40%～70%，最小換氣次數8次/小時，光照明：暗=12 h：12 h。動物實驗均在北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司動物實驗部屏障動物實驗設施進行[SYXK(京)2015-0021]。實驗期間按動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

真空采血管購自北京積水創格公司；EDTA-K2抗凝管、檸檬酸鈉抗凝管均購自北京協順祥醫療科技有限公司。

流式細胞儀FACSVerseTM型，美國BD公司； T淋巴細胞亞群檢測試劑盒、APC Anti-Rat CD3/PE Anti-Rat CD4/FITC Anti-Rat CD8a、APC Anti-Dog Pan T Cell/PE Anti-Dog CD4/FITC Anti-Dog CD8、PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD3/FITC Mouse Anti-Human CD4/PE MouseAnti-Human CD8、BD FACSuiteTM標準微球(CS&T Research Beads)均購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本采集

積水創格真空采血管，EDTA-K2抗凝管采血，用于前向角散射光(FSC)和側向角散射光(SSC)分辨率驗證實驗，表面標志物重復性驗證實驗。檸檬酸鈉抗凝管采血，用于FSC和SSC分辨率驗證實驗。采集的樣本需是無溶血、無凝血、無脂血的新鮮血樣本。

1.3.2 檢測項目

CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞共3個項目。

1.3.3 性能驗證前準備

在開展驗證實驗前，每批檢測前需要對儀器進行性能質控(performance QC)測定，確認檢測結果在質控范圍內才可以進行相應的性能驗證[2]。樣本處理要嚴格按照標準操作規程(SOP)進行，如果出現室內質控失控或影響檢測結果的其它因素，需要棄去異常數據，重新進行檢測。

1.3.4 前向角散射光(FSC)和側向角散射光(SSC)分辨率

(1)移液器吸取5 μL檸檬酸鈉抗凝Beagle犬雄性動物全血，加入到裝有1 mL鞘液的試管中，充分混勻后上機檢測。

技術要求：檢查FSC和SSC圖，可以分開血小板和紅細胞[3-5]。

(2)移液器吸取100 μL EDTA-K2抗凝全血，溶解紅細胞后上機檢測。

技術要求：檢查FSC和SSC圖，可以分開外周血白細胞三群(包括淋巴細胞、單核細胞、粒細胞)[3-5]。

1.3.5 表面標志物重復性驗證實驗

SD大鼠、Beagle犬和食蟹猴的動物樣品，雌雄各一只，移液器吸取100 μL EDTA抗凝全血，加入已標記好CD3+、CD4+、CD8+試劑，按照T淋巴細胞亞群樣品處理的SOP進行樣品處理，樣品處理完成后進行表面標志物重復性的檢測[6]，每個樣品重復測定10次，分別計算CD3+、CD4+、CD8+百分比結果的變異系數(CV)。

技術要求：陽性百分比結果的變異系數應符合：

(1)陽性百分比大于等于30%時，CV值應不大于8%。

(2)陽性百分比小于30%時，CV值應不大于15%。

圖1 前向角散射光和側向角散射光分辨率檢測結果Figure 1 Test results of the resolution power on FSC and SSC

1.3.6 攜帶污染率驗證實驗

取適量CS&T Research Bead微球，用1 mL鞘液稀釋混勻后上機測試，連續測試3次，計算標定區域的顆粒數，分別記為Hi-1、Hi-2、Hi-3。再進行空白數量測試，連續測試3次，計算標定區域的顆粒數，分別記為Li-1、Li-2、Li-3。按照此操作循環3次，再計算攜帶污染率(Ci)，取最大值。

式中：Ci是第i次循環的攜帶污染率值，i=1～3。

技術要求：攜帶污染率應不大于0.5%。

1.3.7 儀器穩定性驗證實驗

將適量CS&T Research Bead標準微球，加入1 mL PBS充分混勻后上機進行測試，測試完成后，計算標準微球的平均熒光強度(FL1)；環境溫度變化不超過設定溫度的5%時，連續開機8 h后，在流式細胞儀的相同設置條件下重復步驟，得到標準微球的平均熒光強度(FL2)，按公式計算FL1、FL2偏差值(B)[7-8]。

式中：

FL1∶0 h標準微球平均熒光強度值

FL2∶8 h后標準微球平均熒光強度值

技術要求：在8 h內檢測FSC及所有熒光通道峰值平均熒光強度偏差值不超過±10%。

2 結果

2.1 FSC和SSC分辨率

FSC和SSC散點圖中，血小板和紅細胞可以分開，淋巴細胞、單核細胞、粒細胞也可以分開，見圖1，同時均滿足規定的技術要求。

2.2 表面標志物重復性檢測

SD大鼠和Beagle犬動物樣品表面標志物CD3+、CD4+、CD8+百分比重復性檢測結果[9-10]、CV見表1，表2，表3，從表中可以看出，各動物樣品的重復性均滿足規定的技術要求。

2.3 攜帶污染率

流式細胞儀3次檢測的攜帶污染率分別為0.06%，0.07%，0.09%，見表4均滿足規定的技術要求。

2.4 儀器穩定性

2.4.1 環境溫度

0 h條件下，環境溫度為22.5℃。8 h條件下環境溫度為22.0℃。

2.4.2 熒光峰值及偏差值

0 h和8 h檢測FSC及所有熒光通道的峰值平均熒光強度偏差值，見表5和圖2，均滿足規定的技術要求。

表1 表面標志物CD3+百分比重復性檢測結果

表2 表面標志物CD4+百分比重復性檢測結果

2.5 評價與驗證結論

2.5.1 評價

(1)本方法FSC和SSC散點圖可以分開粒細胞、淋巴細胞、單核細胞，也可以分開紅細胞和血小板，分辨率符合方法要求。

(2)本方法表面標志物CD3+、CD4+、CD8+百分比重復性檢測，標準差、變異系數0.94%～4.09%，符合方法要求。

(3)本方法檢測的攜帶污染率分別為0.06%，0.07%，0.09%，符合方法要求。

(4)本方法檢測儀器穩定性，熒光偏差值-2.40%～0.23%，符合方法要求。

2.5.2 結論

通過對上述各項指標的驗證，確認本實驗室具備使用本方法開展檢測的能力。

表3 表面標志物CD8+百分比重復性檢測結果

表4 流式細胞儀攜帶污染率

表5 FSC和各熒光通道0 h、8 h熒光峰值及偏差值

圖2 FSC和各熒光通道0 h、8 h熒光峰值直方圖Figure 2 FSC and histograms of fluorescence peaks at 0 h and 8 h in each fluorescent channel

3 討論

流式細胞術的測定并不是新藥非臨床安全性評價中常規的項目，近年來，隨著免疫治療的增多，對于免疫細胞和細胞因子的測定項目不斷增多，需要較多應用流式細胞儀，因此需要對它進行性能驗證。在GLP體系下，對流式細胞儀的性能驗證，查閱文獻國內外并沒有公認的現行統一的方法。國家食品藥品監督管理局在2017年12月5日發布、2018年12月1日實施醫藥行業標準《YY/T 0588-2017流式細胞儀》，結合經濟合作和發展組織良好實驗室規范原則(OECD SERIES ON PRINCIPLES OF GOOD LABORATORY PRACTICE，OECD GLP)和英國藥品和健康產品管理局(Medicines and Health care products Regulatory Agency, MHRA)對藥物非臨床安全性評價的實驗要求[11-12]，性能驗證涵蓋了儀器正常工作條件，儀器分辨率，樣品表面標志物檢測重復性，攜帶污染率，儀器穩定性等重要的性能指標。

根據藥物非臨床安全性評價的樣本類型，在樣本的選擇上，采用SD大鼠、Beagle犬和食蟹猴的動物樣品，建立適合在GLP體系下的流式細胞儀性能驗證。在儀器的選擇上，本實驗中BD FACSVerseTM流式細胞儀是專為科研應用而設計的三激光八色流式細胞儀，光學設計可以將光在傳輸中的損失降到最低程度，為多色分析實驗帶來高質量的檢測靈敏度和分辨率，保證了檢測數據的可靠性和準確性。儀器操作人員通過規范化的培訓，獲得儀器授權資格，以排除人為的影響因素。流式細胞儀的性能驗證周期，一般情況下一年進行一次。當儀器移機或出現故障后需重新進行性能驗證，驗證成功后儀器才可以使用。

綜上所述，BD FACSVerseTM流式細胞儀檢測性能良好，FSC和SSC分辨率、重復性、攜帶污染率、儀器穩定性均符合行業標準《YY/T 0588-2017流式細胞儀》中的技術要求。對檢測系統的性能驗證有助于規范GLP實驗室的質量管理，提高流式細胞儀檢測結果的可靠性、穩定性和準確性，為藥物非臨床安全性評價提供科學的參考依據，本方法可以為國內其他相關機構流式細胞儀的性能驗證提供可以借鑒的范式。