人臍帶動脈旁、靜脈旁與華通氏膠間充質干細胞的血管生成能力比較及移植安全性評價

楊嫣君，余 飛，丁利軍，盛小強，孫海翔1,

(1. 南京醫科大學鼓樓臨床醫學院生殖醫學中心，南京 210008；2. 常州市第一人民醫院產科，江蘇 常州 213000；3. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心，南京 210008；4. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，南京 210008；5. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院臨床干細胞研究中心，南京 210008)

干細胞在再生醫學領域有巨大的應用潛能，通過干細胞移植、分化與組織再生，可發揮修復機體損傷的作用[1]。其中，間充質干細胞(mesenchyma stem cells, MSCs)具有自我更新和多系分化能力，在多種損傷性疾病治療中具有較好的應用前景[2]。MSCs最早在骨髓中發現，現可從骨髓、外周血、臍帶、胎盤、脂肪等多種組織中分離提取[3-4]。而臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchyma stem cells, UC-MSCs)來源于新生兒臍帶，屬于醫療廢棄物，來源廣泛，取材方便，具有較高安全性，低免疫原性，無倫理爭議，體外增殖能力強等優勢，在組織器官損傷修復應用方面有較好前景[5]。組織損傷后，MSCs可通過向病變部位遷移并增殖分化，直接參與損傷組織重建；其能旁分泌大量生長因子和細胞因子參與組織再生的調節；且其能刺激內皮細胞的分裂、遷移，有利于毛細血管內皮成熟及穩定，協調血管和神經生長，介導組織再生和重塑[6]。

臍帶中有兩條臍動脈(UCAs)和一條臍靜脈(UCV)，周圍包裹華通氏膠。間充質干細胞可以從臍帶的多個區域獲得，包括臍帶動脈旁干細胞(perivascular stem cells derived from umbilical arteries, UCA-PSCs)、臍帶靜脈旁干細胞(perivascular stem cells derived from umbilical vein, UCV-PSCs)和華通氏膠間充質干細胞(mesenchymal stem cells derived from Wharton’s jelly, WJ-MSCs)[7]。研究表明，大部分MSCs來源于組織的血管周圍，血管周圍分布有血管旁細胞(pericytes)，其表達MSCs標記物且有多向分化潛能，是MSCs的祖細胞[8]。來自不同解剖位置的間充質干細胞群具有轉錄組學差異且體內分化潛力不同[9]。研究表明，WJ-MSCs移植小鼠未見明顯毒性反應，異種移植安全可行[10]，但未有UCA-PSCs與UCV-PSCs移植到小鼠體內的安全性研究。因此本研究旨在從臍帶不同組分即臍動、靜脈旁及華通氏膠中分離、培養間充質干細胞，并對其進行擴增、鑒定，比較三種干細胞的生物學特性及血管生成能力的差異，并通過尾靜脈輸注和腹股溝皮下注射，檢測干細胞移植后小鼠的臟器是否成瘤探討其安全性，為臍帶間充質干細胞在組織損傷修復中的進一步臨床應用及篩選最優質的種子細胞提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級NOD-SCID雌鼠60只，鼠齡6周，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]，飼養于鼓樓醫院動物實驗中心屏障環境[SYXK(蘇)2014-0052]。采用12 h/12 h明/暗光照周期(06∶00～18∶00)，溫度22℃，自由飲水和攝食。無菌手術在屏障內實驗室進行，操作遵守江蘇省實驗動物管理條例和動物福利倫理原則。倫理審批號(2018010016)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 材料

臍帶取自于南京鼓樓醫院產科足月順產新生兒廢棄的臍帶組織，產婦知情同意。倫理審批號(SC201800101)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM-LG、bFGF、FBS(美國Gibco公司)；青鏈霉素、非必需氨基酸、全反式視黃酸(美國HyClone公司)；成脂誘導培養基(Adipogenic Differentiation Kit，Gibco)、成骨分化培養基(Osteogenic Differentiation Kit，Gibco)、茜素紅粉末(美國Gibco公司)；油紅O粉末、丙戊酸、丁羥基茴香醚、forskolin(德國Sigma公司)；FITC-CD13抗體、FITC-CD29抗體、FITC-CD45抗體、FITC-CD90抗體、PE-CD105抗體、HLA-DR抗體(美國ebioscience公司)；FITC-CD34抗體、FITC-CD73抗體、PE-CD146抗體(美國BD公司)；NSE抗體、NF-M抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；Matrigel基質膠(美國BD公司)；CD146(ab24577)、PDGFRβ(ab32570)、NG2(ab139406)、α-SMA(ab5694)、熒光標記二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (ab150113)和Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor? 594) (ab150088)(英國Abcam公司)；蘇木素及伊紅(北京天合力恩化學試劑公司)；CO2培養箱(美國Thermo 5400)；流式細胞儀(美國BD FACS Calibur)；熒光顯微鏡(德國 Leica DMR)；倒置顯微鏡(德國Leica DMIL)。

1.3 實驗方法

1.3.1 UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs的原代分離與培養[11]

取新鮮人臍帶7～8 cm，4 h內用PBS(含10%青鏈雙抗)冰上運輸，超凈臺內PBS沖洗，剪刀修齊兩斷面，沿臍帶內血管長軸方向剪開臍帶，用鑷子鈍性分離臍帶動脈和靜脈，仔細剔除血管外膜周圍緊貼血管的華通氏膠組織。將臍帶動脈、靜脈、華通氏膠用PBS洗滌1次后，剪碎至1～2 mm3大小組織塊，組織塊接種于100 mm細胞培養皿，放置于37℃、5% CO2培養箱內4 h。然后緩慢加入5 mL DMEM-LG培養基至100 mm皿中，置于培養箱。第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培養基3 mL、2 mL，之后第二周半量換液2次，之后第三周全量換液2次，期間觀察貼壁細胞爬出情況。3周后細胞長到80%融合時去除組織塊，0.05%胰酶消化，傳代培養。取P3～P5代細胞用于實驗。

1.3.2 細胞表面分子標記物鑒定

取P3代細胞，0.05%胰酶消化后制成單細胞懸液，1200 r/min，離心4 min后棄上清，PBS重懸。每100 μL細胞懸液中含1×105細胞，分別加入FITC標記和PE標記的CD13、CD29、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146與HLA-DR抗體，避光孵育30 min。1200 r/min，離心4 min后棄上清，500 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測，Flowjo 10軟件分析結果。

1.3.3 體外誘導分化

(1)成脂誘導

取P3代細胞以2.0×104/cm2密度接種于24孔板，每孔加500 μL DMEM-LG培養基，培養于37℃、5% CO2培養箱。細胞匯合后換液，對照組3孔換完全培養基，成脂誘導組3孔更換成脂誘導培養基，每3天換液，顯微鏡密切觀察細胞生長情況及形態變化。第21天后細胞中可見脂肪滴，終止誘導并棄去培液，PBS洗3次，每次5 min。室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，500 μL油紅O染液孵育10 min。棄去油紅O染色液，PBS洗3次，每次5 min，空氣干燥，鏡下觀察拍照。

(2)成骨誘導

取質量分數0.1%明膠500 μL平鋪于24孔板，靜置30 min，棄去明膠后，取P3代細胞，以2.0×104/cm2密度接種于24孔板，每孔加入500 μL DMEM-LG培養基，置于37℃，體積分數5% CO2培養箱中培養。待細胞匯合后換液，對照組3孔換完全培養基，成骨誘導組3孔換成骨分化培養基，每3天換液，顯微鏡密切觀察各孔中細胞的生長狀態及形態學改變。3～4周后用茜素紅染液染色，棄去培液，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，500 μL 2%茜素紅染液孵育20 min。棄去茜素紅染色液，PBS洗3次，每次5 min。空氣干燥，鏡下觀察拍照。

(3)成神經誘導

P3代細胞以2.0×104/cm2的密度接種于24孔板中(預先放置經L-多聚賴氨酸處理過的無菌玻片)。添加成神經預誘導液500 μL，預誘導24 h后棄液，PBS洗2次，每次5 min，換成神經分化誘導液500 μL，24 h后加入ATRA(10-7M)和bFGF(10 ng/mL)以維持神經元誘導分化。鏡下觀察細胞生長狀態及形態變化，第7天后出現明顯細胞突觸時，終止誘導，細胞免疫熒光鑒定神經元特異性標志物NSE、NF-M。棄去培液，每孔加預冷的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min，吸盡殘液。每孔加4%多聚甲醛500 μL室溫固定20 min。每孔加PBS 1 mL清洗3次，每次5 min。每孔加含0.5% TRItonX-100的PBS 500 μL，室溫孵育細胞5 min。每孔加含1% BSA的PBS 500 μL洗3次，每次5 min。每孔加含3% BSA、0.1% TRIton X-100的PBS 500 μL，37℃孵育45 min。按1∶100稀釋一抗NSE(sc-292097，1∶100)，NF-M(sc-16143，1∶100)抗體，陰性對照一抗為PBS，4℃孵育過夜，每孔加含1% BSA的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min。1∶200稀釋熒光二抗。每孔加入二抗稀釋液200 μL，37℃避光孵育60 min。每孔加PBST(含0.1% Tween-20的PBS)500 μL避光洗3次，每次5 min。PBST按1∶10000稀釋DAPI，每孔加入稀釋后的DAPI 200 μL，室溫避光孵育5 min。每孔加PBST 500 μL避光清洗3次，每次5 min。載玻片上滴加抗熒光淬滅劑，封片、固定，熒光顯微鏡鏡下觀察NSE和NF-M。

1.3.4 UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs血管旁細胞標記物檢測

取P3代的UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs以2.0×104/cm2鋪于24孔板中(預先放置L-多聚賴氨酸處理的無菌玻片)，培養24 h后，細胞免疫熒光檢測相關標志物。利用CD146(1∶1000)與PDGFRβ(1∶100)，NG2 (1∶500)，α-SMA(1∶500)雙標記免疫熒光染色，4℃過夜后去除一抗，每孔加1% BSA的PBS 500 μL清洗3次，每次5 min。含1% BSA、0.1% TRItonX-100的PBS按1∶200稀釋熒光二抗。每孔加入熒光標記二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor? 488) (1∶200)，Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor? 594) (1∶200) 200 μL，37℃避光孵育60 min。熒光顯微鏡觀察。

1.3.5 體外成環實驗

96孔板中每孔加入50 μL Matrigel基質膠，放入培養箱中，靜置30 min，等待凝膠凝結。取P3代的UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs，每孔分別加5×103的相應干細胞與5×103的臍帶靜脈內皮細胞(HUVECs)，共同接種于凝膠上培養。含0.3 nmol/L的VEGF作為陽性對照組。3 h后觀察血管形成情況，每孔隨機選取6個區域，計數形成的血管環數，分支點及管長度并拍照。

1.3.6 實驗動物分組

60只小鼠稱量體重，按體重大小排序從1到60號，由計算機隨機產生60個隨機數字，根據隨機數字將小鼠分為陰性對照組、UCA-PSCs移植組、UCV-PSCs移植組、WJ-MSCs移植組和陽性對照組，每組12只。計數各組小鼠體重且體重均數間無統計學差異。干細胞移植組半數小鼠經尾靜脈注射含5×106第三代相應干細胞的PBS懸液10 mL，半數小鼠腹股溝皮下注射含1×107第3代相應干細胞的PBS懸液10 mL，陰性對照組每次注射等同體積的PBS，陽性對照組腹股溝注射1×107的人胚胎干細胞。12周后經過病理檢查，觀察腹腔器官有無異常。取各臟器，石蠟包埋后切片，并做 H&E 染色。顯微鏡下觀察組織病理變化以評估三種干細胞移植的生物安全性。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質干細胞形態學觀察

臍帶中有2條臍動脈，1條臍靜脈，螺旋走行，之間環繞著華通氏膠(圖1A)。將臍動脈、臍靜脈、華通氏膠從臍帶中機械分離，組織貼壁法分離UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs，培養約7 d可見少量細胞呈放射狀從貼壁組織塊爬出，呈長梭形且增殖迅速(圖1B-J)。

注：A：人臍帶大體示意圖；B-D：臍動脈、臍靜脈、華通氏膠組織塊；E-G：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞從組織塊中爬出；H-J：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞呈梭形，螺旋狀生長。圖1 分離培養人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞Note. A, Human umbilical cord (UC). B-D, Human umbilical cord arteries (UCA), umbilical cord vein (UCV) and Wharton’s jelly (WJ). E-G, Isolation of umbilical cord artery perivascular stem cells (UCA-PSCs), umbilical cord vein perivascular stem cells (UCV-PSCs) and Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs). H-J, Cells at the third passage showed fibroblastic morphology.Figure 1 Isolation and culture of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

2.2 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質干細胞表面標記物鑒定

取P3代人UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs流式分析其表面標記物，如圖2，UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs均高表達CD13、CD29、CD73、CD90、CD105，不表達或低表達CD34、CD45、HLA-DR。其中CD13、CD29、CD90、CD44、CD105都是間充質干細胞特異性的表面標記，而CD34、CD45是淋巴細胞和造血干細胞的表面標記分子[12]。CD146在UCA-PSCs中表達最高，其次是UCV-PSCs，在WJ-MSCs中表達最少(圖2A-Z’)。

2.3 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質干細胞的體外誘導分化

已有文獻報道，臍帶間充質干細胞可分化為成骨細胞、脂肪細胞和類神經元細胞[13]。為了探討分離的細胞具有多向分化潛能，取第3代UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs，進行體外誘導分化為骨細胞、脂肪細胞以及類神經元細胞。成脂誘導后，細胞形態由長梭形變成圓形，在誘導第12天，UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs細胞內開始出現圓形脂滴，有的相互融合，形成較大的脂滴。在誘導第14天，油紅O染色顯示大小不等的紅色脂滴(圖3A-C)。細胞經成骨誘導后由長梭形變成片狀結構，細胞外基質開始沉積。誘導10 d后，細胞中出現骨性結節，至第21天左右時，細胞形態以多角形為主，中央可見類似結節狀結構。茜素紅染色后，可見細胞中間有鈣化結節出現(圖3D-F)。預誘導液誘導后，少數細胞可見隆狀突起。24 h后更換為成神經誘導液，誘導1 h后部分細胞開始凋亡，可見細胞形態逐漸成為星狀，互相連接，形態具有神經樣特征，折光性增強。細胞免疫熒光結果顯示：UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs經誘導后表達神經元特異性烯醇化酶NSE(圖3G-I)以及神經絲NF-M(圖3J-L)，表現神經樣細胞的特征。誘導分化結果表明UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs均具有多向分化潛能。

2.4 臍帶動脈旁干細胞中PDGFRβ、NG2、α-SMA與CD146的表達情況

通過雙重標記CD146、PDGFRβ、NG2與α-SMA的方法標記血管旁細胞[14]，本研究中，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs在體外擴增后，通過免疫熒光雙重標記CD146與PDGFRβ，可觀察到UCA-PSCs在體外擴增后能表達CD146與PDGFRβ，而UCV-PSCs也能表達較弱的CD146與PDGF-Rβ信號，但是WJ-MSCs基本不表達CD146與PDGFRβ(圖4A-C)，而CD146與NG2，CD146與α-SMA熒光雙重標記結果也表明UCA-PSCs表達更多的血管旁細胞的標記物(圖4D-I)。

注：A-Z’： 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞均高表達CD13、CD29、CD73、CD90、CD105，不表達或低表達CD34、CD45、HLA-DR，CD146在臍帶動脈旁干細胞中表達最高，其次是臍帶靜脈旁干細胞，在華通氏膠間充質干細胞中表達最少。圖2 流式分析檢測臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞的細胞表面標志物Note. A-Z’, UCA-PSCs, UCV-PSCs, and WJ-MSCs were positive for CD13, CD29, CD73, CD90, CD105, negative for CD34, CD45 and HLA-DR. The expression of CD146 in UCA-PSCs was higher than UCV-PSCs and WJ-MSCs.Figure 2 Flow cytometry analysis of UCA-PSCs, UCV-PSCs, and WJ-MSCs surface markers

注：A-C: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成脂肪誘導后可見圓形脂滴，油紅O染色示細胞內紅色脂滴；D-F: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成骨誘導后，光鏡下可見鈣沉積呈類結節狀，茜素紅染色后可見鈣沉積；G-I: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成神經誘導后細胞形成突起，表達神經絲NSE；J-L: UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs成神經誘導后細胞形成突起，表達神經絲NF-M。圖3 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞體外誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞和類神經元細胞Note. A-C, For adipogenic differentiation, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured in adipogenic induction medium for 14 d. The formation of lipid droplets was confirmed by Oil Red O staining. D-F, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured in osteogenic supplemented (OS) medium for 28 d. Calcium deposition was confirmed by Alizarin red staining. G-L, Differentiation of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs to neuronal lineage after 24 h pre-induction and 36 h induction was confirmed by immunofluorescence staining of neuron-specific enolase and neurofilament medium polypeptide.Figure 3 The differentiation of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

注：A-C：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的CD146與PDGFRβ的表達情況；D-F：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的CD146與NG2的表達情況；G-I：人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的CD146與α-SMA的表達情況。圖4 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的血管旁標記物檢測Note. A-C, Representative images of co-staining for the CD146/PDGF-Rβ in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs. D-F, Representative images of co-staining for the CD146/NG2 in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs. G-I, Representative images of co-staining for the CD146/α-SMA in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs.Figure 4 The perivascular markers of UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

2.5 臍帶動脈旁干細胞體外血管形成能力較強

體外成環實驗顯示：UCA-PSCs與HUVEC共培養，種植于matrigel基質膠3 h后成環形成大量樹枝狀的血管環數，多于UCV-PSCs組的血管成環數目，WJ-MSCs組HUVEC體外成環稀少(圖5A-C)。隨機選取6個高倍鏡(100倍)量化血管環數，結果顯示，UCA-PSCs+HUVEC組(17.5 ± 1.48,n=6)環狀結構數目多于UCV-PSCs+HUVEC組(13.83 ± 0.70,n=6,P<0.05)，顯著多于WJ-MSCs+HUVEC組(8 ± 1.29,n=6,P<0.001)。分支點數統計結果顯示，UCA-PSCs+HUVEC組(15 ± 1.16,n=6)顯著多于WJ-MSCs+HUVEC組(7 ± 1.73,n=6,P<0.05)，較UCV-PSCs+HUVEC組(11.33 ± 1.86,n=6,P>0.05)未明顯增加。與WJ-MSCs+HUVEC組[(100 ± 0)%,n=6]相比，UCA-PSCs+HUVEC組[(185 ± 7.64)%,n=6,P<0.01]與UCV-PSCs+HUVEC組[(146.3 ± 12.81)%,n=6,P<0.05]管長度顯著增加(圖5D-F)。以上結果提示，臍帶動脈旁、靜脈旁干細胞尤其是前者的血管形成能力明顯優于華通氏膠間充質干細胞。

注：A-C: 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞與HUVEC共培養3 h促成環圖；D-F: 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的血管環數，分支點與管長度統計。***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05。圖5 人臍帶動脈旁、靜脈旁、華通氏膠間充質干細胞的體外成環實驗Note. A-C, UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs were cultured with HUVEC plating on Matrigel in 96-well tissue culture plates. D-F, The number of tubes, branching point per field and the total length of tubes per field were quantified 3 h after treatment by counting 6 random fields/well under the microscope.***P< 0.001,**P< 0.01,*P< 0.05.Figure 5 In vitro matrigel tube formation assay of UCA-MSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs

注：A-C: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的心肌H&E染色；D-F: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肝H&E染色；G-I: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的脾H&E染色；J-L: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肺H&E染色；M-O: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的腎H&E染色；P-R: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肌肉H&E染色。圖6 NOD-SCID小鼠靜脈輸注干細胞后器官 H&E染色Note. A-C, The H&E staining of heart showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. D-F, The H&E staining of liver showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. G-I, The H&E staining of spleen showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. J-L, The H&E staining of lung showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. M-O, The H&E staining of kidney showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. P-R, The H&E staining of muscle showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups.Figure 6 The H&E staining of organs in NOD-SCID mice with intravenous injection of cells

注：A-C: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的心肌H&E染色；D-F: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肝H&E染色；G-I: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的脾H&E染色；J-L: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肺H&E染色；M-O: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的腎H&E染色；P-R: 臍帶動脈旁干細胞、臍帶靜脈旁干細胞與華通氏膠間充質干細胞組的肌肉H&E染色。圖7 NOD-SCID小鼠腹股溝皮下移植干細胞后器官 H&E染色Note. A-C, The H&E staining of heart showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. D-F, The H&E staining of liver showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. G-I, The H&E staining of spleen showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. J-L, The H&E staining of lung showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. M-O, The H&E staining of kidney showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups. P-R, The H&E staining of muscle showed no significant pathologic changes in UCA-PSCs, UCV-PSCs and WJ-MSCs groups.Figure 7 The H&E staining of organs in NOD-SCID mice with transplantation of cells through the skin in the inguinal region

注：A-B: 人胚胎干細胞移植入NOD-SCID小鼠腹股溝觀察成瘤；C-D:病理觀察可見內胚層的腺管和腔上皮；E: 病理觀察可見外胚層的神經組織；F: 病理觀察可見中胚層的軟骨組織。圖8 人胚胎干細胞腹股溝皮下移植NOD-SCID小鼠成瘤實驗Note. A-B, The transplantation of human embryonic stem cells generated tumor in NOD-SCID mice. C-F, there were three embryonic tissue layers in NOD-SCID mice.Figure 8 The transplantation of human embryonic stem cells to NOD-SCID mice

2.6 臍帶動脈旁、靜脈旁和華通氏膠間充質干細胞移植后臟器形態學觀察

NOD-SCID小鼠經UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs靜脈輸注和腹股溝移植12周后，進行病理檢查，解剖大體觀，均未發生結節或腫瘤形成，心、肝、脾、肺、腎、肌肉等臟器均未見明顯異常，HE染色均未見明顯淋巴細胞浸潤、壞死現象(圖6A-R)(圖7A-R)。陽性對照組NOD-SCID小鼠經胚胎干細胞腹股溝移植后可見直徑約1 cm大小的畸胎瘤形成(圖8A-B)，以及三胚層細胞分化(圖8C-F)。

3 討論

本研究發現UCA-PSCs較UCV-PSCs和WJ-MSCs具有更強的促血管生成能力，且UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs華通氏膠間充質干細胞移植入NOD-SCID小鼠安全可靠，提示其可進一步應用于間充質干細胞移植修復。間充質干細胞移植在組織損傷及隨后的再生修復相關的多種疾病具有治療價值[15]。研究表明，MSCs移植在脊髓損傷、心肌缺血和糖尿病視網膜病變中有較佳的療效[16-18]。MSCs通過分泌各種免疫調節細胞因子，干擾T細胞和樹突細胞功能，局部免疫抑制，發揮修復作用[19]。此外，MSCs通過分泌促血管生成因子促進血管生成，胎盤絨毛膜間充質干細胞具有分泌血管生成因子能力，包括血管內皮生長因子(VEGF)和肝細胞生長因子(HGF)，可改善小鼠缺血下肢的功能[20]；臨床研究也表明，MSCs移植入缺血梗死心肌后，心肌功能得到改善[21]；這些研究提示MSCs分泌的促血管生成因子可以刺激血管生成并增加局部灌注，有利于組織再生。

研究表明，起源于不同組織和位置的MSCs具有不同的功能特性，間充質祖細胞可從血管周圍分離，具有血管旁細胞定位和分子標記物表達鑒定[22]。最新研究表明血管周圍的血管旁細胞(pericyte)是MSCs的前體，維持血管的結構完整性和發育及組織穩態[23]。血管生成的速度與質量是損傷修復關鍵因素，損傷組織必須從血液供應中獲取足夠的養分及氧氣，保證細胞遷移、增殖和分化[24]。血管由內皮細胞和外部的血管旁細胞組成[25]。多種來源的MSCs除了分化為內皮細胞外，還可通過旁分泌血管生成因子，與內皮細胞相互作用以促進血管生成[26]。以往的研究報道人臍帶華通氏膠間充質細胞處于缺乏毛細血管的疏松結締組織中，旁分泌血管生成因子較少，血管生成能力低下[27]。在本研究中，通過體外血管環化實驗和細胞遷移侵襲實驗發現UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs促進體外血管生成能力不同。UCA-PSCs促HUVEC成環和遷移能力皆優于UCV-PSCs和WJ-MSCs。通過雙重標記CD146、PDGF-Rβ、NG2與α-SMA的方法從組織定位血管旁細胞[14]，本研究中，UCA-PSCs在體外擴增后仍能表達特定的血管旁細胞表面標記物CD146、PDGF-Rβ、NG2與α-SMA，表明UCA-PSCs具有更強的體外血管生成能力。

間充質干細胞的應用涉及體外擴增培養和體內注射治療兩個階段，其作為組織修復的巨大潛能種子細胞已應用于多項臨床試驗，但其安全性引起了極大重視。有研究表明，體外擴增的MSCs在移植后可能會發生不良性轉化，存在腫瘤發生的潛在風險。人脂肪間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, Ad-MSCs)在體外長期培養8-10周后，端粒酶活性及細胞周期相關基因失去調節，發生少量染色體畸變[28]；小鼠骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)在體外長期培養后，c-Myc表達增加，且端粒酶活性上調[29]。分化能力檢測是MSCs特異性的分析方法，隨著體外培養時間增加，MSCs分化能力降低，分化成組織細胞種類減少，分化成特定組織細胞的比例降低[30]。本研究中，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs從臍帶中分離獲得足量細胞，體外傳代3～5次應用于實驗，以避免長期培養導致的潛在染色體異常，且其體外具有多向分化潛能，分化能力正常。盡管MSCs顯示出正常的形態學特征和表面標志物，但其在體內注射時可能發生染色體異常并發生不良性轉化，所以體內成瘤實驗是檢測MSCs發生不良性轉化的可靠方法[31]。研究表明，利用WJ-MSCs移植入動物體內可治療多種動物疾病模型，且移植方法安全有效。豬慢性缺血性心肌病模型經冠狀動脈移植WJ-MSCs后無冠狀動脈栓塞等風險，促進心肌再生，改善心功能[32]。兔慢性輸卵管炎模型經靜脈注射WJ-MSCs后，其遷移至受損輸卵管，促進輸卵管上皮細胞再生[33]。WJ-MSCs移植入裸鼠體內安全有效[34]，但尚無臍帶多種來源間充質干細胞的安全性評價研究，因此為了評估UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs的移植安全性問題，我們使用NOD-SCID小鼠進行了干細胞體內移植實驗，將P3代UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs經腹股溝移植或尾靜脈注射的方式移植入小鼠體內，移植后三個月未觀察到腫瘤形成，多器官組織病理學未發現顯著的病理變化。

我們的研究發現，UCA-PSCs、UCV-PSCs與WJ-MSCs經靜脈注射和腹股溝移植都是安全可行的，經靜脈注射MSCs可通過外周免疫調節作用且在炎癥信號引導下經血流遷移到受損區域，減少了遷移至受損區域的細胞數量[35]。而干細胞皮下移植將其可能的免疫調節和營養作用直接集中在受損部位上，而不會產生全身性副作用[36]。但何種移植方式對于干細胞治療疾病更有效尚需討論。