傳統發酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質變化

田星 趙邯 王浩東 任銳 李宗軍

摘 要：研究添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（1∶1）復合發酵劑的發酵肉與自然發酵肉成熟過程中的微生物菌群、理化性質及質構品質變化。結果表明：在成熟過程中，添加發酵劑的發酵肉（實驗組）與自然發酵肉（對照組）相比，酵母菌和腸肝菌數量無顯著差異，而細菌菌落總數、乳酸菌、葡萄球菌數量均有顯著差異（P<0.05）;且實驗組發酵肉的最終pH值、水分含量、亞硝酸鹽含量等理化指標均低于對照組，質構指標均優于對照組;添加發酵劑的發酵肉在微生物菌群多樣性和風味品質等方面均明顯優于自然發酵肉。

關鍵詞：發酵肉;微生物菌群;成熟過程;理化性質

Abstract： In this paper， we analyzed the changes in the microbial flora and physicochemical properties of naturally fermented meat （control） and meat fermented with a mixture of Pediococcus pentosaceus and Staphylococcus xylose （1：1） during the fermentation process. According to the results， there was a significant difference in yeast and enterobacteriaceae counts （P < 0.05） but not in total bacterial， lactic acid bacterial or Staphylococcus counts between the natural and inoculated fermentations. The pH value， moisture and nitrite content of inoculated meat at the end of fermentation were lower than those of the control， while the former was superior to the latter in texture parameters as well as microbial community diversity and flavor quality.

Keywords： fermented meat; microbial flora; ripening process; physicochemical properties

發酵肉制品是指在自然和人工控制條件下利用微生物發酵作用，產生具有特殊風味、色澤和質地且具有較長保存期的肉制品[1]。作為一種古老的肉制品加工貯藏方法，發酵使肉制品具有獨特的風味和良好的咀嚼性，發酵肉制品深受廣大消費者喜愛[2]。發酵肉制品在生產過程中接種的微生物（如乳酸菌、微球菌等）能夠發酵糖類物質形成乳酸[3-5]，從而賦予肉制品特殊的風味，同時，通過產生乳酸降低pH值提高肉制品的安全性、穩定性及貨架期[6-8]。此外，發酵劑的使用對降低肉制品中亞硝酸鹽含量也有一定作用[9]。Nie Xiaohua等[10]研究表明，復合發酵劑能夠加快蛋白質降解，增加風味氨基酸的含量。趙麗華等[11]研究戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）與混合發酵劑（植物乳桿菌和產香葡萄球菌（Staphylococcus carnosus））對羊肉干發酵香腸品質的影響，結果表明，戊糖片球菌能使香腸pH值和水分活度下降。另外，發酵肉制品通過微生物發酵而創造的低pH值環境有利于提高產品穩定性，保存產品的營養價值和品質特性[12]。總之，國內外研究表明，添加發酵劑可以有效改善香腸的品質及貯藏性，提高其食用安全性，且無毒無害，口味適中，迎合了消費者需求，體現了以人為本的生產理念，具有實用價值[13]。隨著對于發酵肉制品研究的不斷深入，發酵肉制品成熟過程微生物菌群變化與其品質的關系有待進一步明晰。

發酵肉成熟過程中微生物菌群和理化性質的變化不盡相同。本研究以同一批次的新鮮優質豬里脊肉為原料，研究添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）的發酵肉與自然發酵肉成熟過程中的微生物菌群、理化性質及質構品質變化，為提高發酵肉制品安全提供理論指導和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮優質豬里脊肉 偉鴻食品股份有限公司;52°高度白酒、食鹽、味精、白糖 長沙嘉而惠超市。

戊糖片球菌 中國科學科院微生物保藏中心;木糖葡萄球菌 傳統湘西臘肉中分離獲取。

MRS培養基、平板計數培養基、MSA培養基、馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養基、結晶紫中性膽堿鹽培養基? ?廣東環凱微生物科技有限公司;三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、乙酸鋅、氨水、醋酸鉛、硫酸鈉、氯化鈉、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀（均為分析純）? ?天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

K9860全自動凱式定氮儀、SH220F石墨消解儀

山東海能科學儀器有限公司;CP114分析天平 奧豪斯儀器有限公司;Testo 250 pH計、LabTech分光光度計

北京萊伯泰科儀器有限公司;D2S2-LJ080高壓滅菌鍋 山東新醫療器械股份有限公司;GZ-250-HSII恒溫恒濕箱

廣智科技設備有限公司;101-3HB干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司;TG16-WS離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;SKY-2102C搖床 上海浦東生物光學儀器廠;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;GZ-250-HSII電熱恒溫水浴鍋 廣東省韶關市廣智科技設備有限公司;GJB1-25均質機 江蘇省金壇市榮華儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

實驗分為2 組，其中1 組添加戊糖片球菌、木糖葡萄球菌（按照體積比1∶1將已活化好菌株濃度為108 CFU/g的發酵劑菌液添加到原料肉中，并與其他輔料充分混合）的發酵劑生產發酵肉，另1 組自然發酵，作為對照組。分別于生肉，腌制1、2 d以及成熟過程中每隔5 d取樣，分別檢測樣品菌落總數、腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌數量的變化，并對其pH值、水分含量、亞硝酸鹽殘留量、食鹽含量等理化指標和質構指標進行測定。各取樣點樣本的微生物指標直接測定，其余樣本真空包裝。

1.3.2 發酵劑的制備

取適量已活化的戊糖片球菌和木糖葡萄球菌菌種，分別接種于MRS肉湯培養基和MSA液體培養基，37 ℃搖床培養24 h后，將已活化好的菌株濃度為108 CFU/g的發酵劑菌液按照肉質量的1%添加到原料肉中并與其他輔料充分混合，進行腌制。

1.3.3 發酵肉的制作

發酵肉制作過程中腌制輔料包括食鹽3%、白糖0.7%、味精0.3%、高度白酒2%、亞硝酸鈉0.008%。發酵肉制作工藝流程如圖1所示。

1.3.4 微生物指標測定

取不同階段的發酵肉，在無菌超凈臺中用刀切碎，取25 g置于含有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，封口后于搖床中振蕩40 min，取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，進行加倍遞增稀釋，分別稀釋至10-3、10-4、10-5，每個稀釋度做3 個平行，用培養基培養。

菌落總數測定：采用PCA平板，37 ℃培養48 h;葡萄球菌菌數測定：采用MSA培養基，37 ℃培養72 h;乳酸菌菌數測定：采用MRS（加入100 mg/L放線菌酮）培養基，37 ℃培養48 h;腸桿菌菌數測定：采用結晶紫中性膽堿鹽培養基，37 ℃培養24 h;酵母菌菌數測定：采用馬丁孟加拉紅-鏈霉菌瓊脂培養基，28 ℃培養72 h。

1.3.5 理化指標測定

1.3.5.1 pH值參考GB/T 10468—1989《食品安全國家標準 食品中pH的測定》中的玻璃電極法。1.3.5.2 水分含量參考GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，采用直接干燥法進行測定。將稱量瓶置于105 ℃的烘箱中烘至恒質量（前后2 次質量差不超過2 mg即為恒質量）;稱取4 g攪碎的試樣，干燥3 h后取出，放入干燥器中冷卻0.5 h后稱質量;重復以上操作至樣品恒質量，每個樣品做3 次平行。

1.3.5.3 亞硝酸鹽殘留量 參考GB 5009.33—2010《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法。

1.3.5.4 食鹽含量 參考GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測定》中的間接滴定法。

1.3.6 質構測定 切取厚度約為1 cm左右的肉片，放在質構分析儀探頭下測定。測定參數：感應元量程450 N;測試高度15 mm;形變量50%;測試速率60 mm/min;起始力5 N;觸發類型：自動;探頭類型P50。

1.4 數據處理 每個樣本測定進行3 次重復實驗，并使用SPSS 24.0軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異顯著，然后使用Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵肉成熟過程中的微生物指標變化

2.1.1 發酵肉成熟過程中菌落總數的變化

小寫字母不同，表示同一發酵階段組間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示同組不同發酵階段差異顯著（P<0.05）。圖3～8同。

由圖2可知，2 組發酵肉菌落總數勻呈現先降低后升高的趨勢，且在發酵前期，實驗組發酵肉菌落總數明顯較對照組下降快，在腌制第2天就已經達到最低值5.69 （lg（CFU/g）），而對照組發酵肉在發酵第5天才達到最低值5.48 （lg（CFU/g））。這是由于在腌制過程中加入發酵劑能夠有效抑制雜菌的生長，并加速發酵進程[14]。

2.1.2 發酵肉成熟過程中葡萄球菌數量的變化

由圖3可知，2 組發酵肉的葡萄球菌數量呈現波動趨勢，即先下降再上升后又有所下降，且2 組存在顯著差異（P<0.05）。這是由于在腌制1 d時加入發酵劑使葡萄球菌數量突升，隨著發酵的進行，葡萄球菌數量因乳酸菌產酸的影響有所下降，之后由于水分含量的降低與鹽含量的增加，乳酸菌數量減少，葡萄球菌耐受性增加，導致葡萄球菌數量有所回升[15]。就對照組而言，隨著發酵的進行，葡萄球菌數量一直處于上升期，由此可以得出，在發酵肉的制作過程中葡萄球菌是優勢菌種。

2.1.3 發酵肉成熟過程中乳酸菌數量的變化

由圖4可知，乳酸菌數量在發酵時波動比較大，且在發酵0 d達到最低值。這是由于原料肉在屠宰、加工、運輸過程中與空氣及器皿的接觸使原料肉未腌制前的乳酸菌數量最高，而在腌制過程中隨著食鹽、發酵劑的加入，在一定程度上抑制了乳酸菌的生長，之后隨著耐受性的增強，乳酸菌數量逐漸上升，但發酵后期實驗組發酵肉鹽含量上升，乳酸菌數量又有下降趨勢[16-18]。在整個發酵過程中，乳酸菌一直是優勢菌，通過競爭作用能有效抑制有害微生物的生長，同時一些乳酸菌能產生細菌素，抑制病原微生物，顯著提高產品的安全性[19-20]。

2.1.4 發酵肉成熟過程中腸桿菌數量的變化

由圖5可知，隨著發酵的進行，發酵肉中腸桿菌數量逐漸下降，且實驗組低于對照組，說明發酵劑對腸桿菌的抑制效果明顯。但發酵結束后腸桿菌數量有上升趨勢，這是由于隨著發酵進程的結束，有害菌的耐受性增強，且在發酵進程中有益菌的分解產物被腸桿菌利用，因此腸桿菌數量在發酵后期有所增加。

2.1.5 發酵肉成熟過程中酵母菌數量的變化

酵母菌是兼性厭氧型菌，有氧氣存在時會大量繁殖，并且能夠生成蛋白酶和脂肪酶，這些對于發酵肉品質有極大影響。由于原料肉以肉塊狀態進行腌制，在腌制過程中，隨著肉內氧氣的消耗，酵母菌的生長受到限制，進行無氧呼吸，產生乳酸，限制雜菌的生長。

由圖6可知，在發酵中后期，由于發酵肉中葡萄球菌數量上升，葡萄球菌中蛋白酶的水解作用使肉制品結構松散，氧氣進入，酵母菌進行大量繁殖，分解產生大量小分子物質，增加了發酵肉的風味品質。

跟蹤檢測生肉，腌制1、2 d，發酵0、5、10、15 d樣本的微生物菌落變化，通過定量分析可知，發酵肉成熟過程中，實驗組與對照組的酵母菌和腸肝菌數量均無顯著差異，而菌落總數、乳酸菌和葡萄球菌數量有顯著差異（P<0.05）。

2.2 發酵肉成熟過程中的理化指標變化

2.2.1 發酵肉成熟過程中pH值的變化

在發酵肉成熟過程中，由于食鹽的加入會殺死部分乳酸菌，使pH值有所上升，但隨著發酵的進行，乳酸菌數量增加，產酸量增加，使pH值降低。

由圖7可知，在發酵第5天時，實驗組發酵肉pH值（5.66）達到最低，而對照組發酵肉pH值在開始發酵時就達到最低值。發酵后期，對照組發酵肉pH值上升較快，發酵結束時略高于實驗組。2 組發酵肉pH值回升的起始時間較早，且產品的最終pH值較高（6.09左右），這可能與添加的發酵劑和發酵溫度（低溫發酵）有關[21]。

2.2.2 發酵肉成熟過程中水分含量和食鹽含量的變化

由表1可知，發酵初期，2 組發酵肉水分含量持續下降，發酵結束時，實驗組水分含量為31.61%，對照組水分含量為40.15%，與原料肉相比水分流失高達30%以上。而實驗組的水分流失量明顯多于對照組，而發酵肉成品水分含量越低，對微生物的抑制能力越強，品質越好。

發酵肉的食鹽含量隨著水分含量的下降呈現出上升趨勢。腌制過程中，隨著腌制時間的增加，發酵肉水分含量發生變化，食鹽含量也逐漸增加。而加入發酵劑后，食鹽含量相比于腌制結束時升高，這可能是由于菌種活化時，液體培養基內殘留有氯化鈉。

發酵過程中，2 組發酵肉水分含量均明顯降低，而食鹽含量則明顯上升。并且，實驗組產品最終食鹽含量顯著高于對照組（P<0.05）。這也充分表明在初始時添加相同量食鹽的情況下，加入發酵劑的發酵肉成品中食鹽含量高于自然發酵肉，能夠更好地抑制有害菌生長，同時產品擁有更好的風味品質，顯著提高了產品的安全性[22-24]。

2.2.3 發酵肉成熟過程中亞硝酸鹽含量的變化

在腌制第1天時亞硝酸鹽同發酵劑一同加入，加入量為80 mg/kg。由圖8可知，發酵前期對于亞硝酸鹽的消耗量較大，其作用為參與色澤的產生及抑制雜菌生長。而實驗組加入發酵劑對于亞硝酸鹽的消耗起促進作用，加速其消耗，從而使亞硝酸鹽含量減少。發酵后期，發酵肉亞硝酸鹽含量有所上升，且實驗組發酵肉的最終亞硝酸鹽含量顯著低于對照組（P<0.05）。總體來說，發酵肉亞硝酸鹽含量的變化與Essid等[17]的結果相一致，并且加入發酵劑能夠明顯抑制發酵后期亞硝酸鹽的形成，減少有毒有害物質的生成，顯著提高產品的安全性[25-27]。

2.4 發酵肉成熟過程中的質構變化

由表2可知，無論是硬度、彈性、咀嚼性還是內聚性，實驗組發酵肉均明顯優于對照組（P<0.05），說明在質構品質方面，相比自然發酵肉，加入發酵劑的發酵肉硬度、彈性、咀嚼性和口感更好。

3 結 論

通過研究發酵成熟過程中添加戊糖片球菌和木糖葡萄球菌復合發酵劑的發酵肉與自然發酵肉的微生物菌群、理化指標及質構品質變化，發現無論是在微生物、理化指標還是風味品質方面，加入發酵劑的發酵肉均優于自然發酵肉。并且與對照組相比，加入發酵劑能夠減少最終產品的亞硝酸鹽含量，同時提高食鹽含量，促進風味物質的形成。因此，推測加入發酵劑可以減少發酵肉中食鹽的用量，同時減少亞硝酸鹽的生成，從而保證產品安全和風味品質。發酵肉通過微生物發酵，其安全性得以提高、風味品質得以改善，而如何生產出高品質、營養、健康的功能性發酵肉制品必將成為肉制品加工行業的又一新熱點[28-30]。

參考文獻：

[1] 郭曉蕓， 張永明， 張倩. 發酵肉制品的營養、加工特性與研究進展[J]. 肉類工業， 2009（5）： 51-54.

[2] 馬菊， 孫寶忠， 郝永清. 國內外發酵肉制品歷史及發展現狀比較[J]. 肉類研究， 2006， 20（9）： 45-47. DOI：10.3969/j.issn.1001-8123.2006.09.019.

[3] 王敏， 李夢璐， 葛慶豐， 等. 微生物外源酶對發酵肉制品品質的影響[J]. 食品與發酵工業， 2012（10）： 134-139.

[4] 王亞男， 馬龍彪， 趙晶， 等. 發酵肉制品的最新研究動態與前景展望[J]. 農產品加工（學刊）， 2012（8）： 88-92. DOI：10.3969/j.issn.1671-9646（X）.2012.08.025.

[5] CASABURI A， DI MARTINO V， FERRANTI P， et al. Technological properties and bacteriocins production by Lactobacillus curvatus 54M16 and its use as starter culture for fermented sausage manufacture[J]. Food Control， 2016， 59： 31-45. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.05.016.

[6] 周光宏. 發酵肉制品加工技術[M]. 北京： 中國農業出版社， 2014： 35-36.

[7] 杜莎. 湘西臘腸理化特性及血液指標和腸道微生物研究[D]. 長沙： 湖南農業大學， 2017： 75-78.

[8] 劉宗敏. 發酵肉制品研究現狀及發展趨勢[J]. 山東食品發酵， 2014（1）： 50-52. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2005.06.035.

[9] 沈清武， 李平蘭. 小片球菌在發酵香腸中的應用： 對產品色澤、質構和感官品質的影響[J]. 中國食品學報， 2003（增刊1）： 58-61. DOI：10.3969/j.issn.1009-7848.2003.z1.013.

[10] NIE Xiaohua， LIN Shengli， ZHANG Qilin. Proteolytic characterization in grass carp sausage inoculated with Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus[J]. Food Chemistry， 2014， 145： 840-844. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.08.096.

[11] 趙麗華， 靳燁， 馬長偉， 等. 戊糖片球菌與復合發酵劑對羊肉干發酵香腸質地剖面分析（TPA）和色澤的影響[J]. 食品科技， 2009（10）： 122-126. DOI：10.3969/j.issn.1009-7848.2003.z1.013.

[12] 郝紅濤， 趙改名， 柳艷霞， 等. 肉類制品的質構特性及其研究進展[J]. 食品與機械， 2009， 25（3）： 125-128.

[13] 杜莎， 譚雅， 謝佳琦， 等. 發酵肉制品品質改善途徑的研究進展[J].?食品工業科技， 2016， 37（16）： 374-378. DOI：0.13386/j.issn1002-0306.2016.16.066.

[14] 張楊萍， 張弘， 余翔， 等. 中式培根制作工藝及其對理化品質指標和蛋白質水解的影響[J]. 食品科學， 2011， 32（4）： 15-20.

[15] 張會麗， 余翔， 張弘， 等. 鱸魚風干成熟工藝及對蛋白質水解和感官品質影響[J]. 食品科學， 2010， 31（16）： 47-51.

[16] 周慧敏， 張順亮， 趙冰， 等. 木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌混合發酵劑對臘肉品質的影響[J]. 食品科學， 2018， 39（22）： 32-38. DOI：10.7506/spkx1002- 6630- 201822006.

[17] ESSID I， HASSOUNA M. Effect of inoculation of selected Staphylococcus xylosus and Lactobacillus plantarum strains on biochemical， microbiological and textural characteristics of a Tunisian dry fermented sausage[J]. Food Control， 2013， 32（2）： 707-714. DOI：10.1016/ j.foodcont. 2013.02.003.

[18] 潘曉倩， 成曉瑜， 張順亮， 等. 不同發酵劑對北方風干香腸色澤和風味品質的改良作用[J]. 食品科學， 2015， 36（14）： 81-86. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201514016.

[19] SANTIAGO R M， ALBERTO M， MARIA JOS? B， et al. Application of Lactobacillus fermentum HL57 and Pediococcus acidilactici SP979 as potential probiotics in the manufacture of traditional Iberian dry-fermented sausages[J]. Food Microbiology， 2011， 28（5）： 839-847. DOI：10.1016/j.fm.2011.01.006.

[20] 扈瑩瑩， 王妍， 于晶， 等. 脂肪添加量對發酵香腸脂質和蛋白質氧化及揮發性化合物形成的影響[J]. 食品科學， 2019， 40（18）： 8-14. DOI：10.7506/spkx1002-6630-20181022-233.

[21] ANGELIKI S D， PANAGIONTA F， STEFAAN D S， et al. Effect of temperature and pH on the community dynamics of coagulase-negative staphylococci during spontaneous meat fermentation in a model system[J]. Food Microbiology， 2018， 76： 180-188. DOI：10.1016/j.fm.2018.05.006.

[22] 蔡魯峰， 杜莎， 譚雅， 等. 乳酸菌肉品發酵劑的發酵特性研究[J]. 食品工業科技， 2015（17）： 108-114. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.17.022.

[23] 杜寶. 不同發酵劑和貯藏溫度對發酵羊肉香腸品質的影響[D]. 呼和浩特： 內蒙古農業大學， 2018： 53-55.

[24] LU Shiling， XU Xinglian， ZHOU Guanghong， et al. Effect of starter cultures on microbial ecosystem and biogenic amines in fermented sausage[J]. Food Control， 2010， 21（4）： 444-449. DOI：10.1016/j.food cont2009.07.008.

[25] MORACANIN S V， STEFANOVIC S， RADICEVIC T， et al. Production of biogenic amines by lactic acid bacteria isolated from uzicka sausages[J]. Procedia Food Science， 2015（5）： 308-311. DOI：10.1016/j.profoo.2015.09.068.

[26] 扈瑩瑩， 溫榮欣， 陳佳新， 等. 低鹽對發酵肉制品品質形成影響及減鹽手段研究進展[J]. 食品工業科技， 2019， 40（16）： 324-335. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2019.16.054.

[27] 朱勝華， 車振明. 微生物在發酵肉制品中的應用[J]. 食品科技， 2011（10）： 112-115.

[28] 龍強， 聶乾忠， 劉成國. 發酵肉制品功能性發酵劑研究現狀[J]. 食品科學， 2016， 37（17）： 263-269. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201617044.

[29] 譚雅， 黃晴， 曹熙， 等. 發酵肉制品中常見有益微生物及其功能研究進展[J]. 食品工業科技， 2016， 37（21）： 388-392. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.067.

[30] 張敬竟， 劉姝韻， 王桂瑛， 等. 干腌火腿的蛋白質組學研究進展[J].?肉類研究， 2017， 31（8）： 60-63. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708012.