凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-質譜法檢測烤鴨鴨皮中16 種多環芳烴

沈習習 戰俊良 湯曉艷

摘 要：建立北京烤鴨鴨皮中16 種多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化-氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測分析方法。勻漿后的烤鴨鴨皮樣品經乙酸乙酯超聲提取20 min，采用GPC凈化，GC-MS進行檢測。結果表明：16 種PAHs在1～100 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好（R2>0.996），檢出限為0.08～0.39 μg/kg，定量限為0.25～1.29 μg/kg;在1、5、10 μg/kg添加水平下，16 種PAHs的回收率為66.2%～108.3%，相對標準偏差為0.7%～13.5%（n=6），滿足分析要求;采用該方法對購自超市的北京烤鴨進行檢測，烤鴨鴨皮樣品中均未檢出苯并（a）芘，苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和?總含量也未超過歐盟限量標準（12.0 μg/kg）。

關鍵詞：烤鴨;多環芳烴;凝膠滲透色譜;氣相色譜-質譜聯用

Abstract： This study established an analytical method for the determination of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in Beijing roast duck skin by gel permeation chromatography （GPC） clean-up combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. After homogenization， samples were extracted ultrasonically with ethyl acetate， and the extract was purified by GPC before being analyzed. The results showed that the calibration curves for the 16 PAHs were all linear in the concentration range of 1–100 μg/L with correlation coefficients （R2） above 0.996， the limits of detection （LOD） ranged from 0.08 to 0.39 μg/kg， and the limits of quantification （LOQ） ranged from 0.25 to 1.29 μg/kg. At spiked levels of 1， 5， and?10 μg/L， the recoveries of the method ranged from 66.2% to 108.3%， with relative standard deviations （RSD） of 0.7% to 13.5% （n = 6）， which met the requirements for quantitative analysis. When this method was applied to Beijing roast ducks purchased from supermarkets， no benzo（a）pyrene was detected in duck skin samples， and the total content of PAH4 （benz（a）anthracene， chrysene， benzo（b）fluoranthene， benzo（a）pyrene did not exceed the EU limit （12.0 μg/kg）.

Keywords： roast duck; polycyclic aromatic hydrocarbons; gel permeation chromatography; gas chromatography-mass spectrometry

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是廣泛存在于環境及各類食品中的一類持久性有機污染物。迄今為止已發現200多種PAHs，其中食品中常見的主要有20 種左右。目前，美國環保署根據PAHs的毒性和分布等數據，將16 種PAHs優先列為污染最嚴重的持久性有機污染物[1]。動物實驗表明，某些PAHs具有基因毒性和致癌性[2-3]，而其他不具有致癌性的PAHs也有毒性增效作用[4]。因此，眾多國家和組織出臺了關于PAHs的限量標準，歐盟（EU）第835/2011號條例規定，煙熏肉類和熏肉制品中，4 種PAHs（苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和?）總量不得超過12 μg/kg，另外單獨規定了苯并（a）芘的限量標準為2 μg/kg[5]。我國GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[6]在PAHs的限量指標上只以苯并（a）芘作為評價食品受PAHs污染的指標，且對肉及肉制品（熏、燒、烤肉類）中的苯并（a）芘限量為5 μg/kg。

肉類食品的煎烤、煙熏和油炸加工是導致其PAHs污染的主要原因[7-12]。“北京烤鴨”歷史悠久，傳統的北京烤鴨有掛爐烤鴨和燜爐烤鴨。掛爐烤鴨采用果木明火烤制，燜爐烤鴨是將鴨子置于植物秸桿燃燒預熱好的爐腔中，采用高溫燜烤[13]。北京烤鴨因其獨特的烤制方式和較高的皮下脂肪含量，在高溫烤制過程中油脂滴落到高溫燃料上熱解，易產生含有PAHs的煙霧，煙霧沉積于烤鴨表面，從而造成鴨皮中PAHs富集污染問題。

目前，針對烤鴨鴨皮中PAHs的檢測手段主要為高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）

法[14-17]。廖倩等[14]采用Florisil固相萃取小柱凈化方法處理烤鴨鴨皮，然后用HPLC法分析鴨皮中3 種PAHs（苯并（a）芘、二苯并（a，h）蒽、7，12-二甲基苯并蒽），方法加標回收率為73.85%～80.31%，3 種PAHs的定量限為0.56～3.19 μg/kg。石金明等[15]取綠色制造技術烤鴨的腿部和胸部鴨皮作為待測樣品，利用HPLC-串聯熒光檢測器對鴨皮中的苯并（a）芘進行測定，結果表明，檢出限為0.04 μg/kg。目前針對鴨皮基質中PAHs的測定方法靈敏度可以滿足相應分析物的檢測要求，但是存在待測目標物種類相對較少、部分目標物回收率偏低的問題。

在相應的前處理過程中，由于烤鴨鴨皮是脂肪含量較高的基質，更容易受脂溶性較強的PAHs污染，因此除脂是檢測烤鴨鴨皮中PAHs的關鍵。常用的烤鴨鴨皮除脂前處理方法是索氏抽提-皂化法[16-17]，該方法除脂效果較好，但有研究表明，在堿性條件下PAHs可能會遭到破壞[18]，

且索氏提取-皂化法操作繁瑣、費時費力，溶劑消耗量大。本研究針對烤鴨鴨皮基質利用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化，結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測的方法，開展烤鴨鴨皮中16 種PAHs的檢測方法研究，為烤鴨鴨皮中PAHs污染的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤鴨樣品為從超市購買的真空包裝北京烤鴨，取其中鴨胸、鴨腿部位鴨皮作為待測樣品。

16 種PAHs標準品：萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并（a）蒽、?、苯并（b）熒蒽、苯并（k）熒蒽、苯并（a）苝、茚苯（1，2，3-cd）芘、二苯并（a，h）蒽、苯并（g，h，i）苝（純度均大于98.0%）?德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;乙酸乙酯（色譜純） 美國Fisher Scientific公司;正己烷、環己烷（均為色譜純） 美國Honeywell公司;無水MgSO4（分析純） 薩恩化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GC/MS-QP2020 GC-MS儀 日本島津公司;Accu-PrepTM MPS-GPC凝膠滲透色譜儀、Bio-Beads SX-3凝膠滲透色譜柱 美國J2 Scientific公司;N-1100D旋轉蒸發儀 東京理化株式會社;Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 德國賀力氏公司;GM200研磨機 德國Retch公司;TTL-DCII氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取16 種PAHs標準品5 mg（精確至0.01 mg），用正己烷溶解并定容至25 mL，制得200 mg/L單標儲備液;然后用正己烷將16 種PAHs單標儲備液混合稀釋定容，配制成各PAHs質量濃度均為10 mg/L的混合標準儲備液，低溫避光保存。使用時用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）配制成所需標準工作液。

1.3.2 樣品處理

用研磨機將鴨皮樣品絞碎混勻，準確稱取4 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管;加入10 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，加1～2 g無水硫酸鎂，渦旋超聲提取20 min，5 000 r/min離心5 min，轉移上清液至100 mL圓底燒瓶，再加入10 mL乙酸乙酯至原離心管重復提取，合并上清液于圓底燒瓶中;上清液在35 ℃水浴中110 r/min旋轉蒸發濃縮至2 mL，濃縮后用乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）定容至10 mL，過0.45 μm濾膜后進行GPC凈化。

GPC凈化條件：選擇苯乙烯樹脂SX-3凝膠色譜柱，流動相為乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V），流速4.7 mL/min，紫外檢測波長254 nm。收集22～45 min流出液于250 mL圓底燒瓶中，于35 ℃水浴中100 r/min旋轉蒸發濃縮至約2 mL，氮吹至近干，以1 mL乙酸乙酯-環己烷（1∶1，V/V）復溶，過0.22 μm濾膜，供上機測定。

1.3.3 GC條件

參照SNT 4000—2014《出口食品中多環芳烴類污染物檢測方法 氣相色譜-質譜法》[19]并作相應改進。色譜柱：Agilent DB-5石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;柱溫程序設定：初始溫度70 ℃，保持2 min，以25 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至200 ℃，然后以8 ℃/min升至280 ℃，保持15 min;進樣口溫度290 ℃;進樣方式為不分流進樣，進樣體積1 μL;載氣為高純氦氣，純度≥99.999%;恒壓模式。

1.3.4 MS條件

離子源：電子轟擊（electron impact，EI）離子源;EI電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度280 ℃;溶劑切割時間3 min;數據采集模式：選擇離子監測模式。16 種PAHs MS測定參數如表1所示。

1.4 數據處理

每個樣品平行測定3 次，實驗數據用Excel軟件進行處理，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 提取劑選擇

PAHs為脂溶性化合物[20-22]，提取試劑常用乙酸乙酯、乙腈、環己烷、丙酮、二氯甲烷、苯等非極性或中等極性溶劑[23-26]。本研究針對烤鴨鴨皮脂肪含量較高的情況，選擇乙酸乙酯、乙腈和乙腈-乙腈飽和正己烷（2∶1，V/V）3 種有機試劑作為提取劑。

由圖1可知，乙腈、乙腈-乙腈飽和正己烷作為提取劑時，部分PAHs回收率較低，采用乙酸乙酯作為提取劑時，提取較充分，按本研究方法進行實驗，16 種PAHs的加標回收率均在60%以上。因此選擇乙酸乙酯作為提取劑。

2.2 提取劑用量和提取時間選擇

研究5、10、15 mL 3 種不同提取劑用量的提取效果。結果表明，乙酸乙酯用量大于10 mL時，16 種PAHs回收率均大于60%。考慮到節約成本問題，選擇乙酸乙酯提取用量為10 mL。

同時，研究10、20、30 min 3 種超聲提取時間的提取效果。結果表明：提取時間為10 min時，約一半PAHs回收率在60%以下;提取時間為20 min時，所有目標物回收率均為60%～120%;提取時間為30 min時，大部分目標物回收率在60%以上，但有個別目標物回收率偏低。考慮到回收率和時間效率，選擇超聲提取時間為20 min。

2.3 凈化條件優化

采用GPC對鴨皮樣品提取液進行凈化，根據不同相對分子質量目標物在色譜柱中保留時間不同實現對目標物的分離[27-28]。凈化環節的關鍵是目標物收集時間段的確定。本研究通過分析鴨皮樣品提取液GPC凈化過程中各組分的紫外吸收譜圖，并與16 種PAHs目標物混合標準液GPC凈化過程中的紫外吸收譜圖進行比較，最終確定GPC凈化過程中PAHs目標物洗脫收集時間段為22～45 min。

2.4 色譜條件優化

由于PAHs屬于非極性或弱極性化合物，因此應選擇非極性或弱極性氣相色譜柱[29-30]。比較Agilent DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、SHIMADZU SH-Rtx-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）和Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）3 種弱極性色譜柱對16 種PAHs的分離效果。結果表明，Agilent DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對16 種PAHs分離效果較好且響應值較高，可較好地滿足檢測分離要求。選用Agilent DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），16 種PAHs的色譜圖如圖2所示。

1. 萘;2. 苊烯;3. 苊;4. 芴;5. 菲;6. 蒽;7. 熒蒽;8. 芘;9. 苯并（a）蒽;10. ?;11. 苯并（b）熒蒽;12. 苯并（k）熒蒽;13. 苯并（a）芘;14. 茚并（l，2，3-cd）芘;15. 二苯并（a，h）蒽;16. 苯并（g，h，i）苝。圖3同。樣品質量濃度50 μg/L。

為盡量消除基質效應對測定結果的影響，采用基質標準曲線對烤鴨鴨皮樣品中的16 種PAHs進行定量分析。將一定量的16 種PAHs混合標準溶液分別加入按照1.3.2節前處理過的空白鴨皮樣品中，使各目標物最終上機質量濃度為1～100 μg/L。以各化合物定量離子峰面積為縱坐標（y），以基質標準溶液質量濃度為橫坐標（x）建立標準曲線，進行線性回歸計算。由表2可知，16 種PAHs在1～100 μg/L質量濃度范圍內線性關系良好。在優化實驗條件下，分別以信噪比不小于3和10確定方法的檢出限和定量限，結果表明，16 種PAHs檢出限為0.08～0.39 μg/kg，定量限為0.25～1.29 μg/kg。

2.6 方法回收率和精密度

取空白鴨皮樣品，分別添加1、5、10 μg/kg 3 個水平的16 種PAHs混合標準溶液，每個水平做6 個平行樣，按照本方法測定回收率，外標法定量。

2.7 實際樣品檢測

從北京市超市購買4 種代表品牌北京烤鴨，每種品牌隨機購買3 只烤鴨樣品，按照已建立的方法進行提取、凈化和分析。實際樣品和加標樣品中16 種PAHs的GC-MS典型色譜圖如圖3所示。

由表4可知，所有烤鴨鴨皮中均未檢出苯并（a）芘，而品牌1、2、3樣品中苯并（g，h，i）苝檢出量較高，最高達34.58 μg/kg。此外，歐盟關于煙熏肉類和熏肉制品中PAHs限量標準規定的4 種PAHs（苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽和?）總量也均未超標（限量標準12 μg/kg）。

3 結 論

采用GPC凈化，建立烤鴨鴨皮樣品中16 種PAHs的GC-MS檢測方法，結果表明，方法線性關系良好（R2>0.996），16 種PAHs的回收率為66.2%～108.3%，RSD為0.7%～13.5%（n=6），檢出限為0.08～0.39 μg/kg，定量限為0.25～1.29 μg/kg。該方法凈化效果好、回收率高、靈敏度好，適用于烤鴨鴨皮樣品中16 種PAHs的痕量檢測分析，為我國傳統烤鴨加工過程中PAHs的質量監控和烤鴨產品質量安全監管提供了方法參考和技術支撐。

參考文獻：

[1] National Institute of Standards and Technology. Standard? reference material 1647e[S]. Gaithersburg： NIST， 2006. https：//www-s.nist.gov/srmors/certificates/archive/1647e.pdf.

[2] NIEHOFF N， WHITE A J， MCCULLOUGH L E， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons and postmenopausal breast cancer： an evaluation of effect measure modification by body mass index and weight change[J]. Environmental Research， 2017， 152： 17-25. DOI：10.1016/j.envres.2016.09.022.

[3] KNIZE M G， SALMON C P， PAIS P， et al. Food heating and the formation of heterocyclic aromatic amine and polycyclic aromatic hydrocarbon mutagens/carcinogens[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology， 1999， 459： 179-193. DOI：10.1007/978-1-4615-4853-9_12.

[4] European Commission. Scientific committee on food： opinion of the scientific committee on food on the risks to human health of polycyclic aromatic hydrocarbons in food[S]. Geneva： European Commission， 2002. https：//ec.europa.eu/food/sites/food/files/safety/docs/sci-com_scf_out153_en.pdf.

[5] European Commission. Commission regulation （EU） No 835/2011 of 19 August 2011 amending regulation （EC） No 1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in food stuffs[S]. Geneva： European Commission， 2011. http：//eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/？qid=1504679439458&uri=CELEX：32011R0835.

[6] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會， 國家食品藥品監督管理總局. 食品安全國家標準 食品中污染物限量： GB 2762—2017[S]. 北京： 中國標準出版社， 2017： 10.

[7] SINGH L， VARSHNEY J G， AGARWAL T. Polycyclic aromatic hydrocarbons formation and occurrence in processed food[J]. Food Chemistry， 2016， 199： 768-781. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.12.074.

[8] OZ F， YUZER M O. The effects of cooking on wire and stone barbecue at different cooking levels on the formation of heterocyclic aromatic amines and polycyclic aromatic hydrocarbons in beef steak[J]. Food Chemistry， 2016， 203： 59-66. DOI：10.1016/j.foodchem.2016.02.041.

[9] 屠澤慧， 聶文， 王尚英， 等. 燒烤及煙熏肉制品中多環芳烴的遷移、轉化與控制研究進展[J]. 肉類研究， 2017， 31（8）： 49-54. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708010.

[10] LEDESMA E， RENDUELES M， D?AZ M. Contamination of meat products during smoking by polycyclic aromatic hydrocarbons： processes and prevention[J]. Food Control， 2016， 60： 64-87. DOI：10.1016/j.foodcont.2015.07.016.

[11] LEE J G， KIM S Y， MOON J S， et al. Effects of grilling procedures on levels of polycyclic aromatic hydrocarbons in grilled meats[J]. Food Chemistry， 2016， 199： 632-638. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.12.017.

[12] VIEGAS O， NOVO P， PINTO E， et al. Effect of charcoal types and grilling conditions on formation of heterocyclic aromatic amines （HAs） and polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in grilled muscle foods[J]. Food and Chemical Toxicology， 2012， 50（6）： 2128-2134. DOI：10.1016/j.fct.2012.03.051.

[13] 陳晨文. 北京烤鴨溯源、用料及烤制方法[J]. 烹調知識， 2016（5）： 52-53.

[14] 廖倩， 高振江， 張世湘， 等. 高效液相熒光法測定“北京烤鴨”鴨皮中的多環芳烴[J]. 食品科學， 2009， 30（10）： 149-152. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2009.10.029.

[15] 石金明， 王園， 彭增起， 等. 基于綠色制造技術的烤鴨品質特性與安全性研究[J]. 食品科學， 2014， 35（23）： 274-278. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201423053.

[16] LIN G F， WEIGEL S， TANG B， et al. The occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons in Peking duck： relevance to food safety assessment[J]. Food Chemistry， 2011， 129（2）： 524-527. DOI：10.1016/j.foodchem.2011.04.052.

[17] 姜新杰， 高振江， 楊文俠， 等. 高效液相色譜法測定“北京烤鴨”中多環芳烴含量的研究[J]. 現代生物醫學進展， 2007， 7（11）： 20-22.

[18] MOTTIER P， PARISOD V， TURESKY R J. Quantitative determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in barbecued meat sausages by gas chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2000， 48（4）： 1160-1166. DOI：10.1021/jf991205y.

[19] 中華人民共和國浙江出入境檢驗檢疫局， 中華人民共和國山東出入境檢驗檢疫局. 出口食品中多環芳烴類污染物檢測方法 氣相色譜-質譜法： SNT 4000—2014[S]. 北京： 中國標準出版社， 2014.

[20] PURCARO G， MORET S， CONTE L S. Overview on polycyclic aromatic hydrocarbons： occurrence， legislation and innovative determination in foods[J]. Talanta， 2013， 105（4）： 292-305. DOI：10.1016/j.talanta.2012.10.041.

[21] SURMA M， SADOWSKAROCIEK A， CIE?LIK E. The application of d-SPE in the QuEChERS method for the determination of PAHs in food of animal origin with GC-MS detection[J]. European Food Research and Technology， 2014， 238（6）： 1029-1036. DOI：10.1007/s00217-014-2181-4.

[22] LORENZO J M， PURRI?OS L， FONT?N M C G， et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in two Spanish traditional smoked sausage varieties： “Androlla” and “Botillo”[J]. Meat Science， 2010， 86（3）： 660-664. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.05.032.

[23] KAO T H， CHEN S， CHEN C J， et al. Evaluation of analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons by the QuEChERS method and gas chromatography-mass spectrometry and their formation in poultry meat as affected by marinating and frying[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（6）： 1380-1389. DOI：10.1021/jf204650u.

[24] URBAN M， LESUEUR C. Comparing d-SPE sorbents of the QuEChERS extraction method and emr-lipid for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAH4） in food of animal and plant origin[J]. Food Analytical Methods， 2017， 10（7）： 1-14. DOI：10.1007/s12161-016-0750-9.

[25] FORSBERG N D， WILSON G R， ANDERSON K A. Determination of parent and substituted polycyclic aromatic hydrocarbons in high-fat salmon using a modified QuEChERS extraction， dispersive SPE and GC-MS[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2011， 59（15）： 8108-8116. DOI：10.1021/jf201745a.

[26] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會， 國家食品藥品監督管理總局. 食品安全國家標準 食品中多環芳烴的測定：

GB 5009.265—2016[S]. 北京： 中國標準出版社， 2016.

[27] HOLDING S R. Gel permeation chromatography[M]// The dictionary of genomics， transcriptomics and proteomics. New York： John Wiley &?Sons， 2015. DOI：10.1002/9783527678679.dg04744.

[28] 王靜靜， 李學才. 凝膠滲透色譜的應用及進展[J]. 農業開發與裝備， 2017（10）： 35; 45. DOI：10.3969/j.issn.1673-9205.2017.10.028.

[29] GOODNER K L. Practical retention index models of OV-101， DB-1，

DB-5， and DB-Wax for flavor and fragrance compounds[J]. LWT-Food Science and Technology， 2008， 41（6）： 950-958. DOI：10.1016/j.lwt.2007.07.007.

[30] 吳雪美. 食品中多環芳烴類物質分析方法比較研究[D]. 杭州： 浙江工商大學， 2008： 52-57. DOI：10.7666/d.Y1376091.