發酵肉用凝結芽孢桿菌的篩選及其發酵特性

黃雨霞 李鵬飛 武瑞赟 張瑩 李平蘭

摘 要：通過測定菌株的發酵特性進行初篩和復篩，最終篩選得到1 株能耐受5 g/100 mL NaCl和150 mg/kg NaNO2、抑菌特性優良、發酵酶系豐富的菌株L-H7，經形態特征、生理生化、16S rDNA鑒定為凝結芽孢桿菌。模擬發酵香腸實驗結果顯示，采用凝結芽孢桿菌L-H7、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌復配發酵制備的香腸在發酵期間具有良好的產香氣特性，其揮發性風味物質中含有1-辛烯-3-醇、癸酸乙酯、壬醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛等特有的香氣物質，說明凝結芽孢桿菌L-H7具有作為發酵香腸功能性發酵劑的潛力。

關鍵詞：凝結芽孢桿菌;發酵香腸;篩選

Abstract： Primary and secondary screening of 41 acid-producing strains of Bacillus for their fermentation characteristics was carried out in this study. Finally， we obtained one strain， L-H7， with tolerance to 5 g/100 mL NaCl and 150 mg/kg NaNO2， excellent antibacterial properties and rich fermentation enzymes. The strain was identified as Bacillus coagulans by morphological characteristics， physiological and biochemical tests and 16s rDNA sequence analysis. Experiments on simulated fermented sausages showed that fermented meat inoculated with a mixture of Bacillus coagulans， Pediococcus pentosaceans and Staphylococcus xylose had good aroma characteristics during fermentation. Its volatile flavor substances included 1-octenen-3-ol， ethyl caprate， nonanal， （E，E） -2，4-decadienal and other unique aroma substances， indicating that Bacillus coagulans L-H7 has the potential for use as a functional starter culture for the production of fermented sausages.

Keywords： Bacillus coagulans; fermented sausage; screening

傳統發酵香腸中使用的發酵劑主要為乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母菌及霉菌[1]。發酵劑能夠提高食品的營養價值和風味，保證食品的安全性并延長食品保質期[2-3]，

部分發酵劑還能通過自身的益生特性提升產品的功能價值[4]。為篩選得到具有優良發酵特性的微生物，國內外學者進行了大量研究，主要集中在改善風味和提升營養價值方面。劉英麗等[5]篩選得到5 株乳酸菌，將它們與酵母菌復配接種于香腸發酵，結果表明，香腸中醇類揮發性物質含量增多，并產生特有的四甲基吡嗪。Song等[6]將健康韓國嬰兒糞便樣品中分離的益生菌Bifidobacterium longum KACC 91563用作發酵香腸的功能性發酵劑，結果表明，益生菌組的脂質氧化水平較低，總不飽和脂肪酸含量和ω-6/ω-3不飽和脂肪酸含量高。

當前，含有乳酸菌和雙歧桿菌等益生菌的功能性食品開發受到越來越多的關注，但將益生菌應用于發酵肉制品中是一個巨大的挑戰，因為食品加工和貯藏過程中的惡劣環境會影響其存活率[7]。因此，篩選具有良好抗逆性的益生菌菌株，將其應用于發酵香腸，對于香腸營養價值和感官特性的提升均有重要意義。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧、產乳酸的芽孢菌[8]。凝結芽孢桿菌不僅具有乳酸菌的特性，而且具備芽孢菌酶系豐富、抗逆性強、耐高溫、易貯存的特性[9]，對發酵環境具有更強的耐受性，在發酵食品中有潛在的應用價值。凝結芽孢桿菌具有蛋白水解和脂肪水解活性。Keller等[10]采用體外模型研究凝結芽孢桿菌GBI-30，6086對植物蛋白的消化作用，證明其可釋放肽酶，促進機體對蛋白質的消化吸收。Gowthami等[11]通過統計優化得到橄欖（0.5%）、吐溫-80（0.6%）和FeSO4（0.05%）的最優添加量，使凝結芽孢桿菌VKL1在培養基中的脂肪酶產量增加3.2 倍。此外，凝結芽孢桿菌與部分乳酸菌和雙歧桿菌一樣具備益生特性，相比營養體形式，凝結芽孢桿菌的孢子對胃酸和消化酶的耐受性更強[12]，能夠促進營養物質的吸收[13]、調節腸道菌群平衡[14]、提高機體免疫力[15]并改善腸道功能紊亂[16]。因此，凝結芽孢桿菌是一種潛在的功能性發酵劑。

本研究旨在篩選具有優良發酵特性的凝結芽孢桿菌，探究其發酵特性。通過篩選得到產酸快、耐鹽、抑菌特性優良且發酵酶系豐富的凝結芽孢桿菌，并通過模擬發酵香腸模型評價其在發酵香腸中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株由中國農業大學應用微生物實驗室提供;MRS培養基、MSA培養基、蛋白胨、牛肉浸粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈣、葡萄糖（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）MasterMix?天根生化科技有限公司;API ZYM酶活性試劑條 梅里埃診斷產品（上海）有限公司;戊糖片球菌、木糖葡萄球菌凍干菌粉 上海昊岳食品科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AOC-5000自動固相萃取儀、QP2010 plus氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司;UV-1800紫外分光光度計?上海美譜達儀器有限公司;SW-CJ-2D2G2F2FD超凈工作臺 上海蘇凈實業有限公司;DNP-9162恒溫培養箱? ?上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凝結芽孢桿菌的初篩

取實驗室前期從食品中分離保藏的41 株產酸芽孢菌進行初篩，對菌株分別進行接觸酶、發酵葡萄糖產酸產氣、產黏、產H2S、精氨酸產氨、氨基酸脫羧實驗以及蛋白酶、脂肪酶檢測實驗，篩選符合發酵特性的菌株進行進一步篩選。

1.3.2 凝結芽孢桿菌的復篩

1.3.2.1 菌株產酸能力測定

菌株以2%（體積分數，下同）的接種量接種于MRS培養基中，37 ℃培養24 h后測定培養液pH值。

1.3.2.2 菌株耐鹽性及耐亞硝酸鹽性測定

菌株活化后以2%的接種量接種于分別添加5 g/100 mL NaCl、150 mg/kg NaNO2的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，用紫外分光光度計測定其在600 nm波長處的吸光度，與空白MRS肉湯培養基對照，確定其生長情況。

1.3.2.3 菌株抑菌特性測定

采用牛津杯瓊脂擴散法篩選抑菌性能較好的菌株。預先在無菌平皿中加入適量1.5 g/100 mL的素瓊脂，凝固后，放入牛津杯（直徑8 mm）;向15 mL半固體培養基（含0.6 g/100 mL瓊脂）中加入10 μL指示菌（單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌），倒入含有瓊脂的平皿中，凝固后，取出牛津杯，每孔分別加入200 μL的細菌發酵液和空白MRS培養基（對照），在最適溫度（37 ℃）條件下培養24 h后觀察抑菌效果。

1.3.2.4 菌株發酵酶系鑒定

利用API ZYM酶活性試劑條鑒定發酵酶系，通過顏色強度（0～5）確定酶的活性，0表示無酶活性，1～5分別對應5、10、20、30、40 nmol水解底物[17]。

1.3.3 凝結芽孢桿菌的鑒定

1.3.3.1 形態學觀察

篩選后的菌株在MRS固體平板上劃線，37 ℃培養24 h，觀察菌落的大小、邊緣、表面、透明度等形態特征。對菌株進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的細胞形態。

1.3.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[18]和《常見細菌系統鑒定手冊》[19]對菌株的生理生化特征進行鑒定。

1.3.3.3 16s rDNA分子生物學鑒定

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的DNA。以提取的DNA為模板，利用正向引物27F和反向引物1492R進行PCR擴增，PCR擴增反應體系（20 μL）：2×Mix 20 μL、引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）2 μL、引物1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 14 μL。PCR反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、40 s，50 ℃、40 s，72 ℃、90 s，30 個循環后72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增后的PCR產物進行分析，之后由北京博邁德基因技術有限公司進行測序，測序結果與Genbank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的數據進行Blast對比分析，下載近源物種菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 6.0軟件繪制系統發育樹。

1.3.4 凝結芽孢桿菌L-H7的生長特性和產酸能力測定

將凝結芽孢桿菌L-H7以2%的接種量接種于MRS培養基，37 ℃靜置培養，每4 h取樣測定菌液pH值，并用紫外分光光度計測定其在600 nm波長處的吸光度。

1.3.5 凝結芽孢桿菌L-H7在模擬發酵香腸中的應用

1.3.5.1 發酵香腸模型的制備

參照Almeida等[20]的方法，制備燒杯香腸模型（Beaker sausage models，BS），略有改動。選用豬背脊肉，將質量比7∶3的瘦肉和肥肉斬拌后加入3%鹽、0.35%葡萄糖混勻后接種發酵劑，以戊糖片球菌和木糖葡萄球菌為對照，通過接種不同組合發酵劑制備5 組發酵香腸模型：BS-1：接種戊糖片球菌（7 （lg（CFU/g）））+木糖葡萄球菌（7 （lg（CFU/g）））;BS-2：接種凝結芽孢桿菌（7 （lg（CFU/g）））;BS-3：接種戊糖片球菌（7 （lg（CFU/g）））;BS-4：接種凝結芽孢桿菌（7 （lg（CFU/g）））+木糖葡萄球菌（7 （lg（CFU/g）））;BS-5：接種凝結芽孢桿菌（7 （lg（CFU/g）））+戊糖片球菌（7 （lg（CFU/g）））+木糖葡萄球菌（7 （lg（CFU/g）））。將肉糜灌入無菌離心管中，封口膜封口后于恒溫培養箱中25 ℃發酵2 d，然后將溫度調至15 ℃發酵5 d。

1.3.5.2 發酵期微生物指標及pH值測定

微生物指標測定：在無菌條件下去除香腸腸衣，取10 g香腸于無菌均質袋中，加入90 mL無菌生理鹽水，充分拍打均質后取適量樣液進行梯度稀釋后，選擇適宜的梯度傾注平板，并在適宜溫度下培養48 h后計數。乳酸菌和凝結芽孢桿菌的總菌落數測定選用MRS培養基，葡萄球菌總菌落數測定選用MSA培養基。

pH值測定：稱取香腸樣品10 g于90 mL無菌生理鹽水中，充分拍打均質后，用pH計測定濾液的pH值。

1.3.5.3 揮發性風味化合物分析

取發酵后的香腸樣品5 g置于20 mL頂空瓶內，參照Sidira等[21]的方法，略有改動，采用頂空固相微萃取法提取揮發性化合物，再通過氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatograph-mass spectrum，GC-MS）對化合物進行分離并分析。

固相微萃取條件：采用65 μm PDMS/DVB萃取頭，將樣品置于50 ℃條件下平衡20 min后，將萃取頭插入頂空瓶中萃取40 min，最后將萃取頭拔出并置于200 ℃的進樣口中解吸2 min。

GC條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱溫箱初始溫度40 ℃，進樣口溫度200 ℃，不分流進樣，載氣流速1 mL/min，柱溫箱升溫程序為40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。MS條件：離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度250 ℃，采用全掃描模式采集信號，掃描范圍m/z 35～500。使用NIST 11數據庫對未知揮發性化合物譜圖進行比對，并采用面積歸一化法進行定量。

1.4 數據處理

所有實驗重復3 次，使用Microsoft Office Excel軟件進行數據分析處理和作圖，并用SPSS 23軟件進行方差分析，P<0.05表示差異顯著，結果有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌的初篩結果

取41 株實驗室前期分離保藏的具有產酸能力的芽孢菌進行初篩，由表1可知，篩選出13 株接觸酶陽性、發酵葡萄糖產酸不產氣、不產黏、精氨酸不產氨、氨基酸脫羧酶陰性、不產H2S、產蛋白酶和脂肪酶的菌株。

2.2 凝結芽孢桿菌的復篩結果

2.2.1 菌株產酸能力、耐鹽性、耐亞硝酸鹽性及抑菌性

由表2可知，產酸能力實驗結果顯示，13 株菌株在MRS培養基中培養24 h后，除L-H3、L-D2、L-D6、L-Y9、L-Y14、L-M4外，其余菌株培養液pH值均可降至4.5以下。

發酵香腸中的鹽含量較高，在成熟結束時，NaCl含量達到3.0%～5.0%[22]，因此篩選的菌株必須耐受5 g/100 mL NaCl和150 mg/kg NaNO2，且具備抑制食源性病原菌的能力。13 株菌株對150 mg/kg NaNO2均有很好的耐受性，但部分菌株無法耐受5 g/100 mL NaCl。對致病菌的抑菌結果顯示，菌株L-H7、L-H8、L-S9的抑菌特性較好。綜合以上結果，選擇菌株L-H7、L-H8、L-S9作為優良發酵劑的候選菌株。

2.2.2 菌株發酵酶系的鑒定結果

發酵香腸成熟過程中的代謝是內源酶與細菌代謝之間復雜相互作用的結果，因此分析發酵微生物的酶譜對于控制發酵香腸的品質具有重要意義。采用API ZYM試劑條檢測參與碳水化合物、蛋白質、脂質和磷酸鹽代謝的幾種酶活性。

由表3可知，菌株L-H7、L-S9表現出較強的肽酶活性（亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶），Papamanoli等[23]在從希臘自然發酵香腸中分離出的菌株清酒乳桿菌、副干酪乳桿菌和植物乳桿菌中同樣檢測到這些蛋白酶具有很強的活性。菌株L-H7和L-H8表現出較好的酯酶活性，酯酶的作用主要是促進酯類風味物質的形成，有利于促進發酵香腸的風味形成。同樣，相比于菌株L-S9，菌株L-H7和L-H8表現出較高的磷酸水解酶活性，對有機磷化合物的降解有重要作用[17]。與其他2 株對照菌相比，菌株L-H7的糖苷酶種類最多，且活性最強。糖苷酶主要參與碳水化合物代謝，香腸中酸的產生取決于添加到肉混合物中糖的類型和濃度、干香腸的直徑和發酵微生物群[24]，因此微生物分泌的糖苷酶類型和活性對于香腸發酵過程中快速產酸具有重要意義。綜合以上實驗結果，選擇酶系豐富的菌株L-H7作為候選菌株進行鑒定。

2.3 凝結芽孢桿菌的鑒定結果

2.3.1 形態學觀察結果

A. 菌落形態;B. 菌體形態。

由圖1可知，菌株L-H7在MRS培養基上生長情況良好，37 ℃培養48 h后可形成直徑2～3 mm的圓形菌落，菌落表面光滑、不透明，邊緣較規則，中心凸起（圖1A）。油鏡觀察菌體細胞形態，菌株為革蘭氏陽性菌，呈長桿狀，成對或鏈狀排列（圖1B）。

2.3.2 生理生化鑒定結果

由表4可知，菌株L-H7的生理生化鑒定結果與《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》中芽孢桿菌屬的乳酸細菌特性基本相符，且菌株L-H7的吲哚實驗和溶血實驗結果均為陰性，可用作安全的微生物發酵劑。

2.3.3 16s rDNA分子生物學鑒定結果

利用通用引物對菌株L-H7的16S rDNA進行PCR擴增。由圖2可知，擴增后的產物長度約為1 500 bp，與預期相符。

2.4 凝結芽孢桿菌L-H7的生長特性和產酸能力

由圖4可知，凝結芽孢桿菌L-H7在MRS培養基中能夠快速生長，20 h時進入穩定生長期，隨后由于營養物質的消耗和代謝產物的積累，菌株生長速率減緩并逐漸進入衰亡期。凝結芽孢桿菌L-H7在24 h生長期內產酸較快，且產酸速率穩定，隨后由于菌株生長速率減緩、代謝活性降低，其產酸速率減緩，pH值保持平穩。

2.5 凝結芽孢桿菌L-H7在模擬發酵香腸中的應用

2.5.1 模擬發酵香腸發酵期間的微生物指標和pH值

由表5～7可知：經25 ℃發酵2 d后，各組發酵香腸的乳酸菌和凝結芽孢桿菌菌落數均顯著升高（P<0.05），但葡萄球菌菌落數均顯著下降（P<0.05），可能是由于發酵期間產酸菌的快速生長抑制了葡萄球菌的生長;15 ℃繼續發酵5 d后，葡萄球菌菌落數開始有所上升;經25 ℃發酵2 d后，接種戊糖片球菌的BS-1、BS-3、BS-5組發酵香腸pH值顯著降低（P<0.05），分別達到5.12、4.96和5.05，而未接種戊糖片球菌的BS-2、BS-4組發酵香腸pH值偏高，說明凝結芽孢桿菌在肉類體系中的產酸速率低于戊糖片球菌。

2.5.2 模擬發酵香腸的揮發性風味化合物分析

對BS-1、BS-5組發酵香腸進行揮發性化合物測定，分析不同發酵劑組合產生的揮發性物質差異。

由表8可知，BS-1和BS-5組發酵香腸模型中的揮發性化合物主要為醇類、酯類、酮類、醛類、酸類和酚類。醇類物質中主要化合物為3-甲基-1-丁醇、2，3-丁二醇和[R-（R*，R*）]-2，3-丁二醇。3-甲基-1-丁醇和2，3-丁二醇是發酵香腸中重要的香氣來源。3-甲基-1-丁醇可能來自乳酸菌介導的亮氨酸轉化[25]。2，3-丁二醇主要由戊糖片球菌通過氨基酸分解代謝產生[26-27]。BS-5組發酵香腸特有的1-辛烯-3-醇來源于脂質氧化，具有蘑菇味和發酵香，氣味閾值極低，也被檢測證實為發酵香腸中

的有效氣味[28]，說明凝結芽孢桿菌有助于形成發酵香腸特定風味。

酮類物質中2-丁酮、3-羥基-2-丁酮的相對含量均較高，這2 種酮來自丙酮酸代謝。3-羥基-2-丁酮是乳酸菌通過碳水化合物分解代謝產生的，有助于產生果味[29]，對發酵肉的香氣有重要貢獻。BS-5組發酵香腸3-羥基-2-丁酮

相對含量更高，證明凝結芽孢桿菌的碳水化合物代謝率較高。

碳鏈長度為1～10的酸生成的酯類通常會產生果香味[30]，2 組發酵香腸均有酯類物質產生，BS-5組發酵香腸所含的酯類物質種類更多，其中癸酸乙酯具有典型的果香，對肉制品香味有重要貢獻。

醛類物質是BS-5組發酵香腸特有的揮發性風味物質，其感官閾值較低，對發酵香腸的風味有很大貢獻。醛類物質由脂質氧化產生，其中壬醛是ω-9多不飽和脂肪酸氧化的產物[31]，具有脂香味、甜橙味，（E，E）-2，4-癸二烯醛具有油炸味。

BS-1組發酵過程中出現了胺類物質，具有不愉快氣味，而BS-5組并未產生該類物質，說明凝結芽孢桿菌可抑制不良風味物質的產生。

3 結 論

通過初篩及復篩得到L-H7、L-H8、L-S9 3 株能耐受5 g/100 mL NaCl和150 mg/kg NaNO2，且對大腸桿菌、單增李斯特菌、假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌有良好抑制作用的菌株，并最終篩選鑒定得到酶系更為豐富的凝結芽孢桿菌L-H7。發酵香腸模型實驗結果顯示，凝結芽孢桿菌L-H7與戊糖片球菌、木糖葡萄球菌復配后添加至發酵香腸，能夠產生1-辛烯-3-醇等特有香氣物質，證明凝結芽孢桿菌L-H7復配戊糖片球菌和木糖葡萄球菌能促進發酵香腸特征風味的形成。以上研究結果表明，凝結芽孢桿菌L-H7對于提升發酵香腸的營養價值和品質特性均有重要意義，未來具有開發成為發酵肉制品優良發酵劑的潛力。該菌株在發酵香腸中的作用機制及應用效果還需要更進一步的研究。

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