幽門螺桿菌感染與胃癌組織中p27蛋白表達的關聯性分析

殷曉霞，張 凡

(河北北方學院附屬第一醫院病理科，河北 張家口 075000)

胃癌是發生于胃黏膜上皮的一種常見惡性腫瘤，其在胃惡性腫瘤中占95%以上，在消化道惡性腫瘤疾病中占首位[1]。胃黏膜上皮細胞的凋亡與增殖通常情況下保持動態平衡，而一些生長因子、癌基因及抑癌基因的共同調控是維持這種平衡的關鍵[2]。細胞周期是一個經高度有序、嚴格調控的過程，而細胞的間接分裂對腫瘤細胞擴增中發揮著重要的調節作用，間接分裂的偏差會造成基因組不穩定而引發腫瘤。p27是一個細胞周期的負性調控因子，會隨著細胞周期進展的變化而變化，對于多種細胞周期激酶和蛋白的活性具有較好的抑制作用，因此p27被認為是一種抑癌基因[3]。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)于1994年宣布人類胃癌的Ⅰ類致癌原為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，但目前尚不明確H.pylori引起胃癌的發病機制。本研究旨在探討H.pylori感染與胃癌癌組織中p27蛋白表達的關聯性，了解H.pylori感染引起胃癌的發病機制，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月—2018年12月在我院行胃癌切除術的胃癌組織標本共62例(胃食管交界46例，遠端組織16例)，其中男性32例，女性30例，年齡34～75歲，平均(59.40±2.10)歲；TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期23例，Ⅲ、Ⅳ期39例；胃癌組織分化程度：低分化25例，高、中分化37例。所有患者術前均無服用非甾體抗炎藥物及接受抗H.pylori治療，且臨床資料完整。另選擇癌旁組織(距離腫瘤邊緣2.5～5 cm)標本42例,男性20例，女性22例，年齡 35～72歲，平均(58.60±1.80)歲。 胃癌組織標本與癌旁組織標本差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1H.pylori檢測 采用14C-尿素酶呼氣(14C-UBT，)方法，14C-UBT檢測儀為深圳市中核海得威生物科技有限公司生產。患者在空腹6 h后采集100 mL呼氣，服用14C之后再采集100 mL呼氣，密封待檢；將收集的呼氣裝置與C紅外線能譜儀檢測孔連接進行自動檢測，設備檢測完成之后自動生成檢測報告，其中陽性值為DOB>2.5[4]。病理組織染色處理：采用改良Giemsa染色處理方法，標本使用10%甲醛進行固定，梯度乙醇脫水-石蠟包埋-切片(厚度4 μm)，行姬姆薩染色處理。處理步驟[5]：第一步將石蠟切片行常規脫蠟、脫水處理，然后加入2% Ciemsa染色劑，浸泡30 min；染色完成后使用自來水清洗，迅速使用純酒精脫水及二甲苯處理，促使切片透明，最后行樹膠封固。在油鏡下(×1 000)觀察H.pylori感染情況，看見小桿菌為確診感染。

1.2.2p27蛋白表達檢測 采用福州邁新生物技術開發有限公司生產的快捷法通用型二抗、鼠抗人p27單克隆抗體試劑盒及北京中杉金橋生物技術生產的氨基聯苯胺顯色試劑盒[6]。用微波爐進行抗原修復，按試劑盒說明書進行免疫組織化學檢測，并由2名專業病理醫師進行結果判定。胃癌組織中細胞核和細胞漿出現棕黃色染色為p27蛋白表達陽性。癌旁組織中細胞胞核和胞漿中呈明顯棕色顆粒狀為p27表達陽性。免疫組織化學染色評分根據以下3個方面進行判定；①陽性細胞百分比評分:0分，0%；1分，<10%；2分，10%～50%；3分，51%～90%；4分，>90%；②染色密度評分:0分，無染色；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強染色；③染色方式評分:0分，無染色；1分，散在染色；2分，局灶染色；3分，彌漫染色。每例標本的染色積分=①×②×③，其中陽性為1～36分，陰性為0分。

1.3統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件處理數據。計數資料比較采用χ2檢驗，相關性分析應用線性相關性分析，影響因素確定采用多因素Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1H.pylori檢測結果 62例胃癌患者均行14C-UBT檢測，結果顯示，H.pylori感染40例，感染率為64.52%。

2.2不同臨床病理特征胃癌患者p27蛋白表達情況比較 高、中分化胃癌患者p27蛋白表達率高于低分化胃癌患者，差異有統計學意義(P<0.01)；不同性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結胃癌患者p27蛋白表達率差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征胃癌患者p27蛋白表達情況比較Table 1 Comparison of p27protein expression in gastric cancer patients with different clinicopathological characteristics (例數，%)

2.3胃癌癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達的相關性H.pylori感染與胃癌癌組織中p27蛋白表達呈負性相關(P<0.01)。見表2。

表2 胃癌癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達的相關性Table 2 Correlation between H.pyloriinfection and p27protein expression in gastric cancer tissues (例數)

2.4p27在胃癌組織和癌旁組織中的表達比較 p27在胃癌組織中的表達率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 p27在胃癌組織和癌旁組織中的表達比較Table 3 Comparison of expression of p27in stomach cancer tissue and cancerside tissue (例數，%)

2.5多因素Logistic回歸分析 以p27蛋白表達(陰性=0，陽性=1)的因變量，以腫瘤分化程度(低分化=0，高、中分化=1)為自變量，進行多因素Logistics回歸分析，結果顯示腫瘤分化程度是胃癌組織p27蛋白陽性表達的危險因素(P<0.01)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析Table 4 Multiple logistic regression analysis

3 討 論

H.pylori為一種定植于胃黏膜的革蘭陰性螺旋細長微彎桿菌[7]。目前，我國H.pylori感染率達50%～80%，且隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，其感染率呈逐漸升高趨勢[8]。H.pylori是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃淋巴瘤的主要原因之一，也是導致胃癌發生并發展的Ⅰ類致病源，因其具有強烈的黏附性，且分泌的毒素具有致病性，故極易導致胃黏膜病變，一般癌變順序是由慢性炎癥發展為萎縮性胃炎，進而發展到萎縮性胃炎伴腸化，最終發展為癌變，被WHO列為人類Ⅰ類致癌因子[9]。

通常惡性腫瘤的發生是多種因素共同作用的結果。李曉琴等[10]研究表明，H.pylori感染是胃癌發生的重要危險因素之一，胃癌患者中約70%與H.pylori感染有關。H.pylori感染引起的胃癌發生有多種機制，主要與人體抑癌基因的失活和內癌基因的激活及突變有關，其中抑癌基因主要包括野生型p53、p27、抑癌基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)、結腸腺瘤樣息肉病基因(adenomatous polyposis coli, APC)等，內癌基因主要包括c-myc、ras基因和Bcl-2活化[11]。其中抑癌基因p27是近年來新發現的CKI基因，屬于細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase in-hibitors，CDK)抑制劑之一，定位于人體內部12p13交界處，主要包含1個內含子、1個無功能的外顯子和2個有編碼功能的外顯子。研究發現[12]，p27蛋白可通過作為細胞外刺激信號的潛在媒介對細胞周期進行調控，同時作為調控細胞周期的負性調控因子，具有抑制腫瘤發生發展的作用，還可以抑制細胞周期素-CDK復合物的生物學活性[13]。且通過研究肺癌、乳腺癌和內分泌腫瘤，可發現p27蛋白的表達與腫瘤的生長、分化及預后密切相關[14]。此外，p27蛋白表達水平在細胞周期G1/S的重要轉換中降低，則無法阻斷細胞增殖和分裂，而導致腫瘤形成。據研究表明[15]，抑癌基因的缺失或減少及細胞凋亡是癌癥發生發展的2個重要因素，作為抑癌基因之一的p27蛋白下降可增加細胞周期蛋白-CDK2復合物活性，對細胞的增殖具有促進作用，最終演變成腫瘤。p27表達在胃癌進展過程中逐漸降低使癌細胞分化越低、淋巴結轉移更快、惡性程度越高，而導致胃癌的轉移或進展。

黃虎等[16]研究發現，長期慢性H.pylori感染可致p27胞漿錯位，使p27從抑癌轉變為癌基因，導致胃癌的發生，并促使了胃癌的進一步發展。孔凡立等[17]研究發現，H.pylori感染可能影響p27表達，促進胃腫瘤細胞增殖。本研究結果顯示，胃癌組織中H.pylori感染與p27蛋白表達呈負相關，表明H.pylori感染極易引起胃黏膜抑癌基因p27表達降低或缺失，從而導致胃黏膜癌變發生。此外，多因素Logistics回歸分析結果顯示，腫瘤分化程度為胃癌癌組織p27蛋白陽性表達的影響因素。表明p27蛋白表達與腫瘤分化程度有關。H.pylori感染引起胃癌的機制可能為H.pylori感染導致p27喪失調控細胞周期的負性調控因子的抑癌作用，還可能為H.pylori感染導致p27降低引起細胞黏附性和細胞外基質降低，導致腫瘤浸潤并轉移[18]。

綜上所述，胃癌的發生發展與p27缺失或凋亡減少有關，p27蛋白表達水平與H.pylori感染存在一定的關聯性，p27蛋白可作為臨床診斷胃癌及是否合并H.pylori感染的輔助指標，在疾病后期診斷、治療及預后評估中具有重要價值，值得推廣應用。