非洲栽培稻堊白粒率耐熱性QTL的定位

曹志斌 李瑤 曾博虹 毛凌華 蔡耀輝 吳曉峰,* 袁林峰,*

非洲栽培稻堊白粒率耐熱性QTL的定位

曹志斌1, #李瑤2, #曾博虹1毛凌華1蔡耀輝1吳曉峰1,*袁林峰1,*

[1江西省超級水稻研究發展中心/國家水稻工程實驗室(南昌), 南昌 330200；2江西省農業科學院 土壤肥料與資源環境研究所/農業部長江中下游作物生理生態與耕作重點實驗室, 南昌 330200;#共2同第一作者；*通信聯系人, E-mail: yuanlf2003@sina.com; jxnkzy208@163.com]

【】本研究旨在定位一個稻米堊白粒率高溫耐性QTL，為外觀品質育種及解析堊白粒率高溫耐性的遺傳機制提供依據。以非洲栽培稻耐熱品種IRGC102309(Steud.)和秈稻品種R9311(L. subsp.Kato)為親本構建的栽培稻種間染色體片段導入系CSIL05-23為材料構建次級分離群體，結合人工氣候室模擬灌漿期高溫脅迫處理，采用堊白粒率高溫鈍感值為評價指標，對非洲栽培稻堊白粒率高溫耐性 QTL 進行檢測。在BC6F2分離群體，利用單標記分析，發現第5染色體上的SSR標記RM1200與堊白粒率耐熱性狀極顯著正相關（=0.0005）。進一步利用BC6F3和BC6F4分離群體，采用QTL Cartographer 2.5軟件和復合區間作圖法在水稻第5染色體上的SSR標記RM1200?RM5796區間重復檢測到一個灌漿期堊白粒率耐熱性QTL, 命名為，分別解釋11.4%和17.5%表型變異。根據BC6F4分離群體的純合重組體表型分組，利用置換作圖方法將目標QTL同樣定位在SSR標記RM1200?RM5796之間，遺傳圖距為1.3 cM，物理圖距約為333.4 kb。控制堊白粒率耐熱性的是一個能夠用于稻米外觀品質育種的新QTL。

水稻；堊白粒率；耐熱性；數量性狀位點；基因定位

水稻是全球最重要的糧食作物之一，世界上將近一半人口的能量供應與之直接相關[1]。未來全球氣候變暖的趨勢對全球水稻生產不利影響將日益加劇，熱帶及亞熱帶地區作物生長季節，氣溫可能會提高3~5℃，將會超過有記錄的作物生長季節性高溫極值[2]。而且高溫熱害天氣經常與水稻生殖生長關鍵期相遇，在孕穗期、揚花期以及灌漿期均有發生。因此，培育能夠適應未來氣候變化的水稻品種，是應對全球氣候變暖的迫切需要[3]。灌漿期對水稻籽粒產量與品質形成極為關鍵。當灌漿期遇到炎熱的氣候條件，對優質稻米品質的形成很不利，當氣溫超過35℃，籽粒的灌漿速度加快，灌漿時間縮短，出現高溫逼熟現象。產量方面的不利影響，主要表現為籽粒充實度差，千粒重顯著降低。稻米品質方面的不利影響，主要表現為堊白粒率高，堊白大，整精米率下降，食味品質變差[4-10]。

水稻灌漿期耐熱性屬于受多基因控制的復雜數量性狀，受外界環境影響明顯[11-16]。目前已有學者利用不同作圖群體及鑒定指標結合分子標記技術，對灌漿期耐熱性相關QTL進行了初步定位。朱昌蘭等[17]利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重組自交系群體，以直鏈淀粉含量為鑒定指標，在第6和9染色體上檢測到3個QTL。以膠稠度為鑒定指標，在第4、6、7、8、10和11染色體上分別定位到1個水稻灌漿期耐熱相關QTL。朱昌蘭等[18]利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare回交重組自交系群體，在第1、4和7染色體上分別定位了一個灌漿期粒重為耐熱指標的QTL。Kobayashi 等[19]利用Hana-echizen/Niigatawase構建的F3群體，以稻米外觀品質性狀背白和腹白為灌漿期耐熱性鑒定指標，共檢測到3個QTL，其中在第4及第6染色體上分別鑒定到1個白背耐熱QTL，在第6染色上定位到一個白背和基白QTL。Shirasawa等[20]利用Kokoromachi/Tohoku 168構建的重組群體在第1和6染色體上個檢測到1個白背耐熱性QTL。Tabata等[21]利用Koshijiwase/Chiyonishiki構建的重組自交系群體在第1、2和4染色體上共檢測到4個稻米白背耐熱性QTL。張桂蓮等[22]以耐熱水稻品系 996 和熱敏感水稻品系4628為親本構建的重組自交系為材料，在第1、3、6、7染色體上檢測到8個堊白粒率高溫鈍感性QTL，在第1、2、4、6、7和10染色體上檢測到12個堊白大小高溫鈍感性QTL，在第1、3、7染色體上檢測到4個堊白度高溫鈍感性QTL。

目前這些定位結果主要是利用亞洲栽培稻秈稻種內或秈粳亞種間雜交構建的初級作圖群體分析得到的。本研究利用非洲栽培稻耐熱品種為供體親本，秈稻品種R9311為受體親本，獲得堊白粒率為17.8%的染色體片段導入系CSIL05-23。并通過進一步構建次級分離群體結合人工氣候室進行表型鑒定，結合復合區間作圖及置換作圖法在第5染色體上定位到一個主效堊白粒率高溫鈍感 QTL。這一工作可為研究堊白粒率高溫鈍感性的遺傳機理，篩選與堊白粒率高溫鈍感性緊密連鎖的分子標記以及下一步的育種應用及圖位克隆打下基礎。

1 材料與方法

1.1 非洲栽培稻堊白粒率耐熱性QTL分析材料

利用亞洲栽培秈稻品種R9311作為受體，非洲栽培稻品種IRGC102309作為供體，2008年夏季開始連續回交5次，自交1次獲得BC5F2種子。2010年種植BC5F2群體400株，挑選20株綜合農藝性狀良好的單株自交套袋收種。2011年冬季將中選材料海南三亞育種試驗站加代繁殖獲得BC5F3群體。

2012年于南昌試驗站中稻季節灌漿期（8月16~26日）經歷自然高溫脅迫，日平均溫度不低于32℃，最高溫度不低于36℃。種植BC5F3群體134行，每行8株。成熟后單株收獲，脫殼調查堊白性狀，以播種時間推遲15 d，9月初開始灌漿的株系的堊白性狀值作為正常溫度下的表型對照。其中編號為CSIL05-23的染色體片段導入系，高溫脅迫處理下堊白粒率平均值為17.8%，而在正常溫度下堊白粒率平均值為17.1%，鈍感值為1.041，比值接近1，兩者差異不顯著，對高溫表現為強鈍感性，同時自交留種，冬季到海南繁殖得到BC5F4種子。將含有目的片段的染色體片段導入系CSIL05-23，分別于2013年、2014年、2015年種植在南昌高安基地，種植4行，行長1.2 m，株距16.5 cm，行距19.8 cm，隨機區組設計，設2次重復。2014年夏季在南昌試驗站種植200個BC6F2單株。2015年種植RM1200和RM5796片段雜合的BC6F2單株自交獲得的BC6F3分離群體380株，2016年種植目標區段雜合的BC6F3單株自交獲得的BC6F4群體420株。上述分離群體單株，待幼穗分化至6期左右，帶泥移栽至盆缽中繼續生長發育。將掛牌標識揚花的稻穗于花后7 d開始用人工氣候室模擬高溫脅迫14 d。然后移入正常自然條件下成熟5~7 d，調查掛牌標識稻穗堊白粒率。

1.2 人工氣候室高溫脅迫處理

人工氣候室（北京易盛泰和科技）模擬高溫脅迫的條件為8:00–17:00，控制在38.0℃±0.5℃，其余時間均為25.0℃±0.5℃。正常對照條件為8:00–17:00控制在32.0℃±0.5℃，其余時間均為25.0℃±0.5℃。所有處理的相對濕度均為75%±5%；光照時間為14 h，光照強度為20 000～25 000 lx。

1.3 堊白粒率高溫耐性表型測定

利用JSE-II稻米堊白觀測儀考察表型。取整精米100粒，置于觀測板上觀察，挑選有堊白（包括心白、腹白、背白）的米粒，計平均值作為堊白粒率。以堊白粒率高溫鈍感值（insensitivity value）表示堊白粒率耐熱性。堊白高溫鈍感值的計算參照鐘秉強等[23]方法，鈍感值（IV）=1/2，其中1，2分別為高溫脅迫下和正常溫度條件下的堊白粒率。從理論上講，鈍感值越接近1，該性狀越耐高溫。

1.4 DNA提取，PCR擴增及多態性標記篩選

應用CTAB法[24]提取DNA，本實驗室根據Gramene數據庫(http://www.gramene.org)選擇SSR引物進行PCR擴增，擴增體系為10 μL，DNA模板l μL。

PCR擴增條件為：94℃下預變性5 min；94℃下變性30 s，57℃下復性30 s，72℃下延伸1 min；35個循環后，72℃下再延伸10 min。擴增產物經非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳，凝膠濃度為6%，電泳緩沖液為0.5倍TBE，220 V恒壓電泳1 h，并銀染顯色。

1.5 QTL分析

根據Mapmaker/Exp 3.0b軟件[25]分析多態性標記之間的連鎖遺傳關系, 構建局部連鎖遺傳圖譜。設定最小LOD值為3.0, 根據Kosambi函數[26]將分子標記重組率換算成遺傳圖距(cM), 遺傳圖距最大值為50 cM。利用Windows QTL Cartographer 2.5[27]檢測目的性狀QTL。利用復合區間作圖法(composite interval mapping, CIM)[28]，取LOD值2.5為 QTL存在的閾值,利用模型6進行分析。用SAS統計軟件對標記與性狀進行單標記相關性分析。根據多態性分子標記對群體單株的基因型檢測結果將數據分組。利用SAS統計軟件中方差相同的測驗檢驗組間平均數的差異，確定單標記與性狀的相關性[29]。通過差異顯著性分析，判斷控制數量性狀的QTL是否與標記連鎖。2是標記能夠解釋性狀表型變異的比例，由表型性狀與標記的回歸方程中的決定系數決定[30]。QTL命名方法參照McCouch等制定的規則[31]。

2 結果與分析

2.1 染色體片段導入系CSIL05-23高溫脅迫及常溫條件下堊白粒率表現

CSIL05-23在田間高溫脅迫和人工氣候室模擬高溫脅迫條件下堊白粒率分別為17.8%和18.4%，顯著低于受體親本R9311，R9311分別為55.5%和56.8%(圖1-A)。CSIL05-23在田間高溫脅迫和人工氣候室模擬高溫脅迫條件下堊白粒率高溫鈍感值分別為1.04和1.07，R9311分別為2.25和2.30(圖1-B)。

2.2 堊白粒率耐熱性QTL的初步鑒定

由表1可知，BC6F2群體中堊白粒率高溫鈍感值表現出極顯著差異，且變異幅度較大，存在顯著的超親分離。因此推測非洲栽培稻片段含有降低堊白粒率高溫鈍感值的優異等位基因，且這些優異位點已在亞洲栽培秈稻中發生了重組并引起了群體表型的變異。偏度和峰度的絕對值均小于1，認為堊白粒率高溫鈍感值表型均符合正態分布，呈多基因控制的數量性狀遺傳特點。

從Gramene數據庫(http://www. gramene.org) 中選擇均勻覆蓋水稻基因組的430對多態性SSR引物對CSIL05-23和R9311進行PCR擴增，獲得3對具多態性SSR標記，分別為RM488(Chr. 1)，RM5460(Chr. 2)，RM1200(Chr. 5)。利用這3個SSR標記對200個BC6F2分離單株進行檢測，發現3個標記基因型均發生分離。根據分子標記結果將數據分組，利用方差相同的測驗檢驗組間平均數的差異，確定標記與堊白粒率高溫鈍感性狀的連鎖關系，發現第5染色體上RM1200與堊白粒率高溫鈍感值呈極顯著正相關（=0.0005）。該標記位點的非洲栽培稻增效基因能夠顯著提高堊白粒率高溫鈍感性，解釋9.4%的表型變異。

**差異極顯著(p<0.01), t檢驗。

Fig. 1. Comparison of heat tolerance of chalky grain rate of CSIL05-23 and R9311 in field and artificial climatic chambers.

表1 親本及BC6F2、BC6F3、BC6F4群體堊白粒率高溫鈍感值的表型變異

表2 BC6F3與BC6F4世代灌漿期高溫脅迫后堊白粒率耐熱性QTL分析

IV indicates insensitive value of heat tolerance of chalky grain rate. X1and X2indicate chalky grain rate under heat stress condition and normal condition, respectively.

2.3 堊白粒率耐高溫QTL復合區間作圖

為了進一步消除遺傳背景的影響，有效確定目標QTL的位置和遺傳效應。在BC6F2分離群體中利用RM488、RM5460和RM1200進行滲入片段標記基因型鑒定，將RM488和RM5460基因型為輪回親本純合基因型，而目標滲入片段RM1200為雜合基因型的BC6F2單株自交，獲得BC6F3和BC6F4次級分離群體進行分析。如表1所示，群體間差異達到極顯著水平并存在明顯的超親分離現象。2個世代堊白粒率耐熱性狀的鈍感值均符合正態分布，呈多基因控制的數量性狀遺傳特點。

根據Gramene數據庫, 在第5染色體目標區域附近挑選并合成25對SSR引物進行多態性篩選, 共獲得8對多態性SSR標記。將這些具多態性的引物進一步分析整個BC6F3群體，應用Mapmaker/Exp 3.0軟件構建分子遺傳圖譜，該漸滲片段長10.3 cM，標記間平均距離為1.5 cM(圖2)。

應用 QTL Cartographer 2.5軟件，采用復合區間作圖法對BC6F3單株及BC6F4群體堊白粒率高溫鈍感值，高溫脅迫處理下堊白粒率、正常溫度處理下堊白粒率分別進行了QTL分析(表2)，三個指標性狀在2個世代相同標記RM1200?RM5796區間都定位到目標QTL，增效基因來源于非洲栽培稻。針對目標QTL(a QTL for heat tolerance of chalky grain rate)以堊白粒率高溫鈍感值為鑒定指標進行QTL分析，發現在2個世代分別可以解釋11.3%，17.5%的表型變異。以高溫脅迫處理下堊白粒率X1為鑒定指標進行QTL分析，發現在2個世代分別可以解釋9.5%，16.7%的表型變異。以高溫脅迫處理下堊白粒率為鑒定指標進行QTL分析，發現在2個世代分別可以解釋9.5%，16.7%的表型變異。正常溫度處理下堊白粒率為鑒定指標進行QTL分析，發現在2個世代分別可以解釋12.6%、16.5%的表型變異。

左右箱線圖分別表示來自BC6F3和BC6F4群體的1 LOD 和2 LOD 似然區間位置。

Fig. 2. Genetic linkage map and likelihood intervals for QTL associated with heat tolerance of chalky grain rate.

2.4 利用置換作圖方法定位

利用上述8個SSR標記對430個BC6F4單株分析，在RM1200和RM5796之間總共得到90個交換單株，通過連鎖分析構建了目標區域染色體片段置換圖（圖3）。根據交換單株標記基因型信息，將90個交換單株中部分純合體按交換位置信息分為14組。利用置換作圖的方法分別利用高溫脅迫處理下堊白粒率（X1）、正常溫度處理下堊白粒率（X2）、堊白粒率高溫鈍感值（IV）三個指標性狀對進行定位。重組體G1~G7分別攜帶RM592到RM4777逐漸遞減的IRGC102309純合漸滲片段。G1~G6純合重組體與R9311之間比較在X1、X2和IV性狀上均存在顯著差異(<0.05)，與CSIL05-23比較在X1、X2和IV性狀上差異不顯著。G7純合重組體與R9311之間比較在X1、X2和IV性狀上差異不顯著，與CSIL05-23比較在X1、X2和IV性狀上差異顯著(<0.05)。因此，根據G1~G6和G7純合重組體與對照之間的差異顯著性分析結果把堊白粒率高溫鈍感QTL界定在RM1200的下游。G8~G14分別攜帶從RM1200到RM405逐漸遞減的IRGC102309純合漸滲片段。其中，G8純合重組體與R9311比較，在X1、X2和IV性狀上差異顯著(<0.05)，與CSIL05-23比較在X1、X2和IV性狀上差異不顯著。G9~G14純合重組體與R9311比較，在1、2和IV性狀上差異不顯著，與CSIL05-23比較在1、2和IV性狀上差異顯著(<0.05)。因此，G8和G9~G14純合重組體與對照親本比較結果把堊白粒率高溫鈍感QTL界定在RM5796的上游。這些研究結果表明位于SSR標記RM1200–RM5796之間，遺傳距離為1.3 cM，物理距離約為333.4 kb。

由380個BC6F3單株的分析數據構建QTL區域的連鎖圖。BC6F4純合重組體的后代在灌漿期模擬高溫逆境處理后, 根據堊白粒率及鈍感值（IV=X1/X2）調查結果將qHTCGR5定位在RM1200和RM5796之間, 根據基因型將90個重組體分為14組。每組的重組體數目及與R9311和染色體片段導入系CSIL05-23之間的堊白粒率高溫鈍感表型差異顯著性在右邊標出。“a”表示重組體與R9311的表型值在0.05水平無顯著差異：“b”表示重組體與CSIL05-23的表型值在0.05水平無顯著差異。

Fig. 3. Mapping ofby a substitution mapping strategy.

3 討論

非洲栽培稻與亞洲栽培稻同屬AA基因組的不同種，兩者在進化中屬于獨立起源種，并且存在明顯的生殖隔離現象。需要構建染色體片段導入系或近等基因系來克服種間不育問題。目前通過傳統回交結合現代生物技術手段已經能夠有效挖掘利用非洲栽培稻的種質特性。非洲栽培稻在當地自然選擇及進化過程中，已經具備適應或抵抗高溫熱害、澇害、干旱、耐鹽堿及各種病蟲害特性，對亞洲栽培稻品種改良具有重要意義。本研究利用構建的QTL-CSIL群體為鑒定堊白粒率耐熱性QTL提供了豐富的遺傳信息。除了證實控制目的性狀的非洲栽培稻等位基因，在不同世代的遺傳效應穩定及方向一致外，而且通過消除背景噪音將的遺傳效應值大小進行準確的評估。很顯然利用復合區間作圖法分析F2群體對這些QTL遺傳效應估計的準確性是不足的，實際上目前水稻耐熱QTL克隆的成功例子也是得益于高質量近等基因系的培育[32]。

在籽粒灌漿期遇到高溫脅迫會導致灌漿速率加快，導致籽粒堊白粒率、堊白大小、堊白度顯著增加。堊白相關性狀受多個基因/QTL 位點協同調控表達，并且與外界環境因素存在明顯的互作效應。目前第5染色體上堊白性狀QTL的定位研究已有報道，且都是在田間自然條件下鑒定得到的。Liu等[33]利用2個粳稻品種Koshihikari和C602雜交、自交構建了261個重組自交系(F8)進行堊白性狀QTL分析，在第5染色體上鑒定到一個堊白粒率QTL，定位在RM289和RM3437之間，解釋18.2%的表型變異。高方遠等[34]利用秈稻保持系骨干親本崗46B與美國水稻品種Lemont多次回交培育的低堊白、窄粒株系K1075與崗46B構建F2群體, 對堊白粒率進行QTL分析，將第5染色體上的堊白粒率QTL定位在RM18004?RM18068之間，該QTL解釋52.55%的表型變異。上述2個堊白粒率QTL與區間標記位置均不重疊。因此是一個新的耐熱性QTL位點。該位點在BC6F3和BC6F4兩個世代被定位在同一個標記區間，遺傳距離為1.3 cM，并且遺傳效應值較大。這對水稻的生殖期高溫脅迫條件下外觀品質的改良非常有意義。

置換作圖法最早由Paterson提出[35]，并成功應用于QTL精細定位。這種方法已經證明置換作圖是一種區分基因多效性及排除連鎖累贅的有力工具，可以為QTL的精細定位及圖位克隆打下堅實的基礎[36-37]。CSIL05-23所含漸滲區域已被證實能夠改良受體的堊白粒率高溫耐性。在本研究BC6F4群體的置換作圖中，我們對純合交換片段都進行了分析，對不同交換片段的作用效果進行了評估。同時SSR標記在確定重組位置及基因滲入區域邊界是非常有效的。與受體親本相比，通過置換作圖發現1.3 cM的IRGC102309滲入片段上存在能夠在正常溫度下顯著降低受體親本堊白粒率X2值的QTL，在高溫脅迫下該片段上QTL也能顯著降低受體親本堊白粒率X1值，并且堊白粒率高溫鈍感值IV接近1，表現為堊白粒率高溫絕對鈍感（圖2）。由于本研究人工氣候室處理群體數量有限，不能用于精細定位的大規模分離群體的表型鑒定，因此本研究置換作圖分辨率仍然不能清楚地分辨出X1，X2和IV三個性狀是由于基因連鎖導致，還是基因的多效性導致這種現象發生。因此，下一步將設計精細定位實驗方案，構建高密度局部分子標記遺傳圖譜，增加QTL精細定位分辨率，分析上述三個性狀是否由這個區域上的同一個QTL控制，還是三個QTL緊密連鎖影響，為目標QTL的育種應用及相關基因克隆打下堅實的基礎。

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QTL Mapping for Heat Tolerance of Chalky Grain Rate ofSteud.

CAO Zhibin1, #, LI Yao2, #, ZENG Bohong1, MAO Linghua1, CAI Yaohui1, WU Xiaofeng1, *, YUAN Linfeng1, *

(1Laboratory of Rice National Engineering, Jiangxi Research and Development Center of Super Rice, Nanchang 330200, China;2Institute of Soil and Fertilizer & Resources and Environment, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Ecophysiology and Farming System for the Middle and Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Nanchang 330200, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: yuanlf2003@sina.com; jxnkzy208@163.com)

【】The objective of the research is to identify a QTL for heat tolerance of chalky grain rate, so as to provide support forthe appearance quality breeding and analysis of genetic mechanism of rice high temperature tolerance of chalkygrain rate. 【】We developed a chalky grain rate heat-tolerant CSIL(chromosomal segment introgression lines), CSIL05-2, by backcrossing and marker assisted selection with African cultivated rice acc.IRGC102309 (Steud.) as donor parent and Asian cultivated riceR9311 (L. subsp.Kato) as recipient parent. And a QTL for insensitityof heat tolerance of chalky grain rate on chromosome 5 was analyzed using secondary populations from CSIL05-2.【】In a BC6F2segregation populations, the SSR marker RM1200 on chromosome 5 showed significant correlation with heat tolerance of chalky grain rateby single marker analysis（=0.0005）. Using Cartographer 2.5 and the composite interval mapping with BC6F3and BC6F4populations, we further anchored the quantitative trait loci (QTL) associated with heat tolerance of chalky grain rate at filling stage to the same position within a 1.3cM interval, which was designed as qHTCGR and explained 11.4% and 17.5% of the phenotypic variances, respectively.Using homozygous recombinants screened from BC6F4populations,was also detected in a ~333.4 kb region betweenRM11633 and RM11642.【】The QTL controlling the heat tolerance of chalky grain rateis a novelQTL.

rice; chalky grain rate; heat tolerance; QTL; gene mapping

Q343.1+5; S511.32

A

1001-7216(2020)02-0135-08

10.16819/j.1001-7216.2020.9086

2019-07-26;

2019-10-17。

國家自然科學基金資助項目(31560382)；江西省杰出青年科學基金資助項目(2018ACB21026);江西省自然科學基金資助項目(20151BAB214013; 2017BAB204020)；江西省現代農業科研協同創新專項(JXXTCXFY201902)；國家重點研發計劃資助項目(2017YFD0301601; 2018YFD0301103)；江西省重點研發計劃資助項目(20171ACF60019)。