基于肌漿蛋白質(zhì)組研究黑切牛肉的形成機(jī)制

吳 爽，王 磊，楊嘯吟，羅 欣,2，李 航，朱立賢,，張一敏,2,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系豐都綜合試驗(yàn)站，重慶 408216）

動(dòng)物的宰前應(yīng)激是一個(gè)非常復(fù)雜的特性，受到很多內(nèi)在因素（如基因、性別和年齡）和外在因素（運(yùn)輸和管理）的影響[1-2]。宰前應(yīng)激會(huì)消耗動(dòng)物肌肉內(nèi)的糖原儲(chǔ)備，進(jìn)而影響宰后肌肉向食用肉轉(zhuǎn)變過程中的生化反應(yīng)進(jìn)程[3]，其中一個(gè)重要的過程是腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的再生和水解。當(dāng)宰后肌肉供血不足時(shí)，肌肉的有氧代謝會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧酵解，無氧酵解產(chǎn)生的乳酸和ATP會(huì)水解產(chǎn)生H+，H+在肌肉中積累導(dǎo)致肌肉的pH值降低[4]，而宰后肌肉pH值的下降速率和極限pH值對(duì)肉的品質(zhì)有很大影響[5-6]。黑切牛肉的產(chǎn)生通常被認(rèn)為是由于宰前消耗糖原和牛個(gè)體間理化性質(zhì)差異所導(dǎo)致的，其較高的極限pH值增加了肌肉的保水性和線粒體的活性，導(dǎo)致肉表面的散射光較少，并且脫氧肌紅蛋白含量較高，因此產(chǎn)生較暗的肉色[7-8]。黑切肉的顏色發(fā)暗會(huì)使其品質(zhì)大打折扣，降低消費(fèi)者購買欲；此外，微生物更容易在高pH值肌肉中生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致冷鮮肉的貨架期嚴(yán)重縮短[9]。在2000年，美國黑切牛肉的發(fā)生率為2.7%，卻給肉類工業(yè)造成了1.65～1.72億 美元的經(jīng)濟(jì)損失[10]，而黑切牛肉在我國東北、西北、華北3 個(gè)肉牛產(chǎn)區(qū)的發(fā)生率均比較高，其中山東省黑切牛肉的發(fā)生率高達(dá)19.2%[11-12]。因此，探明黑切牛肉的發(fā)生機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行控制，對(duì)于提高我國肉牛產(chǎn)業(yè)的行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。

屠宰后肌肉向食用肉的轉(zhuǎn)變，即活體動(dòng)物組織到最終可食用肉的轉(zhuǎn)變，是影響肉品質(zhì)的關(guān)鍵過程[13]。基于雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2DE）的蛋白質(zhì)組學(xué)可以鑒定和識(shí)別這一轉(zhuǎn)變過程發(fā)生變化的蛋白，從蛋白水平上來研究宰后早期的代謝生化過程，從而更好地解釋肉品質(zhì)存在差異的內(nèi)在機(jī)制。自21世紀(jì)初，利用蛋白質(zhì)組學(xué)來探究牛肉的肉色、嫩度、保水性等品質(zhì)的變化過程及差異正逐步成為肉品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了一些決定肉品品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵蛋白生物標(biāo)簽[14-16]。目前，有關(guān)肉色蛋白質(zhì)組的研究多集中于不同部位肉之間以及牛肉在貯藏期間的蛋白質(zhì)組差異和表達(dá)量變化上，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些代謝酶類、伴侶蛋白、過氧化物還原酶和抗氧化蛋白等是調(diào)控肉色穩(wěn)定性的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[17-22]。Gagaoua等[23]利用免疫斑點(diǎn)印跡探究了阿吉斯坦公牛宰后早期與嫩度、pH值下降和顏色有關(guān)的蛋白生物標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶1、烯醇酶3和乳酸脫氫酶等糖酵解酶與宰后pH值降低和宰后24 h的肉色有關(guān)。

牛肉宰后初期的糖酵解和能量代謝等生化進(jìn)程對(duì)牛肉pH值下降速率的影響至關(guān)重要，鑒于肌漿蛋白調(diào)控著與宰后pH值下降直接相關(guān)的生化反應(yīng)，其在黑切牛肉的形成機(jī)制中起著舉足輕重的作用。目前有關(guān)不同極限pH值牛肉宰后早期的肌漿蛋白質(zhì)組的變化尚不明確。有學(xué)者研究了宰前應(yīng)激有關(guān)的蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)7 種結(jié)構(gòu)收縮蛋白和3 種代謝酶在宰后24 h的正常和黑切胸背最長(zhǎng)肌中存在差異[3]。最近還有學(xué)者研究了黑切牛肉與正常肉之間宰后24～48 h的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白B1與α-晶狀體蛋白在黑切肉中表達(dá)量較高，而過氧化物還原酶則在正常肉中表達(dá)量較高[24]。然而，宰后初期（24 h內(nèi)）作為決定黑切肉形成與否的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)于這一時(shí)期正常牛肉與黑切牛肉的差異表達(dá)蛋白以及它們變化規(guī)律的研究卻鮮有報(bào)道。

因此，本研究對(duì)宰后45 min和24 h的正常牛肉和黑切牛肉進(jìn)行了肌漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，擬尋找兩組牛肉在宰后最初（45 min）和24 h時(shí)的差異表達(dá)蛋白，以便更好地理解黑切牛肉形成的機(jī)制，并尋找可預(yù)測(cè)黑切牛肉發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)記蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖 1 典型的黑切牛肉與正常牛肉Fig. 1 Appearance of typical dark cutting beef and normal ultimate pH beef

實(shí)驗(yàn)所用的樣品來自于山東省某企業(yè)的魯西黃牛與西門塔爾雜交牛（24 月齡、500 kg左右）。分別在宰后45 min和24 h，測(cè)定右半胴體第12～13根肋骨間背最長(zhǎng)肌的pH值，并在腰背最長(zhǎng)肌的前表面（靠近眼肉一端）取約200 g肉塊，液氮冷凍，-80 ℃保存，用于后續(xù)的肌漿蛋白質(zhì)提取。根據(jù)宰后24 h的pH值，將樣品分為正常（pH 5.4～5.8，n＝3）和黑切組（pH＞6.1，n＝3）（典型的黑切牛肉見圖1），每頭牛取兩個(gè)平行，因此每組有6 個(gè)平行樣品。

尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、硫脲、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、碘乙酰胺、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、碘代乙酰胺、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍(lán)、四甲基乙二胺、瓊脂糖、硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250 北京索萊寶科技公司；丙三醇、正丁醇、甲醇、無水乙醇、冰乙酸、磷酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；非干擾型蛋白濃度測(cè)定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SenvenGo pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；T18高速分散機(jī)、KS 501低平型搖床 德國IKA公司；5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；EPOCH-2全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司；Ettan IPGphor 3等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳儀、ImageScanner III圖像掃描儀美國通用電氣公司；5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測(cè)定

利用便攜式pH計(jì)測(cè)定右半胴體12～13 根肋骨間肌肉組織的pH值，深度約6 cm，每個(gè)胴體測(cè)定3 個(gè)位置，取其平均值。

1.3.2 肌漿蛋白的提取

參照J(rèn)oseph等[18]的方法，取2 g樣品，加入5 倍體積的提取液（40 mmol/L Tris base、2 mmol/L EDTA，調(diào)pH值至8.0）和120 μL的DTT（2 mol/L），冰浴條件下勻漿（5 500 r/min勻漿30 s后停30 s，共進(jìn)行4 次），4 ℃下10 000×g離心15 min，取上清液，即為肌漿蛋白，利用非干擾型蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度定量，分裝凍藏（-80 ℃）備用。

1.3.3 雙向凝膠電泳

1.3.3.1 一向等電聚焦電泳

在等電聚焦電泳之前，先對(duì)Immobiline Dry Strip干膠條進(jìn)行上樣水化，上樣量為800 μg（每組的每個(gè)樣品單獨(dú)進(jìn)行雙向電泳），水化溶脹時(shí)間為24 h。將泡脹好的膠條轉(zhuǎn)移至Manifold膠條槽內(nèi)，設(shè)定IPGphorIII電泳儀聚焦程序（300 V、1 h；1 000 V、1 h；grd 4 000 V、1 h；10 000 V、2.5 h；grd 10 000 V至80 000 V·h；grd 300 V、10 h），然后對(duì)膠條進(jìn)行等電聚焦電泳。

1.3.3.2 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚焦后膠條分別用含有1 g/100 mL DTT和4.5 g/100 mL碘乙酰胺的平衡緩沖液（6 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS、體積分?jǐn)?shù)30%甘油、0.002 g/100 mL溴酚藍(lán)）先后室溫平衡15 min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至提前制好的SDS聚丙烯酰胺凝膠面上，待瓊脂糖封膠液完全凝結(jié)后，將裝有SDS聚丙烯酰胺凝膠的膠盒裝入含有電泳液的電泳槽中。設(shè)定電泳槽溫度為15 ℃和電泳儀參數(shù)為：100 V電泳1 h，然后300 V至溴酚藍(lán)指示線即將到達(dá)電泳槽底部時(shí)關(guān)閉電泳儀開關(guān)。2DE結(jié)束，將聚丙烯酰胺凝膠取出，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)G-250染色，1 g/100 mL醋酸脫色至背景清晰。

1.3.3.3 圖像掃描和質(zhì)譜鑒定

采用圖像掃描和凝膠圖像分析（PDQuest 8.0軟件）對(duì)雙向電泳凝膠上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，找出正常組和黑切組兩組間蛋白表達(dá)量相差1.5 倍以上并有顯著差異（P＜0.05）的蛋白點(diǎn)確定為差異表達(dá)蛋白。然后對(duì)差異表達(dá)蛋白的膠點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)庫（Uniprot）檢索，確定蛋白種類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在本實(shí)驗(yàn)中，pH值采用SAS 9.0軟件中混合模型分析，并采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。采用String 10.5軟件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白互作分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后45 min和24 h的pH值

極限pH值與宰后時(shí)間的交互作用對(duì)肌肉pH值影響顯著。由圖2可知，宰后45 min的正常和黑切牛肉的pH值相似（P＞0.05），宰后24 h兩組肌肉的pH值均顯著降低，但是正常牛肉的pH值（5.59）顯著低于黑切牛肉的pH值（6.54）。

圖 2 正常和黑切組宰后45 min和24 h的pH值Fig. 2 pH of normal pH and dark cutting beef at 45 min and 24 h postmortem

2.2 宰后45 min及24 h正常組牛肉與黑切組牛肉的差異表達(dá)蛋白

通過對(duì)正常和黑切組宰后45 min（初始點(diǎn)）和宰后24 h樣品的蛋白點(diǎn)分析，共鑒定出26 個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，其中宰后45 min有10 個(gè)，24 h有16 個(gè)（兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的差異點(diǎn)為6 個(gè)），這些蛋白點(diǎn)的位置如圖3所示。在宰后45 min的10 個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)（9 種蛋白）中，有8 種蛋白在正常組中表達(dá)量高（以正常組膠圖上的一個(gè)蛋白點(diǎn)與黑切組同一蛋白點(diǎn)的強(qiáng)度比值大于1.5 倍或小于0.667 倍且滿足顯著性小于5%（P＜0.05）為差異蛋白，小于0.667 倍為在正常組表達(dá)量高），只有1 種蛋白在黑切組中表達(dá)量高（大于1.5 倍表示在黑切組表達(dá)量高）。這些差異表達(dá)蛋白按照其功能可劃分為代謝酶類、抗氧化蛋白、伴侶蛋白和其他蛋白（表1）。其中腺苷酸激酶1、琥珀酸-輔酶A連接酶、肌酸激酶M和磷酸酶屬于代謝酶，參與能量代謝過程。抗氧化蛋白包括過氧化物還原酶1和過氧化物還原酶2。而兩種伴侶蛋白（熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白），分別在正常組和黑切組中表達(dá)量高。此外，還鑒定出一種結(jié)構(gòu)蛋白，為肌球蛋白輕鏈1。

圖 3 宰后45 min和24 h的差異表達(dá)蛋白2DE圖Fig. 3 Differentially expressed proteins in beef at 45 min and 24 h postmortem

宰后24 h的16 個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)鑒定出了14 種蛋白，除腺苷酸激酶1和α-晶狀體蛋白外，其余蛋白均在正常組表達(dá)量高。這些差異表達(dá)蛋白主要為代謝酶類、抗氧化蛋白、伴侶蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，其中所占比例最高的差異表達(dá)蛋白為代謝酶類，包括3 種糖酵解酶（肌肉磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶1、磷酸甘油酸變位酶2）和4 種能量代謝酶（琥珀酸-輔酶A連接酶、肌酸激酶M、磷酸酯尿苷基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷高半胱氨酸水解酶）。本研究鑒定出的3 種抗氧化蛋白包括磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶、氧化物還原酶1、氧化物還原酶2，3 種伴侶蛋白包括熱休克蛋白B1、熱休克蛋白B6和α-晶狀體蛋白。另外3 個(gè)差異點(diǎn)中，其中兩個(gè)蛋白點(diǎn)均鑒定為轉(zhuǎn)鐵運(yùn)蛋白，屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一種，另一個(gè)是肌球蛋白輕鏈1，屬于結(jié)構(gòu)蛋白。這些蛋白的具體信息如表1所示。

表 1 宰后45 min及24 h正常組牛肉相對(duì)于黑切組牛肉差異表達(dá)蛋白Table 1 Differentially expressed proteins in normal pH beef at postmortem 45 min and 24 h when compared with dark cutting beef

在鑒定出的代謝酶中，腺苷酸激酶1、肌酸激酶M、磷酸酶、琥珀酸-輔酶A連接酶、磷酸酯尿苷基轉(zhuǎn)移酶和S-腺苷高半胱氨酸水解酶參與ATP的合成和代謝過程。腺苷酸激酶-1能夠催化ATP和腺嘌呤核糖核苷酸末端磷酸基的可逆轉(zhuǎn)移，在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和腺嘌呤核苷酸代謝中起重要作用。Yu Qianqian等[22]比較了宰后早期的牛背最長(zhǎng)肌和腰大肌蛋白質(zhì)組差異，發(fā)現(xiàn)腺苷酸激酶1在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量高于腰大肌，而較高的腺苷酸激酶1表達(dá)量可以反映更高的能量代謝水平。肌酸激酶是維持肌肉內(nèi)能量正常運(yùn)轉(zhuǎn)和ATP再生的關(guān)鍵酶[19]，當(dāng)肌肉中ATP被消耗殆盡時(shí)，它會(huì)催化肌酸磷酸生成ATP和肌酸。Mahmood等[24]發(fā)現(xiàn)正常肉中的肌酸激酶M表達(dá)量高于黑切肉，與本研究的結(jié)果一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)肌酸激酶M型與宰后貯藏期間肉的紅度值呈正相關(guān)[16,18]，并且肌酸因具有清除自由基的能力而具有抗氧化作用[17]。在呼吸作用降低時(shí)，琥珀酸-輔酶A連接酶會(huì)調(diào)控底物水平磷酸化和三磷酸鳥苷/ATP的產(chǎn)生[4]，它的表達(dá)量與肌肉的能量需求有關(guān)。Poleti等[25]認(rèn)為琥珀酸輔酶A-連接酶可以為宰后肌肉的pH值下降提供能量，以促使肌肉維持正常的pH值，并發(fā)現(xiàn)它與宰后24 h的pH值呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.576）。另外，本實(shí)驗(yàn)中鑒定出的S-腺苷高半胱氨酸水解酶在核苷酸和核酸代謝中具有重要作用，Wu Wei等[20]則發(fā)現(xiàn)它在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量高于腰大肌，且與a*值呈正相關(guān)。磷酸酯尿苷基轉(zhuǎn)移酶是參與糖原合成的主要酶，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，Poleti等[25]同樣發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白在正常組的表達(dá)量高于黑切組，并推測(cè)它可能有利于糖原的儲(chǔ)備；因此，容易發(fā)生黑切肉的動(dòng)物可能是由于其本身糖原儲(chǔ)備能力低于不易發(fā)生黑切肉的動(dòng)物。本研究鑒定出的兩種糖酵解酶是肌肉磷酸化酶和葡萄糖磷酸變位酶1，其中肌肉磷酸化酶具有糖原磷酸化的作用，催化糖原轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?1-磷酸，是糖代謝的關(guān)鍵限制酶，調(diào)控著宰后能量的主要來源。葡萄糖磷酸變位酶1可以催化葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸，是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，它的表達(dá)量增加會(huì)導(dǎo)致較高的糖酵解活性[14]，這可能會(huì)影響宰后牛肉的最終極限pH值。值得注意的是，有兩個(gè)蛋白點(diǎn)均為葡萄糖磷酸變位酶，這可能是宰后蛋白質(zhì)碎片化或翻譯修飾的結(jié)果[16,21]。相較于黑切牛肉，這些能量代謝類和糖代謝酶在正常肉中的高表達(dá)量，意味著肌肉能量代謝水平更高，產(chǎn)生更多的H+，可以保證宰后pH值的降低和肌肉的正常極限pH值，它們?cè)诤谇腥獾谋磉_(dá)量低可能是黑切肉形成的直接原因，而且琥珀酸-輔酶A連接酶可以作為識(shí)別pH值差異的生物標(biāo)記。

在本研究中，所有的抗氧化蛋白在正常組表達(dá)量高。磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶是細(xì)胞內(nèi)必不可少的抗過氧化物酶，它可以直接還原磷脂氫過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜不受自由基導(dǎo)致的氧化損傷，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。同時(shí)，它還具有谷胱甘肽過氧化物酶的活性，可以通過還原氫過氧化物，降低自由基對(duì)一些關(guān)鍵酶的損害。有研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化酶和具有谷胱甘肽過氧化酶活性的過氧化物酶6與牛肉紅度呈正相關(guān)[23,26]，這可能有助于揭示正常肉肉色好于黑切肉的內(nèi)在原因。過氧化物酶又稱硫氧還蛋白過氧化物酶，是一類普遍存在于生物體內(nèi)的抗氧化蛋白，它通過硫氧還蛋白還原細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的氫過氧化物，清除超氧化物自由基和降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激，具有保護(hù)細(xì)胞的抗氧化作用[27]。本研究檢測(cè)出了過氧化物酶1和過氧化物酶2，這些抗氧化蛋白在宰后45 min正常組的高表達(dá)量，表明動(dòng)物屠宰后正常組快速開始細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激也更為強(qiáng)烈，這可能間接反映正常組代謝水平高于黑切組；另一方面，研究發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白過氧化物酶與線粒體呼吸控制速率呈正相關(guān)[28]，在本實(shí)驗(yàn)中它的高表達(dá)量說明正常組宰后45 min時(shí)的呼吸作用更強(qiáng)，間接說明ATP代謝水平更高，更有利于肌肉pH值的降低。此外，Gagaoua等[23]認(rèn)為宰后45 min抗氧化蛋白表達(dá)量較高預(yù)示著較低的極限pH值，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，因此宰后45 min的抗氧化蛋白表達(dá)量是影響黑切牛肉形成的關(guān)鍵因素之一。

本研究檢測(cè)到的兩種小熱休克蛋白（熱休克蛋白B1和熱休克蛋白B6）屬于熱休克蛋白家族的一員，是細(xì)胞內(nèi)重要的伴侶蛋白。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞處于過熱、低氧或有害氧化環(huán)境時(shí)，小熱休克蛋白（15～43 kDa）表達(dá)量就會(huì)增加，阻止蛋白發(fā)生不可逆聚集和變性，保護(hù)和維持細(xì)胞內(nèi)一些重要蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能，以及降低氧自由基，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡的作用[29]。相較于黑切肉組，小熱休克蛋白B1和B6在正常組中較高的表達(dá)量，可能是對(duì)宰后牛肉pH值快速降低做出的應(yīng)答反應(yīng)。Gagaoua等[23]曾報(bào)道宰后45 min較高的小熱休克蛋白B1表達(dá)水平間接反映了牛肉的快速代謝，并預(yù)示著宰后較低的pH值。Mahmood等[24]也發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白B1在正常肉的表達(dá)量高于黑切肉，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。此外，檢測(cè)到的α(B)-晶狀體蛋白也屬于小熱休克蛋白家族，在機(jī)體處于感染、缺氧、應(yīng)激等狀態(tài)下，α(B)-晶狀體蛋白的表達(dá)量就會(huì)上調(diào)。與本研究結(jié)果相似，前期研究發(fā)現(xiàn)α-晶狀體蛋白在黑切牛背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量高于正常肉[24,30]，此外，Gagaoua等[23]發(fā)現(xiàn)α(B)-晶狀體蛋白與宰后24 h的亮度呈負(fù)相關(guān)，這正好與黑切肉顏色暗的現(xiàn)象相對(duì)應(yīng)。因此，熱休克蛋白B1和α(B)-晶狀體蛋白可以作為識(shí)別黑切牛肉的潛在生物標(biāo)記。

此外，本研究還檢測(cè)到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白）在宰后24 h的正常組中表達(dá)量高于黑切組，轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量高可以解釋為當(dāng)供血不足，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵補(bǔ)償?shù)臋C(jī)制，Sayd等[31]曾報(bào)道轉(zhuǎn)鐵蛋白在更亮的豬肉組中表達(dá)量高于暗色豬肉組，并認(rèn)為其在糖酵解型肌肉中的表達(dá)量高。肌球蛋白輕鏈1可以調(diào)控肌球蛋白的輕鏈，有研究發(fā)現(xiàn)它可以預(yù)測(cè)宰后24 h的肌肉pH值，其表達(dá)量越高預(yù)示著極限pH值越低[23]，這與本研究的蛋白質(zhì)組和pH值的結(jié)果一致。

2.3 蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果

本研究將檢測(cè)到差異表達(dá)蛋白和數(shù)據(jù)庫中與這些差異表達(dá)蛋白相關(guān)的蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)分析，如圖4所示。與差異表達(dá)蛋白連接最多的節(jié)點(diǎn)為ATP-檸檬酸合酶（ATP-citrate synthase，ACLY），它可以催化產(chǎn)生乙酰輔酶A和ATP，并參與三羧酸循環(huán)和丁酮戊二酸的代謝過程。與ACLY有聯(lián)系的差異表達(dá)蛋白包括所有抗氧化蛋白和大多數(shù)代謝酶，說明這些差異表達(dá)蛋白直接或間接參與了能量代謝過程。另外，熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白兩個(gè)伴侶蛋白相互聯(lián)系，卻與熱休克蛋白B6分離，說明這兩種熱休克蛋白可能并不參與同一生化反應(yīng)體系。以上蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果進(jìn)一步印證了代謝酶和抗氧化蛋白可能通過參與能量代謝過程使宰后pH值降低，進(jìn)而導(dǎo)致黑切肉的形成。此外，ACLY在蛋白互作中的核心位置，表明它可能也參與黑切肉的形成。

圖 4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)圖Fig. 4 Predicted protein-protein interaction networks

3 結(jié) 論

本研究中，宰后24 h正常組的肌肉pH值為5.59，黑切組的pH值為6.54。正常組和黑切組牛肉在宰后45 min和24 h時(shí)的差異表達(dá)蛋白主要為代謝酶類、抗氧化蛋白和伴侶蛋白等，除了α-晶狀體蛋白和宰后24 h的腺苷酸激酶1在黑切組表達(dá)量高外，其他蛋白均在正常組表達(dá)量高。其中代謝酶類可以通過調(diào)節(jié)ATP的再生代謝與糖酵解進(jìn)程來影響宰后肌肉中H+的產(chǎn)生和積累，進(jìn)而影響宰后肌肉pH值的降低速率和最終極限pH值，它們?cè)谠缀笤缙诘牡捅磉_(dá)量是導(dǎo)致黑切牛肉形成的關(guān)鍵因素。抗氧化蛋白類表達(dá)量高，是對(duì)宰后代謝水平高的反應(yīng)，蛋白質(zhì)互作也說明抗氧化蛋白與能量代謝有關(guān)，它們?cè)诤谇薪M中表達(dá)量低，進(jìn)一步說明黑切肉宰后的低代謝水平。熱休克蛋白表達(dá)量與宰后氧化應(yīng)激和不利環(huán)境相關(guān)，其中熱休克蛋白B1和B6均在正常組中表達(dá)量高，而α-晶狀體蛋白在黑切組中表達(dá)量高，這也影響了宰后牛肉pH值的下降。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)宰后初期較低的代謝水平是導(dǎo)致黑切牛肉產(chǎn)生的直接原因，可將琥珀酸-輔酶A連接酶、熱休克蛋白B1和α-晶狀體蛋白作為識(shí)別黑切肉的候選蛋白生物標(biāo)記。此外，蛋白質(zhì)互作圖中的ATP-檸檬酸合酶與多種代謝酶和抗氧化酶有聯(lián)系，因此可以對(duì)其進(jìn)行深入研究，探究其與黑切肉形成的直接關(guān)系。