非小細胞肺癌中PD-L1、PD-1蛋白表達及其與EGFR基因突變的相關性研究

嵇曉輝 馮智坤 門穎麗 衛田田

肺癌是全球發病率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，約80%以上[1]，嚴重危害人類健康。肺癌從傳統的放化療到分子靶向治療，腫瘤耐藥問題仍難以解決。近年來免疫療法興起，免疫治療是利用患者自身的免疫系統來控制和清除腫瘤。程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）由90 個氨基酸組成，屬于B7-28 超家族成員。研究表明，PD-L1 不僅在活化的T 細胞、B 細胞、單核細胞呈誘導性表達，并在胃癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中表達上調且參與腫瘤的免疫逃逸機制[2～7]。當前對于PD-L1、PD-1 與EGFR 基因突變相關性的研究較少，但也有研究提示PD-1/PD-L1 通路與EGFR 通路之間存在一定的相互作用[8]。本研究旨在探討NSCLC 中PD-L1、PD-1 表達情況，分析其與EGFR 基因突變的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2015年1月～2017年12月我院病理科確診的50 例非小細胞肺癌患者肺癌組織及距腫物＞5cm 處相對正常肺組織，其中男35 例，女15例，年齡33～78 歲。所有患者術前均未行放化療。

1.2 主要試劑鼠抗人PD-1 抗體（即用型）和兔抗人PD-L1 抗體分別購自福州邁新公司和基因科技（上海）有限公司，二抗及DAB 購自福州邁新公司；石蠟組織核酸提取及EGFR 基因突變檢測試劑盒（PCR法）購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 免疫組化采用Max Vision 法，組織切片經常規脫蠟、水化、抗原修復，一抗37℃孵育2h，二抗孵育30min 后，DAB 顯色5～10min，蘇木素復染2min，用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 實時熒光定量PCR 核酸提取后的反應體系置于ABI7500 熒光定量PCR 儀中進行擴增。反應程序：第一階段42℃ 5min，95℃ 5min，1 個循環；第二階段95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10 個循環；第三階段93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，36 個循環。

1.4 結果判定PD-L1 主要表達于腫瘤細胞的胞膜和胞質。兩人雙盲觀察，二級記分法。0～3 分表示細胞著色強度：無著色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；按陽性細胞比例評分：陽性細胞＜1%為0 分，陽性細胞1%～10%為1 分，陽性細胞11%～49%為2 分，陽性細胞≥50%為3 分。染色強度與相應的百分比相乘，得分≥3 定義為陽性表達。PD-1 主要表達于活化T 細胞胞膜和胞質。細胞計數法評估，低倍鏡下觀察整張切片，尋找淋巴細胞密度高區域，并隨機選取5 個高倍視野，每視野計數淋巴細胞100 個，PD-1 陽性細胞數為其平均值。以全部患者PD-1 陽性細胞數均數作為閾值，高于該閾值者為陽性表達，反之即為陰性表達[9]。

1.5 統計學分析采用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，各組間樣本率的比較及其與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗，相關性采用Pearson 相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1、PD-1 蛋白在正常肺組織及非小細胞肺癌組織中的表達50 例肺癌組織中PD-L1 陽性率為52.00%（26/50），PD-1 陽性率為60.00%（30/50），正常肺組織中PD-L1、PD-1 陽性率均為0（0/50）。肺癌組織中PD-L1、PD-1 陽性率均高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）。PD-L1 和PD-1 在肺癌組織中的表達見圖1、2。

圖1 PD-L1 在非小細胞肺癌組織中的表達

圖2 PD-1 在非小細胞肺癌組織中的表達

2.2 PD-L1、PD-1 蛋白表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系PD-L1 和PD-1 蛋白在有淋巴結轉移和無淋巴結轉移患者中陽性率分別為75.00%和80.00%、36.67%和46.67%，在TNM 分期較低和較高者中陽性率分別為39.29%和68.18%、42.86%和81.82%，與淋巴結轉移及TNM 分期有關，差異有統計學意義（P<0.05）；與患者年齡、性別、吸煙、腫瘤大小及分化程度無關（P>0.05），見表1。

2.3 PD-L1、PD-1 蛋白表達與EGFR 基因突變的相關性在PD-L1 和PD-1 蛋白表達陽性肺癌患者中EGFR 基因突變率分別為26.92%和30.00%，相關性分析表明，PD-L1 蛋白表達與EGFR 基因突變無相關性（r=0.176，P>0.05）；PD-1 蛋白表達與EGFR 基因突變無相關性（r=0.201，P>0.05）。

2.4 PD-L1、PD-1 蛋白在非小細胞肺癌組織中表達的相關性50 例非小細胞肺癌組織中PD-L1 蛋白表達陽性者26 例，其中20 例PD-1 蛋白表達亦陽性，陽性率為76.92%。經相關性分析，50 例非小細胞肺癌組織中PD-L1 蛋白與PD-1 蛋白表達呈正相關（r=0.336，P<0.05），見表2。

表1 非小細胞肺癌組織中PD-L1、PD-1 蛋白表達與臨床病理特征及EGFR 基因突變的關系（n）

表2 非小細胞肺癌中PD-L1 和PD-1 蛋白表達的關系（n）

3 討論

PD-1（CD279）是免疫球蛋白超家族I 型跨膜糖蛋白，由細胞外IgV 區、疏水性跨膜區、細胞質區組成，主要表達于活化的T 細胞表面，最早在小鼠T 細胞、B 細胞程序性細胞死亡中被發現。其配體為PD-L1（B7-H1/CD274）、PD-L2（B7-DC/CD273）。PD-L1、PD-L2 是I 型跨膜糖蛋白，由IgC 和IgV 結構域組成。PD-L1 廣泛表達于T 細胞、B 細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及多種腫瘤細胞[10～12]，PD-L1 與PD-1 相結合可有效抑制活化淋巴細胞，導致T 淋巴細胞凋亡，此種免疫負調控作用致使腫瘤細胞免疫逃逸，最終導致腫瘤生長及擴散。免疫抑制劑的應用能夠阻斷信號通路，降低免疫逃逸的發生，加速腫瘤凋亡，達到消除腫瘤的目的。最新研究發現，PD-1/PD-L1 在肺腺樣囊性癌中的表達率均較低[13]。研究顯示NSCLC 中PD-L1 的陽性表達率為39.9%～53.1%，PD-1 為29.2%～75.0%[14]。本研究中肺癌組織PD-L1 陽性率為52.00%（26/50），PD-1 陽性率為60.00%（30/50），PD-L1 和PD-1 蛋白在肺癌組織中高表達。在26 例PD-L1 陽性患者中有20 例PD-1 蛋白表達陽性，陽性率為76.92%，經相關性分析，PD-L1 和PD-1 在非小細胞肺癌患者中的表達呈正相關，與文獻報道一致[14]。同時，本研究發現，非小細胞肺癌患者中PD-L1 和PD-1的表達與患者年齡、性別、有無吸煙史、腫瘤大小以及分化程度均無關，但與淋巴結是否轉移及TNM分期均有關，有淋巴結轉移者較無淋巴結轉移者PD-L1 和PD-1 的表達陽性率更高，且隨著腫瘤分期程度升高PD-L1 和PD-1 的表達陽性率也越高。

EGFR 基因突變與非小細胞肺癌的研究是近年來的熱點，PD-L1 可能在EGFR 突變型肺癌的發生發展中參與了免疫逃逸過程，利用免疫檢查點阻滯劑抗體阻斷PD-1 信號通路可能會抑制EGFR 突變型患者的腫瘤生長，延緩疾病進展，提高生存率。研究顯示，肺腺癌中EGFR 野生型標本中PD-L1 和PD-1 的陽性率均高于突變型，但與突變類型無相關性[8]。另有研究認為，在NSCLC 中EGFR 突變型PD-L1 的陽性率更高，可能更適合PD-1 免疫制劑治療[15]。本研究中，50 例非小細胞肺癌患者中17例存在EGFR 基因突變，其中PD-L1 蛋白陽性表達者僅7 例，表達陽性率為41.18%，而在33 例野生型EGFR 患者中有19 例PD-L1 蛋白表達呈陽性，表達陽性率為57.58%。相關性分析顯示，非小細胞肺癌患者中PD-L1 蛋白表達與EGFR 基因突變之間未見明顯相關性。

綜上所述，目前對于EGFR 基因突變與PD-L1、PD-1 表達的相關性研究結果不一，大樣本多中心的研究對于免疫及靶向治療至關重要。此外，外周血中動態監測EGFR 基因突變與PD-L1、PD-1 的表達對于評估疾病進展與生存時間意義重大[16]。總之，PD-L1、PD-1 在非小細胞肺癌中的表達可作為判斷預后的重要指標，是肺癌免疫治療的新策略，化療聯合免疫治療可使非小細胞肺癌患者在保證治療安全的同時提高療效，使晚期非小細胞肺癌患者從中獲益。