南昆山毛葉茶三種多酚的分離純化及抗氧化研究

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(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

南昆山毛葉茶(CamelliaptilophyllaChang)屬山茶科、山茶屬、茶亞屬、茶組、茶系植物,為張宏達教授于20世紀80年代在中國廣東省龍門縣南昆山發現的一種特殊茶樹資源[1]。其與傳統茶葉(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)中生物堿和兒茶素組成不同,生物堿以可可堿為主,兒茶素以沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)為主[2-3];而且,Kurihara等在南昆山毛葉茶中發現了傳統茶葉中迄今尚未發現的2種特殊多酚物質1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖(1,2,4,6-GA-glc)和兒茶素-3,5-二沒食子酸酯(GC-3,5-diGA)[4]。目前,南昆山毛葉茶的研究主要集中在茶葉化學成分分析[5]和溶劑提取物的抗氧化[6-7]、抗過敏[8]、抗炎[9]、抗癌[10]、降血脂[11]等功能活性評價,采用的材料多為其提取混合物,而對南昆山毛葉茶中特殊多酚單體物質的分離純化及功能評價的研究相對較少,Li等從南昆山毛葉茶中分離出GCG和一種新型花青素-GC-(4→8)-GCG,其分別具有降脂減肥和抗血管疾病的功效[12-13],而對1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA的分離純化及抗氧化活性等研究鮮見報道。

本研究以南昆山毛葉綠茶為材料,采用Sephadex LH-20柱層析和制備型高效液相色譜聯用法從南昆山毛葉綠茶中分離提取得到高純度的GCG和2種特殊的多酚物質1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA,通過DPPH、ABTS、FRAP和ORAC四種化學方法及L-O2肝細胞氧化應激模型,綜合評價3種多酚物質的抗氧化活性,以期為南昆山毛葉茶功能特性研究和開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南昆山毛葉茶春梢1芽2～3葉 采自廣東省惠州市龍門縣南昆山,鮮葉采用鍋式殺青(260 ℃,8 min),經攤涼、揉捻(30 min)、初烘(120 ℃,10 min)、攤涼、復烘(90 ℃,15 min),制成綠茶；表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),純度≥97% 由湖南農業大學茶學重點實驗室提供;羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)、2,2′-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國Sigma公司;熒光素鈉(FL),純度≥98.5% 上海源葉生物科技有限公司;雙乙酸鈉 廣州化學試劑廠;無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇(分析純) 天津大茂化學試劑廠;甲酸(色譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;甲醇(色譜純) 上海安譜實驗科技股份有限公司;人肝細胞L-O2中國科學院細胞庫。

BT25S電子天平 瑞士Mettle Toledo公司;Milli-Q Integral 3純水機 德國Merk-Millipore公司;HSC-12B氮吹儀 天津市恒奧發展有限公司;R-3旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;Alpha 1-2 Ldplus冷凍干燥機 德國Martin Chris公司;BT300M/YZ1515x蠕動泵 保定申辰泵業有限公司;Agilent1 200高效液相色譜儀、Agilent 6540飛行時間質譜儀 美國Agilent公司;LC3000制備型高效液相色譜儀 北京創新通恒科技有限公司;VersaMax酶標儀 美國Molecular Devices公司;Bruker Avance 600 Hz核磁共振儀、Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 30%乙醇/乙酸乙酯提取物的制備 稱取10.0 g過20～30目篩的茶葉于錐形瓶中,加入100 mL 30%乙醇水溶液,70 ℃水浴浸提25 min后過濾,濾渣重復浸提1次;合并濾液,70 ℃恒溫攪拌30 min以除去乙醇;加入等體積的乙酸乙酯充分振蕩萃取,避光靜置0.5 h,重復萃取1次,合并上層乙酸乙酯相,旋轉蒸發儀濃縮,氮吹儀吹干,-20 ℃貯藏備用。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A:水(0.2%甲酸),B:甲醇。梯度洗脫程序:0 min(A:81.5%,B:18.5%)→5 min(A:79%,B:21%)→20 min(A:64.5%,B:35.5%)→25 min(A:61.5%,B:38.5%),后運行4 min;檢測波長:280 nm;流速:1 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.3 Sephadex LH-20柱層析對30%乙醇/乙酸乙酯提取物的分離純化 Sephadex LH-20的活化:采用無水乙醇將凝膠浸泡1～2 h;裝柱:將活化脫氣的Sephadex LH-20填入層析柱內,柱體積(BV)400 mL;平衡:依次緩慢加入1BV 95%乙醇、75%乙醇、55%乙醇,確保柱內充滿55%乙醇。上樣濃度1 g/mL,上樣體積10 mL;洗脫方式:1 BV 55%乙醇→1 BV 75%乙醇→1 BV 95%乙醇,流速:1.0 mL/min;收集:10 mL/管。取1 mL餾分,0.45 μm針式過濾器過濾,HPLC檢測,方法參照1.2.2,合并保留時間相同的餾分,濃縮凍干得粉末狀樣品,-20 ℃貯藏備用。

1.2.4 制備型高效液相色譜進一步純化 色譜柱:COSMOSIL 5C18-MS-II(20 mm I.D×250 mm);流動相:A:水,B:甲醇;洗脫程序:0 min(A:81.5%,B:18.5%)→8 min(A:79%,B:21%)→40 min(A:60%,B:40%)→45 min(A:81.5%,B:18.5%),流速12 mL/min;上樣濃度20 mg/mL,上樣體積100 μL;檢測波長210 nm。溶解1.2.3得到的凍干粉,按照上述方法分離,HPLC檢測餾分,方法參照1.2.2,合并保留時間相同的餾分,濃縮凍干得粉末狀樣品,-20 ℃貯藏備用。

1.3 結構鑒定

鑒定1.2.4得到的化合物結構,質譜分析采用負離子掃描模式,掃描范圍m/z 105～1200,干燥氣溫度300 ℃,霧化器壓力50 psi,流速9 L/min,檢測電壓為3 kV;核磁共振分析采用Bruker Avance 600核磁共振儀掃描得到1H和13C圖譜;紅外光譜分析采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描(400～4000 cm-1)。

1.4 多酚單體物質的化學抗氧化能力測定

1.4.1 DPPH自由基清除能力測定 參考Chen等方法[14],吸取200 μL濃度為0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液,與10 μL適當稀釋的樣品/水混合于96孔板中。25 ℃下避光反應30 min。采用酶標儀測定樣品在517 nm處的吸光值A樣品,水在517 nm處的吸光值A對照。

1.4.2 ABTS自由基清除能力測定 參考Re等方法[15],將7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,避光室溫放置16 h,配制成ABTS溶液,用PBS將ABTS溶液稀釋至734 nm下吸光值為0.70(±0.02)。取10 μL適當稀釋的樣品/水與200 μL ABTS溶液混合,30 ℃下避光反應6 min。采用酶標儀測定樣品在734 nm處的吸光值A樣品,水在734 nm處的吸光值A對照。

1.4.3 FRAP測定 參考Benzie等方法[16],稍作改動。FRAP工作液配制:雙乙酸鈉溶液(300 mmol/L):TPTZ溶液(10 mmol/L,用40 mmol/L HCl溶液配制):FeCl3水溶液(20 mmol/L)按10∶1∶1比例混合。吸取15 μL水和5 μL適當稀釋的樣品溶液加入到96孔板中,加入150 μL FRAP工作液,混勻,37 ℃下避光靜置4 min,采用酶標儀測定樣品在593 nm的吸光值。

1.4.4 ORAC測定 參考續潔琨等方法并加以修改[17]。首先依次加入20 μL磷酸緩沖液(pH7.4)、樣品溶液、Trolox標準液到96孔黑板中,然后使用多孔道移液槍向各孔加入120 μL FL工作液(0.117 μmol/L),將96孔黑板放入已預熱30 min的酶標儀中,振蕩15 s,37 ℃孵育15 min,孔中迅速加入60 μL偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)(40 mmol/L)。以激發波長(485±20) nm、發射波長(530±20) nm連續測定熒光強度,每2 min測定一次,測定時間2 h,整個體系保持37 ℃。各微孔不同時間點的絕對熒光強度數據與初始時間的熒光強度相比(初始熒光強度值設置為1),計算相對熒光強度f,采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積(AUC)。

1.5 多酚單體物質的細胞抗氧化活性評價

1.5.1 細胞培養 人正常肝細胞L-O2經解凍復蘇后,培養于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中,培養液為89%DMEM培養基(含酚紅)、10%胎牛血清、1%青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL),每2 d繼代一次。

1.5.2 建立L-O2細胞氧化應激模型 參考尹學哲等[18]和Jeon等[19]方法。取L-O2細胞以1×105個/mL濃度接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、含5%的CO2培養箱中培養,24 h后分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的H2O2溶液,作用4 h。吸凈培養液,加入100 μL 0.25 mg/L MTT溶液,37 ℃孵育2 h,再加入200 μL DMSO,37 ℃振蕩15 min后,酶標儀測定550 nm波長處吸光值。

1.5.3 多酚物質對L-O2細胞增殖的影響 取L-O2細胞以1×105個/mL的細胞濃度接種于96孔培養板中,置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養,24 h后加入不同濃度的多酚物質溶液(0、12.5、25、50、100 μg/mL),作用24 h。吸凈培養液加入100 μL 0.25 mg/L MTT溶液,37 ℃孵育2 h,再加入200 μL DMSO,37 ℃振蕩15 min后,酶標儀測定550 nm波長處吸光值。

1.5.4 多酚物質對L-O2細胞氧化應激的保護作用 取L-O2細胞以1×105個/mL的細胞濃度接種于96孔培養板中,24 h后用于實驗。實驗分為5組:對照組、模型組及樣品高、中、低劑量組。對照組加入培養基培養,模型組加入一定濃度H2O2溶液,樣品組在加入H2O2溶液前先加入不同濃度的多酚物質預孵2 h。H2O2作用4 h后,吸凈培養液,加入100 μL 0.25 mg/L MTT溶液,37 ℃孵育2 h,再加入200 μL DMSO,37 ℃振蕩15 min后,酶標儀測定550 nm波長處吸光值。

1.6 數據統計及圖像處理方法

數據以平均值±標準偏差表示,采用SPSS 16.0和OriginPro 9.0進行統計分析和繪圖,每個實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 HPLC分析

本研究以南昆山毛葉綠茶為實驗材料,經30%乙醇浸提、乙酸乙酯萃取,獲得其提取物,采用HPLC和LC-MS分析,結果如圖1和圖2所示。

圖1 30%乙醇/乙酸乙酯提取物的HPLC圖譜Fig.1 HPLC diagram of 30% ethanol/ethyl acetate extracts

圖2 30%乙醇/乙酸乙酯提取物的LC-MS圖譜Fig.2 LC-MS diagram of 30% ethanol/ethyl acetate extract 注:A:峰1的分子離子掃描圖;B:峰2的分子離子掃描圖;C:峰3的分子離子掃描圖。

從圖1中可以看出,提取物中雜峰較多,分析其與提取物中含有較多的可可堿、兒茶素和色素等物質有關。采用LC-MS掃描,結果見圖2,峰1的主要分子離子為457 m/z[M-H]+,峰2的主要分子離子為787 m/z[M-H]+,峰3的主要分子離子為609 m/z[M-H]+,為此,使用Sephadex LH-20層析柱分離提取物,分別收集以物質1、2、3為主的餾分,濃縮凍干成粉。稱100 μg凍干粉,1 mL甲醇溶解過膜,HPLC檢測后根據面積歸一化方法計算得出物質1、2和3的純度分別為72%、48%和40%。為了進一步提高目標物的純度,采用制備型液相色譜再次分離純化上述凍干粉,收集目標餾分,濃縮凍干成粉,HPLC檢測結果如圖3所示,計算得出物質1、2和3的純度為98%、96%和97%,得率分別為2.45%、0.55%、0.31%。

圖3 制備液相分離純化后3種物質的HPLC圖譜Fig.3 HPLC diagram of three kinds of substances prepared by liquid phase separation and purification注:A:物質1;B:物質2;C:物質3。

2.2 結構鑒定

采用高效液相色譜-串聯質譜、核磁共振和紅外光譜技術對純度為98%、96%和97%的物質1、2和3進行結構鑒定,得到結果如下。

通過分子特征提取技術,借助MFE軟件和譜庫獲得3種物質結構組成信息,母離子和主要碎片離子,推測結構如圖4所示。

圖4 3種物質的LC-MS/MS圖譜Fig.4 LC-MS/MS diagram of three kinds of substances注:A:物質1;B:物質2;C:物質3。

3種物質的1H核磁共振、13C核磁共振圖譜如圖5所示。

圖5 3種物質的氫譜(1H)和碳譜(13C)圖譜Fig.5 Hydrogen spectrum(1H)and carbon spectrum(13C)spectrum of three substances 注:A:物質1;B:物質2;C:物質3。

進一步對3種物質進行紅外光譜分析,結果如圖6所示。3280～3340 cm-1是酚羥基的OH伸縮振動峰,1688～1700 cm-1是芳香酮的C=O伸縮振動峰,1027～1235 cm-1顯示為芳香醚的C-O-C伸縮振動峰[20],1449～1627 cm-1顯示苯環骨架特征振動峰[21],紅外圖譜結果顯示3種物質均具有苯環結構、酚羥基基團、芳香酮基團和芳香醚基團。

綜合上述結果,根據質譜分析、氫原子和碳原子的化學位移值和紅外光譜分析,結合相關文獻報道[22-24],鑒定物質1為沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG,C22H18O11),物質2為1,2,4,6-四沒食子酰葡萄糖(1,2,4,6-GA-glc,C34H28O22),物質3為兒茶素-3,5-二沒食子酸酯(GC-3,5-diGA,C29H22O15)。3種多酚單體物質的結構式如圖7所示。

2.3 抗氧化活性評價

本研究以EGCG為對照,采用DPPH、ABTS、FRAP和ORAC四種化學方法及L-O2肝細胞氧化應激模型,綜合分析GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA這3種多酚單體物質的抗氧化活性。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 4種多酚物質對DPPH自由基的清除作用如圖8所示。在30～80 μg/mL濃度范圍內,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA的DPPH自由基清除率隨著濃度的增大而提高,呈現出劑量依賴關系。當濃度30～60 μg/mL時,GCG的DPPH自由基清除率高于EGCG,GC-3,5-diGA與EGCG接近,1,2,4,6-GA-glc比EGCG低;當濃度在60～80 μg/mL時,GCG對DPPH自由基清除率與EGCG相當,GC-3,5-diGA比EGCG低,高于1,2,4,6-GA-glc。經計算,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA清除DPPH自由基的IC50值分別是46.21±1.43、44.15±0.57、57.67±1.11和49.43±0.25 μg/mL。

圖7 3種多酚單體物質的化學結構Fig.7 Chemical structure of three kinds of polyphenolic monomers注:A:GCG;B:1,2,4,6-GA-glc;C:GC-3,5-diGA。

圖6 3種物質的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of three substances 注:A:物質1;B:物質2;C:物質3。

圖8 4種多酚物質對DPPH自由基的清除作用Fig.8 DPPH free radical scavenging activity of four kinds of polyphenols

2.3.2 ABTS自由基清除能力 4種多酚物質對ABTS自由基的清除作用如圖9所示。在10～60 μg/mL濃度范圍內,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA隨著濃度增大而ABTS自由基清除能力增強,呈現出良好的劑量依賴關系。當濃度為60 μg/mL時,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA對ABTS自由基的清除率為78.65%±0.56%、84.21%±0.56%、71.55%±0.76%和77.25%±1.16%,表現出較強的ABTS自由基清除能力,經計算,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA清除ABTS自由基的IC50值分別是32.98±0.59、31.93±1.00、37.87±0.25和35.06±0.27 μg/mL。

圖9 4種多酚物質對ABTS自由基的清除作用Fig.9 ABTS free radical scavenging activity of four kinds of polyphenols

2.3.3 FRAP測定 4種多酚物質的FRAP結果如圖10所示。在50～90 μg/mL濃度范圍內,隨著樣品濃度的增大,其Fe3+還原能力隨之增強,當濃度為90 μg/mL時,EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA的吸光值為0.36±0.01、0.44±0.01、0.32±0.01和0.31±0.01,樣品的Fe3+還原能力強弱順序為:GCG>EGCG>1,2,4,6-GA-glc、GC-3,5-diGA。

圖10 4種多酚物質的Fe3+還原能力Fig.10 FRAP of four kinds of polyphenols

2.3.4 ORAC測定 4種多酚物質的ORAC值如圖11所示,計算得到GCG、EGCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA的ORAC值分別為4.33±0.25、4.92±0.41、6.55±0.09和4.99±0.55 mmol TE/g,由此1,2,4,6-GA-glc的氧自由基吸收能力最佳,EGCG、GCG和GC-3,5-diGA作用相當,沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖11 4種多酚物質的ORAC值Fig.11 ORAC value of four kinds of polyphenols注:字母不同表示顯著性差異(P<0.05)。圖12同。

DPPH、ABTS、FRAP三種化學方法測定得到的TEAC值(以Trolox為標準品制作標準曲線,結果表示為每克樣品的Trolox毫摩爾當量(mmol TE/g),即TEAC值)見表1。從表1可看到,三種化學方法的抗氧化能力趨勢大體一致:GCG>EGCG>GC-3,5-diGA>1,2,4,6-GA-glc,綜合可得,本研究分離得到的3種多酚物質均具有強化學抗氧化能力,其中GCG最佳,GC-3,5-diGA次之,1,2,4,6-GA-glc較弱。

表1 4種多酚物質的TEAC值Table 1 Chemical antioxidant activity of four kinds of polyphenols

注:同列肩標字母不同表示顯著性差異(P<0.05);TEAC值越大,表示抗氧化能力越強。

2.3.5 L-O2細胞氧化應激模型的建立 在采用4種化學抗氧化方法分析3種多酚物質的抗氧化能力的基礎上,本研究建立L-O2細胞氧化應激模型,進一步評價3種多酚物質的細胞抗氧化活性,以EGCG為對照。首先將不同濃度的H2O2作用于L-O2細胞4 h,根據細胞存活率確定H2O2的作用濃度,結果如圖12所示。

圖12 H2O2濃度對L-O2細胞存活率的影響Fig.12 Influence of H2O2 concentration on cell viability of L-O2 cells

由圖12可知,與對照組相比,當H2O2濃度在0.4～0.8 mmol/L范圍時,H2O2處理對細胞存活率無顯著影響(P>0.05),說明此濃度范圍的H2O2對細胞無毒害作用;當H2O2濃度為1.0～1.4 mmol/L時,經H2O2處理后細胞存活率顯著降低(P<0.05),并且隨著濃度增大,細胞存活率顯著下降(P<0.05),表明該濃度范圍的H2O2對細胞有毒性作用。當H2O2濃度為1.2 mmol/L時,細胞存活率下降到49.17%±1.02%,由于細胞存活率為50%左右時H2O2濃度適合建立細胞氧化應激模型[25],所以選取1.2 mmol/L H2O2為作用濃度。

2.3.6 多酚物質對L-O2細胞增殖的影響 本研究在探究樣品對氧化應激的保護作用之前,先進行毒性實驗,摸索一個無毒副作用的濃度范圍,結果如圖13所示。

圖13 4種多酚物質對L-O2細胞增殖的影響Fig.13 Effects of four kinds of polyphenols on proliferation of L-O2 cells注:“#”表示樣品組與對照組存在顯著性差異(P<0.05,n=3)。

從圖13可得,在12.5～100 μg/mL范圍內,EGCG、GCG和GC-3,5-diGA作用24 h后細胞的存活率均高于90%,表明這3種多酚物質對細胞的正常增殖沒有明顯影響,而在此濃度范圍內,1,2,4,6-GA-glc的存活率與正常培養基相比,均具有顯著性差異(P<0.05),但是濃度為12.5和25 μg/mL時,1,2,4,6-GA-glc的存活率分別為88.45%±1.41%和89.27%±1.69%,存活率接近90%。為了研究物質的抗氧化活性,本研究后續實驗選擇的EGCG、GCG和GC-3,5-diGA濃度范圍≤100 μg/mL,1,2,4,6-GA-glc的濃度為≤25 μg/mL。

2.3.7 多酚物質對L-O2細胞氧化應激的保護作用 4種多酚物質對氧化損傷的L-O2細胞的保護作用如圖14所示。

圖14 4種多酚物質對對氧化損傷的L-O2細胞的保護作用Fig.14 Protective effects of four kinds of polyphenols on oxidative damage of L-O2 cells注:“*”表示模型組與對照組存在顯著性差異(P<0.05,n=3);“#”表示樣品組與模型組存在顯著性差異(P<0.05,n=3)。

由圖14可知,與對照組相比,模型組的細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,在實驗濃度內,除低劑量(25 μg/mL)的EGCG和(25和50 μmol/L)GCG對細胞存活率無顯著影響外(P>0.05),4種多酚物質處理均可顯著提高細胞存活率(P<0.05),呈現出良好的劑量依賴關系。在濃度為100 μg/mL時,EGCG、GCG和GC-3,5-diGA處理后使細胞存活率分別提高了38.66%±4.59%、26.98%±1.96%、35.58%±5.37%;濃度為25 μg/mL時,1,2,4,6-GA-glc使細胞存活率提高了70.87%±3.61%。分析上述結果可得,低劑量的GCG和EGCG對細胞存活率無顯著影響(P>0.05),高劑量的EGCG、GCG、1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA預處理均能顯著提高細胞存活率(P<0.05),以降低H2O2對L-O2細胞的氧化損傷;GC-3,5-diGA細胞氧化損傷保護作用強于GCG,與EGCG相當;1,2,4,6-GA-glc雖然具細胞低毒性,但低濃度就具有較強的細胞氧化損傷保護作用。

綜合上述抗氧化結果,證實南昆山毛葉茶中GCG和2種特殊多酚物質1,2,4,6-GA-glc、GC-3,5-diGA都具有良好的抗氧化活性。DPPH、ABTS和FRAP三種化學方法測得的抗氧化結果基本一致:GCG>EGCG>GC-3,5-diGA>1,2,4,6-GA-glc。EGCG作為GCG的同分異構體,在30～60 μg/mL濃度范圍內,GCG清除DPPH自由基的能力強于EGCG,這結果與已報道低濃度GCG在清除大分子自由基能力強于EGCG[26]的結論一致;Kumamoto等[27]研究發現,溶液中的金屬離子Fe2+會弱化EGCG的抗氧化活性,由此推測GCG鐵離子還原能力強可能由于其空間結構受pH和Fe2+的弱化影響較小;GC-3,5-diGA在結構上是由GCG結構上A環的5-OH的氫原子被沒食子酰基取代而成,由此可得,A環上的5-OH可以增強多酚單體物質的抗氧化能力;由于黃酮類物質具有較強的抗氧化活性[28],具有類黃酮母核結構的GCG和GC-3,5-diGA的抗氧化活性強于1,2,4,6-GA-glc。ORAC法的結果與上述三種化學方法的結果相反,而與細胞抗氧化結果相似,這與ORAC法具有生物相關性有關[29],本研究L-O2細胞氧化應激保護結果顯示,3種多酚物質可顯著提高細胞存活率,減少氧化損傷,但是其抗氧化分子機理還需進一步深入研究。Peng等[30]研究發現南昆山毛葉茶的抗氧化活性強于傳統茶,推測這可能與茶中的多酚物質相關。GCG是南昆山毛葉茶中含量最多的兒茶素,1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA為南昆山毛葉茶中的特殊物質,本研究表明這3種物質均具有強抗氧化活性,但是其在南昆山毛葉茶抗氧化活性中的貢獻程度還有待進一步探究。

3 結論

本研究以南昆山毛葉綠茶為研究原料,采用Sephadex LH-20柱層析和制備型高效液相色譜聯用的方法得到3種物質,并通過高效液相色譜-串聯質譜、核磁共振方法和紅外色譜方法鑒定其為GCG、1,2,4,6-GA-glc、GC-3,5-diGA,純度分別為98%、96%、97%,得率分別為2.45%、0.55%、0.31%。

為研究南昆山毛葉茶中3種多酚物質的抗氧化活性,以EGCG為對照,分別采用DPPH、ABTS、FRAP和ORAC四種化學方法及L-O2肝細胞氧化應激模型法對其進行綜合評價。結果顯示,前三種化學方法測得的抗氧化結果基本一致:GCG>EGCG>GC-3,5-diGA>1,2,4,6-GA-glc,ORAC法的結果與此結果相反,1,2,4,6-GA-glc效果最佳。L-O2細胞氧化應激保護結果顯示,高劑量的EGCG、GCG、GC-3,5-diGA和1,2,4,6-GA-glc可明顯提高細胞存活率,減少氧化損傷,抗氧化能力強弱順序:1,2,4,6-GA-glc>GC-3,5-diGA、EGCG>GCG。綜合比較抗氧化結果,南昆山毛葉茶中GCG具有較強的化學抗氧化能力,2種特殊多酚物質1,2,4,6-GA-glc和GC-3,5-diGA具有強細胞抗氧化能力。