線粒體DNA甲基化的研究進(jìn)展

曹珈琪 林文 丁磊 張宜林 崔清華

[摘要]DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，催化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)（CpG），即DNA序列中胞嘧啶后緊連鳥嘌呤的位點(diǎn)，一般稱為CpG島，中胞嘧啶位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶，是表觀遺傳修飾的重要方式之一。研究已證實(shí)核基因組中DNA甲基化的改變與許多復(fù)雜疾病有關(guān)。近來(lái)，線粒體DNA（mtDNA）甲基化也正在受到越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是mtDNA甲基化在疾病及線粒體基因調(diào)控中的重要作用。本文對(duì)核基因組與線粒體DNA甲基化的關(guān)系進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，并介紹了影響mtDNA甲基化的相關(guān)因子以及mtDNA甲基化與神經(jīng)退行性疾病，癌癥等疾病的聯(lián)系，對(duì)產(chǎn)生的潛在影響以及作用機(jī)制等進(jìn)行概述。

[關(guān)鍵詞]線粒體;甲基化;線粒體DNA;神經(jīng)退行性疾病;癌癥

[中圖分類號(hào)] R722.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）2（c）-0017-05

Research progress in mitochondrial DNA methylation

CAO Jia-qi1，2? ?LIN Wen1，2? ?DING Lei1，2? ?ZHANG Yi-lin1，2? ?CUI Qing-hua1，2

1. Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology， School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming? ?650500， China; 2. Key Laboratory for Biochemistry and Molecular Biology of Yunnan Colleges and Universities， Yunnan Province， Kunming? ?650500， China

[Abstract] The epigenetic alteration centered around the DNA methylation modification of cytosine phosphate guanine （CpG） islands. The DNA methylation associated with the addition of a methyl group that is from s-adenosylmethionine （SAM） to a cytosine base in the dinucleotide sequence CpG islands catalyzed by DNA methyltransferases （DNMTs）， and involved in many complex diseases clinical management. Recently， many studies focused on the mitochondrial DNA （mtDNA） methylation， especially the vital role associated with the mitochondrial gene regulation and the mitochondrial related diseases. This review briefly summarized the relationship between mitochondrial DNA methylation and nuclear genome， furthermore， this review also introduces the factors related to mtDNA methylation and many diseases related to mtDNA methylation， such as neurodegenerative diseases and cancer. As well as the potential impacts and mechanisms of mtDNA methylation involve in these diseases.

[Key words] Mitochondria; Methylation; Mitochondrial DNA; Neurodegenerative disease; Cancer

線粒體作為真核細(xì)胞內(nèi)部最重要的細(xì)胞器之一，通過(guò)氧化磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞行使各種生命活動(dòng)所需要的能量并參與脂肪酸的合成及某些蛋白質(zhì)的合成，且在細(xì)胞周期及細(xì)胞程序性死亡中具有重要調(diào)控作用[1]。線粒體是一種半自主的細(xì)胞器，有自身獨(dú)特的DNA和遺傳密碼[2]。mtDNA有16 569堿基對(duì)，是由一條重鏈（H鏈）和一條輕鏈（L鏈）構(gòu)成的閉合環(huán)，兩條鏈均具有獨(dú)立編碼區(qū)和非編碼區(qū)[3]。編碼區(qū)共編碼37個(gè)基因，其中H鏈負(fù)責(zé)大部分的編碼工作，包括12個(gè)氧化磷酸化系統(tǒng)蛋白，2個(gè)核糖體RNA分子（rRNA 12S和16S）以及14個(gè)tRNA;L鏈則編碼另外8個(gè)tRNA和一個(gè)氧化磷酸化系統(tǒng)蛋白。非編碼區(qū)則包含了H鏈的復(fù)制起點(diǎn)、H鏈和L鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子D環(huán)（D-loop）區(qū)，是線粒體DNA（mtDNA）復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心，其突變可以引起許多線粒體疾病[4]。近年來(lái)，mtDNA的甲基化在線粒體基因表達(dá)中的調(diào)控作用受到更多關(guān)注，甲基化異常與多種疾病相關(guān)。

1核基因組DNA的甲基化

核基因組DNA甲基化是表觀遺傳的重要方式之一，主要通過(guò)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾參與基因表達(dá)調(diào)控[5]，是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基的過(guò)程[6]。哺乳動(dòng)物有三種主要的核基因組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶：DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是最豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶，活躍在整個(gè)成年期，維持生物體的DNA甲基化活性和模式[7];DNMT3A和DNMT3B可使去甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤位點(diǎn)（CpG）重新甲基化。此外，DNMT2負(fù)責(zé)將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RNA而不是DNA[8];DNMT3L是DNMT3A的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)輔因子[9]。

2 mtDNA甲基化

mtDNA是否受到甲基化修飾一直存在爭(zhēng)議[10-14]。1971年，研究人員發(fā)現(xiàn)泥鰍胚胎線粒體中含有5-甲基胞嘧啶（5-mC）形成所必需的DNMT，表明mtDNA極可能存在甲基化修飾現(xiàn)象。1974年證實(shí)牛心肌線粒體中也存在5-mC[15]。2011年，在線粒體中發(fā)現(xiàn)了與核DNMT1同型的線粒體亞型DNMT1（mtDNMT1），證實(shí)了mtDNMT1與線粒體的D環(huán)控制區(qū)結(jié)合并形成5-mC，調(diào)控線粒體基因表達(dá)，且mtDNMT1與線粒體基因組結(jié)合的方式與CpG二核苷酸的密度成正比[16]。DNMT3A也在線粒體中被發(fā)現(xiàn)，特別是在病理性神經(jīng)退行性疾病條件下[17]。此外，最近的一項(xiàng)研究表明線粒體也可能含有DNMT3B[18]，但是這兩種酶在mtDNA甲基化中的作用尚不清楚。

3核基因與線粒體DNA甲基化的關(guān)系

線粒體和核基因組DNA密切溝通和互動(dòng)，二者共同調(diào)節(jié)代謝和凋亡途徑[19]。核基因組主導(dǎo)的表觀遺傳改變可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體基因的表達(dá)來(lái)影響線粒體功能，細(xì)胞中特定的mtDNA拷貝數(shù)和活性變化也可以影響核基因的甲基化模式和甲基化水平，從而調(diào)控核基因的表達(dá)，參與分化和發(fā)育[20]。

4 mtDNA甲基化研究進(jìn)展

4.1飲食和環(huán)境與mtDNA甲基化

近期研究表明，飲食與藥物會(huì)對(duì)mtDNA甲基化產(chǎn)生一定程度的影響。研究人員以橄欖油、紫蘇油等不同食用油脂飼喂大黃魚，不同的油脂飼喂會(huì)對(duì)大型黃魚mtDNA的甲基化情況產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其線粒體功能[21]。研究人員給予4周齡雄性大鼠20%果糖溶液連續(xù)14周，然后檢測(cè)其肝臟mtDNA甲基化（5-mC和5-hmC）及RNA水平發(fā)現(xiàn)：果糖喂養(yǎng)大鼠的肝臟mtDNA整體低甲基化，且含量和轉(zhuǎn)錄水平均高于對(duì)照組[22]。Jia等[23]發(fā)現(xiàn)，低蛋白飲食和增加甜菜堿攝入均會(huì)對(duì)仔豬mtDNA甲基化產(chǎn)生影響。妊娠期母豬低蛋白飲食與標(biāo)準(zhǔn)蛋白飲食相比，其雄性后代糖皮質(zhì)激素受體與mtDNA啟動(dòng)子結(jié)合程度更高，且呈現(xiàn)較低的胞嘧啶甲基化和羥甲基化;但在雌性后代中觀察到相反的變化，即表現(xiàn)為性別依賴的線粒體表觀遺傳。而妊娠期間的母體甜菜堿補(bǔ)充則會(huì)通過(guò)仔豬骨骼肌線粒體D-loop區(qū)低甲基化增強(qiáng)mtDNA基因的表達(dá)。另外一項(xiàng)在接受口服核苷類藥物（NAs）治療的乙肝患者的研究中揭示，與未治療的患者及健康對(duì)照相比，用NAs治療患者中的mtDNMT1表達(dá)增強(qiáng)，胞嘧啶殘基的甲基化發(fā)生率更高[24]。

另外，環(huán)境中地下水砷污染由于其對(duì)人類健康的不利影響而成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。一項(xiàng)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)砷暴露與mtDNA甲基化差異相關(guān)，與健康人群相比，地下水砷污染患者線粒體D-loop區(qū)及線粒體復(fù)合物I-NADH脫氫酶第6亞基（ND6）呈現(xiàn)顯著的低甲基化，同時(shí)靶基因高表達(dá)[25]。研究人員對(duì)瑞典南部職業(yè)暴露于粉塵中的焊工與健康對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，焊工的mtDNA拷貝數(shù)更高，D-loop和mtDNA甲基化程度更低，且血壓更高。在鍍鉻工人的血液研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，鍍鉻工人血鉻濃度與線粒體編碼苯丙氨酸12SrRNA基因（MT-TF/RNR1）甲基化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[26-27]。此外，胎盤mtDNA甲基化與妊娠期間PM 2.5暴露成正相關(guān)，特別是在妊娠早期[23]。吸煙也會(huì)引起mtDNA甲基化的異常，研究證實(shí)懷孕期間的母親吸煙會(huì)導(dǎo)致胎盤中線粒體D-環(huán)區(qū)及L鏈DNA高甲基化，同時(shí)新生兒包皮線粒體中D-loop區(qū)及H鏈的DNA高甲基化，因此母親妊娠期吸煙可能通過(guò)mtDNA甲基化影響新生兒健康[28]。

線粒體是細(xì)胞氧化應(yīng)激的來(lái)源和靶點(diǎn)，mtDNA與活性氧（ROS）來(lái)源的接近，使mtDNA更容易受到飲食、藥物、或環(huán)境因素的影響[29]。

4.2神經(jīng)退行性疾病與mtDNA甲基化

mtDNA甲基化隨著人大腦的衰老而增加，其中M1215和M1313這兩個(gè)CpG位點(diǎn)在預(yù)測(cè)和實(shí)際年齡之間顯示出更強(qiáng)的相關(guān)性，有望成為法醫(yī)年齡預(yù)測(cè)和健康狀況測(cè)量的可用生物標(biāo)志物[30]。mtDNA的表觀遺傳修飾可能與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）、帕金森病（PD）、阿爾茨海默病（AD）和其他神經(jīng)退行性疾病中。ALS組織的核DNA發(fā)生表觀遺傳修飾，但mtDNA的表觀遺傳修飾仍然知之甚少。近期研究顯示ALS患者線粒體D-loop區(qū)甲基化水平與mtDNA拷貝數(shù)負(fù)相關(guān)[31]。ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓神經(jīng)元和骨骼肌肌原纖維中編碼16S rRNA的線粒體基因發(fā)生甲基化[32]。在AD患者腦組織的內(nèi)嗅皮質(zhì)中，mtDNA中D-loop區(qū)5-mC水平增加，并且在小鼠模型中也得到證實(shí)[33]。在PD患者黑質(zhì)中D-loop區(qū)5-mC水平顯著低于對(duì)照樣本。以上結(jié)果表明人腦中mtDNA的D-loop區(qū)表觀遺傳修飾與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[31-34]。

4.3 mtDNA甲基化與癌癥

mtDNA的復(fù)制受到嚴(yán)格監(jiān)管，不同類型細(xì)胞其mtDNA拷貝數(shù)也不同，以便分化的細(xì)胞能夠獲得足夠的mtDNA拷貝以滿足其特定的能量需求[35]。許多癌細(xì)胞類型維持較低的mtDNA拷貝數(shù)，由于其主要依靠有氧糖酵解產(chǎn)生能量，促進(jìn)細(xì)胞增殖而舍棄細(xì)胞分化能力[36]。mtDNA去甲基化可能會(huì)提供額外的模板來(lái)促進(jìn)mtDNA的復(fù)制，增加拷貝數(shù)[37]。為了確定mtDNA甲基化在腫瘤發(fā)生過(guò)程中對(duì)mtDNA復(fù)制的調(diào)節(jié)程度，研究人員使用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤的腫瘤模型表征了mtDNA甲基化的模式，在具有相同的核基因組背景，但具有mtDNA基因型以及拷貝數(shù)的不同組合的腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)：首先，在相同核基因組背景下，mtDNA較高水平的5-mC與143B腫瘤模型中mtDNA拷貝數(shù)的相對(duì)受限的擴(kuò)增相關(guān)。其次，相同的mtDNA基因型在不同核基因組的影響下表現(xiàn)不同，以調(diào)節(jié)mtDNA甲基化。第三，mtDNA甲基化水平在腫瘤進(jìn)展期間趨于減少，這可能有助于mtDNA拷貝的增加。并且，在143B模型細(xì)胞的腫瘤發(fā)生過(guò)程中，DNA甲基化水平的變化與線粒體復(fù)合物I-NADH脫氫酶第5亞基（ND5）和ND6的轉(zhuǎn)錄變化相關(guān)，這可能表明mtDNA甲基化會(huì)對(duì)原發(fā)性多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響[38]。結(jié)直腸癌中也有研究表明，在結(jié)直腸癌組織中線粒體D-環(huán)區(qū)的甲基化水平明顯低于相應(yīng)的非癌組織，線粒體D-環(huán)區(qū)域的去甲基化伴隨著mtDNA拷貝數(shù)的升高，并且結(jié)直腸癌組織中基因線粒體復(fù)合物I-NADH脫氫酶第2亞基（ND-2）的表達(dá)同時(shí)增加，推測(cè)線粒體D環(huán)區(qū)域的突變或表觀遺傳修飾可能影響mtDNA復(fù)制并改變mtDNA的表達(dá)模式。總之，在結(jié)直腸癌組織中，線粒體D-環(huán)區(qū)的去甲基化率，mtDNA拷貝數(shù)和ND-2表達(dá)顯著高于相應(yīng)的非癌組織中的去甲基化率，D-環(huán)區(qū)的去甲基化可能涉及mtDNA拷貝數(shù)和ND-2表達(dá)的調(diào)節(jié)[39-41]。另外一項(xiàng)研究也指出，在線粒體D環(huán)區(qū)啟動(dòng)子CpG島上特定位點(diǎn)的去甲基化可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌中mtDNA拷貝數(shù)的升高，并引發(fā)細(xì)胞增殖增加，細(xì)胞凋亡減少和相對(duì)細(xì)胞周期停滯[42]。這些發(fā)現(xiàn)為mtDNA甲基化及其在腫瘤發(fā)生中mtDNA拷貝數(shù)的表觀遺傳調(diào)控中的作用提供了新的見解。

結(jié)直腸癌腺瘤，作為從正常粘膜到結(jié)直腸癌的早期可檢測(cè)組織類型，是預(yù)防和干預(yù)的重要靶點(diǎn)[43]，因此近期一項(xiàng)腺瘤研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA中的甲基化水平在正常組織和腺瘤組織之間沒有顯著差異，而且線粒體基因組中確實(shí)存在特定位點(diǎn)的低水平甲基化，但它與腺瘤中的線粒體基因轉(zhuǎn)錄變化無(wú)關(guān)，此外，由于未觀察到mtDNA甲基化的大規(guī)模變化，因此結(jié)直腸癌腺瘤中mtDNA的甲基化狀態(tài)并不能作為早期結(jié)直腸癌合適生物標(biāo)志物[44]。

4.4 mtDNA甲基化與其他疾病

mtDNA甲基化可能與胎盤功能不全的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。與對(duì)照組相比，所有胎盤功能不全妊娠的胎兒臍帶血中mtDNA拷貝數(shù)均升高，且線粒體基因，mt-TF/RNR1和線粒體編碼細(xì)胞色素c氧化酶亞基1（mt-CO1）顯示出非常低的甲基化水平;在最嚴(yán)重的病例中，D-loop區(qū)甲基化進(jìn)一步降低，并與臍靜脈氧分壓（PO2）相關(guān)[45]。組織良好的線粒體功能和動(dòng)力學(xué)對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，大多數(shù)線粒體基因經(jīng)歷了從頭甲基化，這可能會(huì)在早期發(fā)育過(guò)程中對(duì)線粒體功能和動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響[46]。一項(xiàng)關(guān)于胎兒甲狀腺激素對(duì)胎盤mtDNA含量和線粒體DNA甲基化的作用的研究結(jié)果表明，臍帶血血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和血清游離四碘甲腺原氨酸（FT4）與胎盤mtDNA甲基化在線粒體基因MT-RNR1和D-loop區(qū)域成負(fù)相關(guān)，而與胎盤mtDNA含量成正相關(guān)[47]。研究人員在豬卵母細(xì)胞中證實(shí)從健康和多囊性卵母細(xì)胞（PCO）分離的卵母細(xì)胞的質(zhì)量，與一碳代謝、線粒體DNA甲基化和線粒體功能相關(guān)。線粒體分布在PCO卵母細(xì)胞中被破壞，同時(shí)線粒體膜電位降低，線粒體結(jié)構(gòu)變形。PCO卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)和mtDNA編碼基因的表達(dá)顯著降低。此外，編碼12S和16S rRNA及ND4的mtDNA序列以及D-環(huán)區(qū)域在PCO卵母細(xì)胞中顯著高甲基化。這些結(jié)果表明，一碳代謝的異常激活和mtDNA的高甲基化可能在很大程度上導(dǎo)致母豬線粒體功能障礙和多囊卵巢來(lái)源的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[48-49]。

最近，一項(xiàng)心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn)，血小板mtDNA存在甲基化，并且甲基化水平與心血管疾病相關(guān)，患有心血管疾病的患者血小板mtDNA甲基化水平顯著高于健康個(gè)體，并且此種差異與年齡，體重指數(shù)（BMI）和種族無(wú)關(guān)，心血管疾病中的差異線粒體甲基化為疾病的診斷和治療提供了新思路[50]。

2型糖尿病（T2DM）的特征在于線粒體功能紊亂和氧化應(yīng)激，由于臨床沒有有效的T2DM治愈方法，因此早期診斷前驅(qū)糖尿病和預(yù)防疾病便尤為重要。研究人員發(fā)現(xiàn)在糖尿病早期，線粒體甲基化水平異常與胰島素敏感性受損存在一定相關(guān)性[51]。同時(shí)對(duì)受試者BMI分析，發(fā)現(xiàn)受試者的BMI在從較低分級(jí)指示數(shù)Q1到Q2階段時(shí)，線粒體甲基化急劇增加，但從Q2到Q3僅是略有增加，而在Q3到Q4則無(wú)顯著差異。因此，線粒體表觀遺傳變化與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加和早期前驅(qū)糖尿病的指標(biāo)有關(guān)，可能作為具有臨床意義的前驅(qū)糖尿病或糖尿病早期階段的生物標(biāo)志物[49]。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，糖尿病中高葡萄糖環(huán)境會(huì)使mtDNA高甲基化，而mtDNA的高甲基化可能是導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)以及加速毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡的原因[52]。

5展望

mtDNA控制著線粒體的基本功能，其分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、拷貝量多、無(wú)組織特異性，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡，以及氨基酸，脂質(zhì)，固醇和核苷酸的代謝，在細(xì)胞能量代謝中起著重要作用[35]。DNA甲基化是參與基因調(diào)控的重要表觀遺傳機(jī)制，核基因組DNA甲基化的改變與許多復(fù)雜疾病有關(guān)。線粒體DNA甲基化也越來(lái)越多受到關(guān)注，mtDNA甲基化水平可能受到大量細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外因素的影響，多種疾病中mtDNA甲基化水平出現(xiàn)顯著異常，尤其是在線粒體功能相關(guān)疾病中[53]。雖然mtDNA甲基化的機(jī)制以及疾病與mtDNA甲基化的關(guān)系等相關(guān)研究還不夠深入，但mtDNA甲基化可以作為一種早期分子事件，一種有效的疾病預(yù)測(cè)及診斷的潛在生物標(biāo)志物，隨著研究的深入，必將對(duì)相關(guān)疾病的診斷和預(yù)防產(chǎn)生深遠(yuǎn)意義。

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