基因編輯技術在農業育種中的應用

王維佳 李萌鑫

摘要 介紹當下流行的基因編輯技術的發展現狀以及在農業領域的具體應用，對于種子性狀改良與市場價值進行文獻梳理，試圖說明基因編輯在農業育種上的發展趨勢，除了TALEN（transcription activatorlike effector nucleases）和ZFN（zinc finger nuclease）這兩類常用的基因編輯工具外，CRISPR-Cas9（CRISPR-associated protein 9）是目前最為流行的工具，目前已經通過 CRISPR/Cas9 改變多項農作物性狀，如花色調控、延長櫥架壽命、抗殺草劑、提升抗逆境能力、增加抗病性等。由于利用CRISPR/Cas9創造的作物通過孟德爾遺傳分離后，不含其他生物的外源基因，因此不受基因改造法規的限制，成為科學界研究與開發的最新利器。我國一向高度重視并取得一系列成果，但是對于最新基因編輯技術的文獻梳理相對較少，該研究主要貢獻是結合最新資料闡述基因編輯技術在農業育種領域的應用，為我國發展基因編輯技術提供文獻參考。

關鍵詞 基因編輯技術;CRISPR/Cas9;農業育種

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0018-08

Abstract We introduced the current development of gene editing technology and its specific application in the field of agriculture， combed the literature of seed character improvement and market value， and tried to explain the development trend of gene editing in agricultural breeding.In addition to the commonly used gene editing tools such as TALEN and ZFN， CRISPR/Cas9 is currently the most popular tool， and has now changed a number of crop traits through CRISPR/Cas9， such as flower color regulation， extend shelf life， antiherbicide， improve resistance to stress， increase disease resistance， etc.Since the crops created by CRISPR/Cas9 are isolated through Mendel inheritance and do not contain exogenous genes of other organisms， they are not restricted by genetic modification regulations and have become the latest sharp tool in scientific research and development.China has always attached great importance to and achieved a series of results， but the literature on the latest gene editing technology is relatively less combed. The main contribution of this paper is to combine the latest data to explain the application of gene editing technology in the field of agricultural breeding， and provide literature references for the development of gene editing technology in China.

Key words Gene editing technology;CRISPR/Cas9;Agricultural breeding

隨著全球人口數量增加，極端氣候所造成糧食作物生產面臨頻繁的生物與非生物不可抗力的干擾，對于農業育種技術的改良顯得尤為重要。基因編輯技術在近幾年來發展迅速，此技術可針對選定的基因目標區域序列進行編輯，經過編輯后的目標序列可產生缺失、插入或置換等形式的突變，這些變異形式都具有可遺傳性。目前基因編輯技術中CRISPR/Cas9系統已經應用于許多植物上，該研究將介紹此技術應用于農業育種的現狀，其中包含主要糧食作物水稻、小麥與玉米等。依照不同作物的性狀，基因編輯不僅能準確地對目標基因進行誘變，而且可有效地同時針對多個目標基因或運用于多倍體基因組使序列產生變異。將基因編輯技術應用于作物上可協助創造出更多耐逆境的品種，為解決全球糧食安全問題提供新思路。

1 新興基因編輯技術現狀

近年來新興基因編輯技術如CRISPR系統、TALENs、ZFN、ODM等（表1），通過誘發突變輔助育種，誘導生物不表現特定基因片段等方法達成目的。ZFN是1996年發現可以辨認基因特定位置并截切的酵素，其特點是定點核酸酶（site directed nuclease，SDN），具有辨識特定核酸序列及使雙股DNA斷裂的功能，利用這種技術概念為基礎[1]，后續研究發現ODM、TALENs及CRISPR等技術都可以使特定序列產生斷裂，繼而誘發細胞中DNA自我修復機制造成改變[2-3]。而不同于基因改造所造成的不確定性狀，基因編輯技術可使用“非人為轉入外源基因”方式改良傳統育種技術，降低新品種開發成本與提高效率，相比傳統誘變技術更快、更精準地掌握特定性狀，在培育新品種時可大大提高效率。

已知的3種最受歡迎的基因編輯技術CRISPR、TALENs、ZFN，應用最多的還是生物工程領域（圖1），但是，最近幾年在農作物與經濟類作物中的應用逐年增加并日趨成熟。自 CRISPR-Cas9 技術發展以來，基因編輯改良植物性狀是主要通過 CRISPR-Cas9 產生的雙鏈斷裂來誘導突變而實現的。

2 基因編輯技術在農作物領域的應用

基因編輯技術具體分為3種典型的工具：ZFN、TALEN和CRISPR，而其中CRISPR由于操作簡便、通用性強，引起學界廣泛關注并獲得巨大發展。2012年，美國加州大學伯克利分校正式提出利用CRISPR-Cas系統可實現基因編輯[2] 。

2.1 具體技術分析

2.1.1 CRISPR。

目前CRISPR應用作物除模式植物阿拉伯芥和煙草外，還包括大宗作物，如水稻、小麥，以上2種作物以開發新抗病或耐逆境品種為主要研究方向，如抗白粉病小麥、抗白葉枯病水稻等，其他作物還包括玉米、高粱、番茄、地錢、柑橘、大豆等，目前已有提高waxy corn支鏈淀粉（amylopectin）含量的基因編輯品種上市，除一般作物外，CRISPR還應用在真菌類上，如抗褐化的蘑菇，目前有許多廠商正積極開發相關作物，并已有相關產品通過認定準備上市。

安徽農業科學 2020年

2.1.2 TALENs。

TALENs應用的作物除了植物阿拉伯芥及煙草外，還包括水稻、番茄、小麥、大豆和馬鈴薯等，在水稻部分還開發出抗白葉枯病水稻，在番茄部分則是進行生長激素調控的研究，而馬鈴薯也有降低褐變速率及減少丙烯酰胺（acrylamide）產生的品種上市。

2.1.3 ZFN。

ZFN-1模式以植物煙草為主，另外也有使用抗除草劑ALS（acetolactate synthase）基因突變或帶有篩選目標的基因GUS（bet aglucuronidase gene）或GFP（green fluorescent protein）植株;ZFN-2應用于模式植物阿拉伯芥及帶有突變基因GUS植株。

目前基因編輯技術的應用系統包含同源性重組（homologous recombination，HR）、重組酶（recombinase）基因置入、寡核苷酸（oligonucleotide）標靶突變及核酸酶（nuclease）標靶突變等（表2）。近期研究趨向于開發應用核酸酶系統，主要包含ZFN、TALENs、MGN及CRISPR/Cas技術平臺。但就便利性、操作性及效率性來看，CRISPR/Cas系統成為近幾年脫穎而出的技術平臺，除了專利發明的數量增加外，其投入成本也相對較低，其中2013年建立的在線CRISPR數據庫更是提升了此平臺的使用性及普及性，在近期內也累積了相當多的與之相關的研究成果，同時也有部分產品被開發應用，如陶氏杜邦（Dow Du Pont）通過CRISPR/Cas技術平臺開發新型改良后的糯玉米（waxy corn）品種，產量問題得以解決，并已取得美國農業部動植物健康檢驗局（USDAs Animal and Plant Inspection Service）的批準，目前已進入田間試驗階段并有望在市場銷售。

2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術應用現狀

CRISPR/Cas9技術是目前應用最為廣泛的技術。CRISPR系統可分為3種類型，第一類型與第三類型的CRISPR系統需要復雜的Cas蛋白質復合體與crRNA結合，才能辨識并剪切目標片段;第二類型的CISPR系統，也就是CRISPR/Cas9，只需要Cas9蛋白質和crRNA與反式活化CRISPR來源RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）形成復合體，即可辨識并剪切目標片段[4-6]。2012年將crRNA與trac rRNA合為一條sgRNA（single guide RNA），減少CRISPR/Cas9系統建構的復雜度，經測試，仍具有辨識并剪切效果，使CRISPR/Cas9系統成為近幾年來最熱門的基因編輯工具[2-3];而我國2013年初，率先利用CRISPR技術實現了對真核細胞基因組的編輯[7]。

CRISPR/Cas9技術在動物研究領域得以蓬勃發展。植物細胞因具有細胞壁，Cas蛋白質與sgRNA，無法通過動物細胞用的顯微注射法（microinjection）或電穿孔法（electroporation）送入細胞，必須將Cas9與sgRNA構筑于DNA載體，再以農桿菌媒介編輯法（agrobacteriummediated transformation）或基因槍法（particle bombardment）送入植物基因組中，使Cas9與sgRNA編輯植物基因組中的目標序列。應用CRISPR/Cas9于植物的報導最早出現在2013年[8-9]。2013—2015年CRISPR/Cas9系統在植物領域初步使用，直至2015年之后才開始出現明確應用CRISPR/Cas9于作物育種的報導。CRISPR/Cas9系統初期研究中，多以阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、邊沁煙草（Nicotiana benthamiana）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）等植物為主。少部分的研究使用甜橙（Citrus sinensis L.“Valencia”）[10-11]、番茄（Solanum lycopersicum）[12]等園藝作物為CRISPR/Cas9系統的材料。初期的研究多采用農桿菌滲入法（agroinfiltration）或PEG媒介原生質體轉型法（PEG-mediated protoplasts transformation），使CRISPR/Cas9產生的基因組編輯發生于T0世代。Feng等[13]以CRISPR/Cas9使12個阿拉伯芥的基因發生突變，突變的基因可遺傳至T3世代。Hsu[14]以CRISPR/Cas9編輯水稻的11個特定基因，這些由CRISPR/Cas9誘發的T0世代突變基因，可遺傳至T1世代。以CRISPR/Cas9編輯后的基因遵守孟德爾遺傳定律，可遺傳至植物子代，因此CRISPR/Cas9適合應用于作物育種與探索植物基因的功能。

2.2.1 改變花色。

花青素（anthocyanin）為構成花卉色彩的色素之一。通過CRISPR/Cas9默化煙草（Nicotianatabacum）與夏堇（Torenia fournieri Linden）的黃烷酮3-羥化酶（flavanone3-hydroxylase，F3H）基因，能使煙草與夏堇的花呈現白色[15]，與Zuker等[16]以RNA干擾（RNA interference，RNAi）使康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）的F3H基因默化的結果相符。

2.2.2 提高抗逆境能力。

ARGOS基因為植物乙烯傳導途徑的負調節因子，為了降低編輯玉米對乙烯的敏感度，通過轉移玉米（Zeamays）的UBIQUITIN1啟動子驅動的ARGOS8基因，在玉米中過量表達ARGOS8基因，結果在干旱逆境下，對比對乙烯不敏感的玉米的谷粒產量，比非基因編輯的玉米高[17]。通過419種玉米自交系篩選出內生ARGOS8 mRNA產量高的玉米品系，但所有自交系的玉米內生ARGOS8 mRNA產量都低于編輯UBIQUITIN1∷ARGOS8的玉米。該團隊利用CRISPR/Cas9，將玉米內生ARGOS8的啟動子，以同源重組修復的方法，置換為玉米中可連續表現的GOS2啟動子，增加ARGOS8的mRNA表現量。結果顯示，在開花階段出現缺水逆境時，GOS2∷ARGOS8玉米的谷粒產量比野生型玉米的谷粒產量高[18]。

2.2.3 延長壽命與改善品質。

番茄的RIN（RIPENIN GINHIBITOR）基因會促使番茄果實后熟，誘導內源乙烯增生、增加茄紅素（lycopene）的生成量、降解葉綠素（chlorophyll），縮短番茄果實的保質期[19]。野生型番茄的果實在轉紅階段（breaker stage）后5 d呈現橘紅色，然而通過CRISPR/Cas9使RIN基因突變的番茄果實只呈現黃色。顯示利用CRISPR/Cas9可以使果實后熟相關基因默化，延長果實保質期[20]。美國賓州州立大學的物病理學家楊亦農利用CRISPR/Cas9敲除蘑菇（Agaricus bisporus）其中一個多酚氧化酶（poly phenol oxidase，PPO）基因的功能，使該種PPO活性降低30%，達到推遲蘑菇褐化速度的目的。杜邦先鋒國際種子公司（Du Pont Pioneer）利用CRISPR/Cas9將糯玉米（waxy corn）（Zeamays L.sinensis Kulesh）內生的Wx1基因敲除。Wx1基因可轉譯出胚乳淀粉粒結合性淀粉合成酵素（endosperms granulebound starchsynthase），使糯玉米產生較多的直鏈淀粉（longchain poly saccharide）。敲除Wx1基因的糯玉米只產生支鏈淀粉（branched poly saccharide amylopectin），排除直鏈淀粉膠化的情形。

2.2.4 抗除草劑。

硫酰尿素類除草劑（sulfonylurea herbicides）能抑制植物的乙酰乳酸合成酵素（aceto lactate synthase，ALS），導致屬于支鏈氨基酸的纈氨酸（valine）、白氨酸（leucine）、異白氨酸（isoleucine）無法合成。將阿拉伯芥與大豆（Glycine max）ALS基因上特定位點的脯氨酸（proline）改為絲氨酸（serine），可使植株對硫酰尿素類除草劑Chlorsulfuron具有抗性[1，21]。利用CRISPR/Cas9使玉米的ALS2基因產生DSB，將第165個脯氨酸改為絲氨酸的ALS2單股模板以同源重組修復的方式進入玉米基因組，對玉米噴灑100 mg/L Chlorsulfuron 21 d后，仍可正常生長[22-23]，同時Sun[22]以相同的方式編輯水稻的ALS基因，將水稻ALS基因第548個及627個氨基酸密碼子分別由色氨酸（tryptophan）及絲氨酸改為白氨酸與異白氨酸，利用CRISPR/Cas9使改變過的單股ALS基因置換水稻內生的ALS基因，可惜沒有成功。進一步將改變過的ALS基因與sgRNA及Cas9構筑于同一DNA載體上，通過基因槍編輯法與農桿菌編輯法將此構筑送入水稻愈傷組織，再于含除草劑雙草醚的培養基上篩選，成功獲得抗雙草醚的水稻植株[22-23]。

2.2.5 抗真菌性。

DMR6（downy mildew resistant6）基因解碼為2-oxoglutarateFe（Ⅱ）oxygenase。阿拉伯芥突變體dmr6中，抗病相關基因與水楊酸（salicylic acid）的含量均顯著提高，使露菌病菌、假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）、番椒疫病菌（Phytophthora capsici）較不易感染阿拉伯芥[23]。以CRISPR/Cas9使番茄的DMR6（SlDMR6）基因產生5個與7個核苷酸缺失，引起移碼突變，造成DMR6轉譯的蛋白質失去功能[24]。經病原菌接種試驗后顯示，由CRISPR/Cas9產生的dmr6番茄突變株對假單胞桿菌及番椒疫病菌具有抗性，突變株與野生型番茄的株高無顯著差異。

稻熱病（rice blast）由稻熱病菌（Magnaporthe oryzae）引起。稻熱病會使水稻產量減少，造成稻農受到嚴重的損失。OsERF922基因突變會使水稻抗稻熱病的相關基因表現量提高，使水稻不容易感染稻熱病。以RNAi技術默化水稻OsERF922基因，可以增加水稻對稻熱病的抗病性[25]。通過CRISPR/Cas9 默化水稻的OsERF922基因也能增強水稻對稻熱病的抗病性。將以CRISPR/Cas9獲得的抗稻熱病水稻自交，使突變的OsERF922基因與帶有Cas9/sgRNA的T-DNA（transfer DNA）分離，獲得只帶有OsERF922突變基因的T2世代抗稻熱病水稻。T2世代抗稻熱病水稻的株高、結實率及種子千粒重等農藝性狀與野生型的水稻間無顯著差異[11-13，25]。顯示經CRISPR/Cas9 只編輯植物的目標基因，并不影響植物的其他基因。

2.2.6 抗病性。

以農桿菌滲入法將番茄黃化卷葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）復制起始點（origin of replication）的sgRNA表現于編輯Cas9內切酶（Cas9 endonuclease）基因的邊沁煙草，再接種TYLCV。TYLCV的基因組DNA于植株內的累積量受到CRISPR/Cas9系統的干擾而有效地減少[26]。為觀察CRISPR/Cas9系統表現活性，將菜豆黃矮病毒（bean yellow dwarf virus，BeYDV）載體中的移動蛋白（movement protein）與外鞘蛋白（coat protein）基因，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因取代，并與有Cas9及BeYDVsgRNA的構筑共同編輯野生型邊沁煙草對比[27]。BeYDV病毒載體受到Cas9與sgRNA表現影響，病毒載體所表達的GFP訊號強度減弱，顯示CRISPR/Cas9技術可有效干擾植物病毒的基因。植物的真核轉譯作用起始因子4E（eukaryotic translation initiation factors，eIF4E）可與mRNA的5′端帽（5′-terminal cap）作用，參與mRNA轉譯[28]。eIF4E與馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的病毒蛋白基因組結合（viral protein genomelinked，VPg）蛋白，可協助Potyvirus完成病毒的生命周期。編輯Cas9與eIF4E亞型（eIF（iso）4E）的sgRNA至阿拉伯芥，使eIF（iso）4E突變。eIF（iso）4E阿拉伯芥編輯株經自交分離后，獲得純型合子且非基因編輯的eIF（iso）4E阿拉伯芥突變株T2世代。經接種蕪菁嵌紋病毒（Turnip mosaic virus）后，eIF（iso）4E突變株表現抗病性[29]。Chandrasekaran等[30]、Caj等[31]也以 CRISPR/Cas9 技術使黃瓜（Cucumis sativus L.）的eIF4E突變，再經由雜交而獲得純型合子且非基因編輯的T3世代eIF4E黃瓜突變株。病毒接種試驗顯示，eIF4E黃瓜突變株對黃瓜黃脈病毒（Cucumber vein yellowing virus）、矮南瓜黃化嵌紋病毒（Zucchini yellow mosaic virus）及木瓜輪點病毒-西瓜型（Papayar ingspot virus-watermelon strain）具有抗病性。

CRISPR/Cas9、ZFN與TALEN等技術的發展使編輯特定基因更為容易，已應用在農作物抗病、延長水果保質期、改變花卉色彩等農業性狀的改良[32-34]。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及基因編輯技術，默化特定基因，再通過孟德爾遺傳，使得到的植株中Cas9和sgRNA等編輯基因，在子代與編輯后的基因分離，可視為非基因編輯植物。通過CRISPR/Cas9技術，可以同時編輯多個目標基因，而不改變作物原本的優良性狀[35-37]。綜合以上幾種優勢，CRISPR/Cas9將廣泛應用于作物育種[4，38-39]。

3 農業基因編輯技術發展趨勢

基因技術應用的目的是提高農作物生存率與生產率，農業基因技術在近幾年獲得了突飛猛進的發展，近幾年極端氣候、疾病和害蟲的概率大大增加，與之相對的發展中國家面臨人口增長而糧食和農業用地逐漸減少的現實。通過基因技術改善農作物的基因性狀，促進品種迭代加速和適應環境能力的提升在目前農業經濟學領域被廣泛關注。

可以看出，基因編輯技術在植物作物中的應用逐漸增加，市場規模逐漸擴大。為了滿足需求的增加，基因編輯技術在作物中應用的比重也在上升[26，40]（表3）。

為了更加詳細了解基因編輯技術在農作物領域的應用，表4利用國際專利數據庫-Derwent Innovation（DI）整理與匯總2007年1—12月這10年的發明專利情況，涵蓋了35 491件發明（DWPI專利組），并以德溫特世界專利索引（Derwent World Patent Index（DWPI）Manual Code）技術分類號進行技術趨勢分析，探討目前國際基因技術整體的趨勢[41-42]。

在這些經濟物種上的與之相對應的基因技術平臺仍是以雜交（hybrid/cross breed）、人工授粉/精（artificial pollination/insemination）及遺傳選型交配（genetic assertive mating/inbreeding）等傳統育種方式的專利發明數據量最多，但育種技術在歷經10年的遺傳基因工程及分子生物技術的精進以及技術改良后，也逐漸發生變化，并且形成一定趨勢。從技術發展多元化角度看，除了前期傳統育種技術外，之后的基因定序技術、基因探勘技術使得近幾年育種技術的發明更多元化[43]，其中包括植物農桿菌基因編輯技術、分子篩選/標志技術、核酸干擾或是沉默基因等技術的發展，都是從遺傳性狀改變或基因調控方面去作育種改良。從數據中發現近期（2014年后）在產業上被專家們認定是基因編輯（genome editing）技術的ZFN、TALENs、CRISPR/Cas的發明數量有明顯增加的趨勢，尤其是CRISPR技術平臺在2016年的發明量達108件，也凸顯了此技術平臺在品種改良技術中的創造性（表5）。雖然巨核酸酶（mega nucleases，MGN）、寡核苷酸（oligo nucleotide）標靶突變及重組酶（recombinase）基因置入等技術平臺在農業基因技術應用領域上有所增長，但是和已經逐漸成熟的技術平臺相比還具有很大的上升空間。

就近期針對發明及運用基因編輯技術平臺的專利權人來看，美國陶氏杜邦（Dow DuPont）的發明量高達67件，多數集中在運用ZFNs及CRISPR/Cas9技術;其次為先正達（Syngenta），發明數量44件，多運用在CRISPR/Cas9技術平臺;而雷杰納隆（Regeneron）藥廠居第3位，有26件發明量。可以發現專注在此技術開發的專利權人大多為植物作物或是種子種苗的國際廠商。除此之外，中國農業科學院（CAAS China）也有22件的發明量，且以CRISPR/Cas9技術平臺的發明最多。

在技術CRISPR/Cas9研發方面，美國保持著優勢地位，我國科研機構在CRISPR/Cas9平臺建設方面也取得了一定成績（圖2）。中國農業科學院聯合國際水稻研究所完成了全球3 000份水稻DNA的重測序工作，為研究水稻靶向基因、指導水稻育種提供了重要技術支持[44]。

基因技術包括很多，按照產值可以分為DNA/RNA sequencing、Genotyping、 Marker-assisted、selection、Gene expression profiling、GMO/trait purity、DNA extraction/purification。由表2可見產值比例較高的集中在核酸的序列分析、遺傳基因的分型及基因分子標識的篩選等技術項目，且各產值分別達 18.770億、18.233億及16.899億美元（表5）。預計到2021年全球各基因技術的市場產值可達135.588億美元，此產業市場的復合增長率（CAGR %）高達7.8 %。

近年來國際市場在面對因為極端氣候逐漸增加的同時出現糧食安全危機的市場環境下，推動科技進步和技術更新，從市場規模的增長可以看出基因技術的重要程度。

從圖2可以看出，基因技術的應用趨向于植物作物，并且多用于油料作物、谷類作物和豆類作物。其中水稻（rice）是重點基因編輯對象，說明為了應對全球糧食危機，應重點發展糧食作物的基因編輯技術。

4 小結與展望

為了應對未來糧食需求與極端氣候，基因編輯技術應用于農業市場的主要目的是物種改良，使新品種產能提高、繁育率增加及儲藏時間延長等，功能性地改善農作物的具體性狀以提高產量。從近期專利發明的數量以及相關文獻的分析整理方面可以看出國際種子種苗企業對于基因編輯技術平臺的高度重視。CRISPR/Cas9、ZFN與TALEN等技術的發展使編輯特定基因更為容易，這些技術目前主要應用在農作物抗病、延長果園產品櫥架壽命、改變花卉色彩等農業性狀的改良方面。CRISPR/Cas9可以取代RNAi及轉基因技術，默化特定基因，再通過孟德爾遺傳，使得到的植株中Cas9和sgRNA等基因在子代與編輯后的基因分離，可視為非轉基因植物。通過CRISPR/Cas9技術，基本可以同時編輯多個目標基因，而不改變作物原本的優良性狀。綜合以上幾種優勢，CRISPR/Cas9將廣泛應用于作物育種。目前我國相關研究還比較薄弱，除了投入研究資源外，還應該積極地與其他具有基因編輯技術研發能力的小型生物實驗室或研究單位共同合作，加速運用技術平臺所開發的作物產品推廣進程，增加市場糧食供應量。當然，技術與產品從開發到推廣是個漫長的過程，在植物作物基因改變的情況下仍存在著諸多問題，但是科技發展刻不容緩，如何在環境風險與研發投入間取得效益的平衡也是將來需要克服的問題。

參考文獻

[1] HAUGHN G W，SMITH J，MAZUR B，et al.Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides[J].Molecular and general genetics，1988，211（2）：266-271.

[2] JINEK M，CHYLINSKI K，FONFARA I.A programmable dualRNAguided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.

[3] CONG L，ANN R F，COX D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.

[4] DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al.CRISPR RNA maturation by transencoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature，2011，471（7340）：602-607.

[5] SAPRANAUSKAS R，GASIUNAS G，FREMAUX C，et al.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleic acids research，2011，39（21）：9275-9282.

[6] SAPRANAUSKAS R，GASIUNAS G，FREMAUX C，et al.The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli[J].Nucleic Acids Res，2011，39：9275-9282.

[7] BROUNS S J J，JORE M M，LUNDGREN M，et al.Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J].Science，2008，321（5891）：960-964.

[8] JIANG W Z，ZHOU H B，BI H H，et al.Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNAmediated targeted gene modification in Arabidopsis，tobacco，sorghum and rice[J].Nucleic Acids Res，2013，41（20）：1-12.

[9] LI J F，NORVILLE J E，AACH J，et al.Multiplex and homologous recombinationmediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9[J].Nat Biotechnol，2013，31：688-691.

[10] BORTESI L，FISCHER R.The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond[J].Biotechnology advances，2015，33（1）：41-52.

[11] JIAO Y Q，WANG Y H，XUE D W，et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J].Nat Genet，2010，42：541-544.

[12] PAN C T，YE L，QIN L，et al.CRISPR/Cas9mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations[J].Rep，2016，6（1）：1-9.

[13] FENG Z Y，MAO Y F，XU N F，et al.Multigeneration analysis reveals the inheritance，specificity，and patterns of CRISPR/Casinduced gene modifications in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad，2014，111（12）：4632-4637.

[14] HSU P D，LANDER E S，ZHANG F.Development and applications of CRISPRCas9 for genome engineering[J].Cell，2014，157（6）：1262-1278.

[15] NISHIHARA M，HIGUCHI A，WATANABE A，et al.Application of the CRISPR/Cas9 system for modification of flower colors in Torenia fournieri[J].BMC Plant Biology，2018，18：1-9.

[16] ZUKER A，TZFIRA T，BENMEIR H，et al.Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3hydroxylase gene[J].Mol Breed，2002，9：33-41.

[17] RITCHIE M E，PHIPSON B，WU D，et al.Iimma powers differential expression analyses for RNAsequencing and microarray studies[J].Nucleic acids research，2015，43（7）：1-13.

[18] TELLIER J，SHI W，MINNICH M，et al.Blimp1 controls plasma cell function through the regulation of immunoglobulin secretion and the unfolded protein response[J].Nature immunology，2016，17：323-330.

[19] FUJISAWA M，NAKANO T，SHIMA Y，et al.A largescale identification of direct targets of the tomato MADS box transcription factor RIPENING INHIBITOR reveals the regulation of fruit ripening[J].Plant cell，2013，25：371-386.

[20] SVITASHEV S，YOUNG J K，SCHWARTZ C，et al.Targeted mutagenesis，precise gene editing，and sitespecific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA[J].Plant Physiol，2015，169（2）：931-945.

[21] HAUGHN G W，SMITH J，MAZUR B，et al.Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate synthase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides[J].Mol Gen Genet，1988，211（2）：266-271.

[22] SUN Y W，ZHANG X，WU C Y，et al.Engineering herbicideresistant rice plants through CRISPR/Cas9mediated homologous recombination of acetolactate synthase [J].Mol Plant，2016，9（4）：628-631.

[23] BARRANGOU R，FREMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315（5819）：1709-1712.

[24] CHO S W，KIM S，KIM J M，et al.Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNAguided endonuclease[J].Nature biotechnology，2013，31（3）：230-232.

[25] DICKINSON D J，WARD J D，REINER D J，et al.Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9triggered homologous recombination[J].Nature methods，2013，10（10）：1028-1034.

[26] GRATZ S J，UKKEN F P，RUBINSTEIN C D，et al.Highly specific and efficient CRISPR/CAS9catalyzed homologydirected repair in Drosophila[J].Genetics，2014，196（4）：961-971.

[27] HERMANS P W，VAN SOOLINGEN D，BIK E M，et al.Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hotspot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains[J].Infection and immunity，1991，59（8）：2695-2705.

[28] JACKSON R J，HELLEN C U T，PESTOVA T V.The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11：113-127.

[29] PYOTT D E，SHEEHAN E，MOLNAR A.Engineering of CRISPR/Cas9mediated potyvirus resistance in transgenefree Arabidopsis plants[J].Mol Plant Pathol，2016，17（8）：1276-1288.

[30] CHANDRASEKARAN J，BRUMIN M，WOLF D，et al.Development of broad virus resistance in nontransgenic cucumber using CRISPR/Cas9 technology[J].Mol Plant Pathol，2016，17（7）：1140-1153.

[31] GAJ T，GERSBACH C A，BARBAS C F III.ZFN，TALEN，and CRISPR Casbased methods for genome engineering[J].Trends in biotechnology，2013，31（7）：397-405.

[32] HILSCHER J，BRSTMAYR H，STOGER E.Targeted modification of plant genomes for precision crop breeding[J/OL].Biotechnology journal，207，12（1）[2019-03-21].https：//doi.org/10.1002/biot.201600173.

[33] JUDGMENT OF THE COURT（Grand Chamber）：In Case C528/16[Z].2018-07-25.

[34] LUSSER M，PARISI C，PLAN D，et al.New plant breeding techniques[R].JRC reference reports，2011.

[35] WALTZ E.Geneedited CRISPR mushroom escapes US regulation[J].Nature，2016，532（7599）：293.

[36] BARRANGOU R，FREMAUX C，DEVEAU H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science，2007，315：1709-1712.

[37] BOLOTIN A，QUINQUIS B，SOROKIN A，et al.Clustered regularly interspaced short palindrome repeats（CRISPRs）have spacers of extrachromosomal origin[J].Microbiology，2005，151：2551-2561.

[38] CHO S W，KIM S，KIM J M，et al.Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNAguided endonuclease[J].Nature biotechnol，2013，31（3）：230-232.

[39] DICKINSON D J，WARD J D，REINER D J，et al.Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9triggered homologous recombination[J].Methods，2013，10：1028-1034.

[40] GRATZ S J，UKKEN F P，RUBINSTEIN C D，et al.Highly specific and efficient CRISPR/Cas9catalyzed homologydirected repair in Drosophila[J].Genetics，2014，196：961-971.

[41] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product[J].J Bacteriol，1987，169（12）：5429-5433.

[42] JANSEN R，EMBDEN J，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Mol Microbiol，2002，43（6）：1565-1575.

[43] JIA H G，WANG N.Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA[J].PLoS One，2014，9（4）：1-6.

[44] 許麗，王玥，姚馳遠，等.基因編輯技術發展態勢分析與建議[J].中國生物工程雜志，2018，38（12）：113-122.