西藏山南紅皮馬鈴薯脫毒快繁技術研究

范繼紅 巴桑次仁 邊巴次仁

摘要 以采自西藏山南地區隆子縣加玉鄉卡布溝的紅皮馬鈴薯為試驗材料，利用植物組織培養技術進行莖尖剝離，獲得脫毒苗，并建立快繁再生體系。結果表明，紅皮馬鈴薯組織培養不同培養階段的適宜培養基分別為分化培養基：MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L;繼代培養基：MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L;生根培養基：MS + IBA 0.2 mg/L。

關鍵詞 紅皮馬鈴薯;脫毒;培養基;再生體系

中圖分類號 S532 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0050-04

Abstract Redskinned potatoes collected from Kabugou， Jiayu Township， Longzi County of southern Tibet， were used as experimental materials to obtain virusfree seedlings by stripping the stem tips with plant tissue culture technology， and a rapid reproduction and regeneration system was established. The results showed that the suitable differentiation medium subculture medium and rooting medium was MS+6BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L， MS+6BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L，and MS+IBA 0.2 mg/L， respectively.

Key words Redskinned potato;Virusfree; Medium;Regeneration system

西藏山南地處青藏高原岡底斯山——念青唐古拉山脈以南的雅魯藏布江中下游，屬于典型的藏南谷地，隆子縣位于山南地區中偏北、喜馬拉雅山東段北麓，境內屬高原溫帶半干旱季風氣候區，太陽輻射強烈，日照時間長，氣溫較低，晝夜溫差大，干濕分明[1]。

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為茄科茄屬一年生草本植物，原產于南美洲安第斯山區的秘魯和智利一帶。17世紀時馬鈴薯傳播到我國，和玉米、番薯等從美洲傳入的高產作物成為老百姓的主要食品，對維持我國人口的迅速增加起到了重要作用。紅皮馬鈴薯富含原花青素和大量微量元素，具有補血護心、防病抗病、延緩衰老、美容護膚等功效，營養價值非常突出，食療效果非常明顯。經檢測，100 g馬鈴薯含花青素3.15 mg，粗淀粉10.07 g，蛋白質2.11 g，脂肪0.10 g，及豐富的碘、硒、錳、鉀、鋅等微量元素和維生素類[2-3]。西藏地區馬鈴薯的品質較好，很粉很甜，自古就有以馬鈴薯為主食的傳統，其中煮食為主要方式，以土豆泥為皮，牛肉為餡的土豆包子是西藏特色美食之一[4-6]。

植物組織培養技術是目前植物生物工程中研究最為完善、應用最為廣泛的領域，這一技術已經在果樹、花卉、蔬菜等經濟作物的快速繁殖和脫病毒等方面得到了普遍應用，并進入了產業化生產階段[7]。馬鈴薯莖尖培養研究經常與獲得無病毒苗結合進行，目前無病毒馬鈴薯苗在美國、意大利等國已應用于生產，我國從1979年開展了一系列加快優良品種繁殖的植物組織培養研究，馬鈴薯莖尖、莖段、葉片、葉柄再生系統也已經建立[8-10]。

筆者選用的紅皮馬鈴薯產于西藏山南地區隆子縣加玉鄉卡布村，隆子卡布紅皮馬鈴薯個頭小但數量多，外皮為深紅色，果肉為白色，煮后食用口感好，香味獨特濃郁，薯塊扎實耐貯藏，皮薄，鈣和維生素C含量高，一直受到周邊地縣群眾的喜愛。筆者利用組織培養的方法培育脫毒組培苗，為優良馬鈴薯品種繁育及在西藏地區的應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。紅皮馬鈴薯采于西藏山南地區隆子縣加玉鄉卡布村。

1.1.2 外植體采集。

收集西藏山南地區隆子縣加玉鄉卡布溝的紅皮馬鈴薯，選擇大小適中、表面光滑、完好無傷的薯塊常溫保存，待芽萌發后取芽，經表面消毒后，剝離莖尖，進行培養。

1.1.3 培養基及激素種類。

6-BA：6-芐氨基嘌呤，NAA：萘乙酸，IBA：吲哚丁酸。

MS基本培養基：大量元素，微量元素，有機成分，2%蔗糖，1%瓊脂，pH 5～6。

1/2MS培養基：大量元素用量在MS培養基基礎上減半，其他同MS培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理。

接種前首先要進行外植體表面消毒，選取飽滿的芽體，從薯塊上掰下，首先用肥皂水沖洗3～5次，再用自來水沖洗15 min。然后用70%乙醇消毒，無菌水沖洗3次。將乙醇清洗后的外植體在超凈工作臺中再用1%升汞消毒處理，無菌水沖洗3～5次。然后馬上剝莖尖。

1.2.2 試驗用培養基。

紅皮馬鈴薯的組織培養采用MS培養基作為基本培養基，再根據不同時期的具體需要添加適宜的激素。不同培養時期試驗用培養基類型見表1和表2。

各種培養基配制時除添加表中所列基本培養基和激素成分外，還要添加蔗糖2%，瓊脂粉1%;pH調整為5.8，分裝后在121 ℃、1.1 kg/cm2的壓力下滅菌20 min。

1.2.3 培養過程及培養條件。

莖尖剝離：在剝取莖尖時，把芽體置于8～40倍解剖鏡下，將消毒的芽體置于無菌培養皿，一只手用鑷子將其按住，另一只手用解剖針將芽鱗和葉原基分層剝離，解剖針要常蘸入90%乙醇，并用火焰灼燒進行消毒。當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來后，用解剖刀片將分生組織切下來，然后將其接到培養基上（圖1）。接種過程中要借助解剖鏡觀察，必須嚴格進行無菌操作，以免培養材料被污染。

分化培養：將剝離的莖尖，接種到分化培養基中，接種后置于培養室培養，培養溫度控制在25 ℃左右，每天照光10 h，光強大于3 000 lx（圖2）。

繼代培養：分化的莖尖28 d繼代一次，連續繼代培養3次以上，即可以形成多叢分化苗。

生根培養：當繼代苗高度大于3 cm時，由莖基部剪斷接入生根培養基，7 d左右即可看到幼根，再經過14 d左右的培養，試管苗已具有發達健壯的根系，即可進行移栽。

煉苗移栽：在試管生根苗培養21 d，有3條以上的新根形成后，即可進行煉苗移栽。移栽時首先將培養瓶瓶蓋去掉，煉苗3 d左右，然后進行移栽。煉苗溫度為20～30 ℃。移栽時用鑷子將生根苗從培養瓶中取出，用自來水將其根部的培養基沖洗干凈，移入苗盤，澆足水，噴施多菌靈，轉入馴化室培養，馴化室溫度控制在20～25 ℃，光照3 000～5 000 lx，相對濕度90%以上。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒

首先用肥皂水沖洗3～5次，再用流水沖洗15 min。然后用75%乙醇和1%升汞以不同消毒時間組合處理，結果發現（表3），處理①和②污染率較高，外植體萌發率較低，處理③、④、⑤污染率均非常低，達到了徹底消毒的目的，但比較外植體萌發率看，處理③萌發率為80%。綜合來看，以75%乙醇消毒30 s和1%升汞消毒5 min的處理③為最佳消毒方案。

2.2 不同激素種類及濃度對外植體分化的影響

將剝離的莖尖接種到含有不同激素種類及濃度的初代培養基上，誘導分化。結果表明，接種在A2、A3 2個培養基上的外植體分化率均較高，但通過培養觀察發現，A2和A3處理雖然分化率高，生長快，但分化苗細弱，A6培養基雖然分化率略低于前者，但分化的新芽生長健壯（圖3、4）。在外植體分化階段雖然希望以最快的分化速度來進行增殖，但在生產中，不能只要求有高的分化率，同時還要保證分化苗生長健壯。所以綜合分析以MS + 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.02 mg/L 的A6培養基為最適分化培養基（表4）。

2.3 不同激素種類及濃度對繼代增殖的影響

選取健康、生長良好的分化苗進行繼代增殖，結果發現，使用6-BA和NAA組合的培養基增殖倍數高，但激素高的組合增殖苗生長較弱。接種在A4培養基上的苗增殖率最高，增值倍數為405，接種在A5培養基的苗增殖率次之，增殖倍數為355，而其他培養基上的增殖苗生長均明顯較弱。繼代培養階段不能只要求有高的分化率，同時還要保證分化苗生長健壯，綜合增殖倍數與增殖苗生長狀況分析，A8培養基既可以保證較高的增殖倍數，苗的生長又比較健壯，因此繼代增殖培養基以MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.05 mg/L較好（表5）。

2.4 不同激素種類及濃度對試管苗生根的影響

將健壯的增殖繼代苗接種到含有不同激素種類及濃度的生根培養基上培養，誘導分化苗生根。結果發現，添加NAA后，愈傷產生的數量較多，新根數量雖多，但不能形成健康良好的根系，移栽不易成活;而添加IBA的處理產生愈傷較少，但IBA濃度較大時根系粗大脆弱;綜合分析認為以MS為基本培養基，添加IBA 0.2 mg/L的B3培養基誘導生根的效果最好（表6、圖5～6）。

3 結論

自2015年我國馬鈴薯主糧化以來，馬鈴薯栽培面積不斷擴大，市場潛力巨大。在昌果紅皮馬鈴薯成功銷往全國的帶動下，山南地區開始大力推廣紅皮馬鈴薯種植，由于種植面積迅速增加，紅皮馬鈴薯種苗需求量也急劇增加，培育馬鈴薯脫毒苗已成為解決種苗問題的關鍵[6]。

該研究以采自西藏山南地區隆子縣加玉鄉卡布溝的紅皮馬鈴薯為試驗材料，利用莖尖脫毒技術，獲得莖尖脫毒苗，建立快繁再生系統，結果表明，適宜紅皮馬鈴薯脫毒苗不同培養階段的培養基分別為分化培養基：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.02 mg/L;繼代培養基：MS+6-BA 0.2 mg/L+ NAA 005 mg/L;生根培養基：MS+IBA 0.2 mg/L。而1976年中國科學院遺傳研究所成功培養2個馬鈴薯品種的莖尖脫毒苗，初代培養基采用MS附加0.8 mg/L GA3[9]，張玲[8]在馬鈴薯組織培養技術研究中，芽誘導培養基采用MS+6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.2 mg/L[8]，與該試驗有所不同，屬于不同品種的培養差異。不同培養階段的培養基，激素濃度都不是很高，但脫毒苗生長良好，如果用于生產則可以降低生產成本，提高收益。

參考文獻

[1] 宋善允，王鵬祥.西藏氣候[M].北京：氣象出版社，2013.

[2] 楊文璽.馬鈴薯生長發育與環境[M].武漢：武漢大學出版社，2015.

[3] 原霽虹，韓黎明，尹彩云.馬鈴薯生產技術[M].武漢：武漢大學出版社，2015.

[4] 許娟妮.西藏自治區馬鈴薯生產現狀及發展對策[J].現代農業科技，2017（10）：102.

[5] 許娟妮.西藏馬鈴薯地方資源收集與評價[J].現代農業科技，2014（8）：114，118.

[6] 趙林，牛繼平，魏治鐳.西藏自治區昌都市馬鈴薯產業發展現狀、問題及對策[J].中國種業，2017（9）：39-40.

[7] 安利佳，姜長陽.植物組織培養導論[M].大連：遼寧師范大學出版社，1996.

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[10] 白云，馬箭超，聶文丹，等.一種簡易快速獲得脫毒馬鈴薯幼苗的方法[J].河北師范大學學報（自然科學版），2017，41（2）：169-171.