吉林地區(qū)規(guī)模化豬場大腸桿菌和沙門氏菌性仔豬腹瀉流行情況調(diào)查曲歌沙萬里

高雪

摘要 [目的]研究吉林地區(qū)規(guī)模化豬場大腸桿菌和沙門氏菌性仔豬腹瀉的流行情況，分析引起該地區(qū)仔豬腹瀉的主要致病菌。[方法]試驗(yàn)采集了21家規(guī)模化豬場中117份仔豬腹瀉糞便樣本，進(jìn)行基因提取、PCR擴(kuò)增、電泳鑒定和致病性試驗(yàn)。[結(jié)果]從117份仔豬腹瀉樣本中分離出大腸桿菌104份，其中49份具有致病性，占樣本總數(shù)的42.88%;分離出沙門氏菌19份，其中15份具有致病性，占樣本總數(shù)的12.82%。[結(jié)論]大腸桿菌和沙門氏菌是引起吉林地區(qū)規(guī)模化豬場仔豬腹瀉的主要致病菌，且有混合感染情況。

關(guān)鍵詞 吉林;規(guī)模化豬場;大腸桿菌;沙門氏菌;仔豬腹瀉

中圖分類號(hào) S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0089-02

Abstract [Objective] To study the epidemic situation of piglet diarrhea caused by E. coli and Salmonella sp. in largescale pig farms in Jilin area， and analyze the main pathogens of diarrhea in piglets in this area. [Method] 117 piglet diarrhea stool samples were collected from 21 largescale pig farms to make gene extraction， PCR amplification，electrophoresis identification and pathogenicity test. [Result] 104 of 117 piglet diarrhea samples were isolated， 49 of which were pathogenic， accounting for 42.88% of the total samples;19 of which were Salmonella sp.， 15 of which were pathogenic， accounting for 12.82% of the total samples. [Conclusion] E. coli and Salmonella sp. are the main pathogens of piglet diarrhea in largescale pig farms in Jilin area， and there are mixed infections.

Key words Jilin;Largescale pig farm;Escherichia coli;Salmonella sp.;Piglet diarrhea

仔豬腹瀉已嚴(yán)重影響?zhàn)B豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)相繼出現(xiàn)仔豬嚴(yán)重腹瀉病情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起仔豬腹瀉的病因非常復(fù)雜，且病原也很多。另外，在其治療過程中，由于缺少準(zhǔn)確的病原診斷以及對(duì)抗生素的濫用等原因，導(dǎo)致病原菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，使仔豬腹瀉的預(yù)防和治療越來越困難[2]。仔豬腹瀉的主要病因之一是細(xì)菌的入侵，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌性仔豬腹瀉的主要病原菌有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、魏氏梭菌、耶爾森菌等[3]。東北地區(qū)不同季節(jié)溫差變化大，導(dǎo)致吉林地區(qū)仔豬腹瀉發(fā)病率較高，而且病原菌對(duì)多種抗生素都產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性。豬場仔豬腹瀉得不到迅速有效的控制，主要是因?yàn)樯a(chǎn)實(shí)踐中對(duì)病原菌很難進(jìn)行準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷，從而在臨床治療過程中很難“對(duì)癥用藥”。由于各地區(qū)的氣候環(huán)境、飼養(yǎng)條件、仔豬健康狀況等不同，導(dǎo)致各地區(qū)細(xì)菌性仔豬腹瀉的主要病原菌感染情況也不盡相同[4-5]。

筆者采用分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)2017年1月至2017年12月吉林部分地區(qū)規(guī)模化豬場送檢的仔豬腹瀉樣本進(jìn)行了檢測(cè)與鑒定，旨在明確大腸桿菌和沙門氏菌引起吉林地區(qū)規(guī)模化豬場仔豬腹瀉的發(fā)病情況，為該地區(qū)仔豬腹瀉病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017年1—12月，無菌采集吉林地區(qū)21家規(guī)模化豬場腹瀉性疾病病死豬的腸道內(nèi)容物樣本117份。

1.2 主要試劑及儀器

糞便DNA提取試劑盒購于上海一基實(shí)業(yè)有限公司;瓊脂糖、50×TAE、DNA Marker購于上海銘博生物科技有限公司。

PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國，ABI公司）、電泳儀（美國，伯樂公司）、生物安全柜（美國，THERMO公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠750只，體重20～30 g，性別隨機(jī)，購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 樣本采集

在無菌手術(shù)室內(nèi)對(duì)病死仔豬的腹部進(jìn)行消毒，切開腹部，采集病變腸道內(nèi)容物置于無菌的2 mL 離心管內(nèi)，進(jìn)行標(biāo)記后，放于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因提取與PCR鑒定

1.5.1

腹瀉樣本中細(xì)菌DNA提取。參照糞便DNA提取試劑盒說明書中操作步驟提取糞便樣本中細(xì)菌DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2

引物設(shè)計(jì)與合成。引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)并合成，如表1所示。

1.5.4 瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V。

1.6 致病性試驗(yàn)

1.6.1 大腸桿菌致病性試驗(yàn)。

①根據(jù)PCR鑒定結(jié)果，將鑒定和分離出的104份大腸桿菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，將接種后的LB液體培養(yǎng)基置于37 ℃搖床中培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心2 min后丟棄上清液，并加入生理鹽水進(jìn)行混勻。此步驟重復(fù)3次，菌液的溶劑轉(zhuǎn)換為生理鹽水，測(cè)定菌液OD值，使其濃度達(dá)到1.5×1010 CFU/mL[6-7]。

②將624只小鼠隨機(jī)分成104個(gè)大組，每個(gè)大組再分成2個(gè)小組，每小組3只，分別設(shè)為試驗(yàn)組和對(duì)照組。

③對(duì)試驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.2 mL的菌液，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.2 mL的生理鹽水。

④觀察并記錄24～72 h內(nèi)各組小鼠的發(fā)病和死亡情況。

1.6.2 沙門氏菌致病性試驗(yàn)。

①將PCR鑒定和分離出的19份沙門氏菌菌株接種到SF增菌液中增殖培養(yǎng)，分別進(jìn)行V-P、硫化氫、糖發(fā)酵試驗(yàn)。

②選取114小鼠隨機(jī)分成19個(gè)大組，每個(gè)大組再分成2個(gè)小組，每小組3只，分別設(shè)為試驗(yàn)組和對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

提取的細(xì)菌基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行

電泳鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。從117份腹瀉糞便樣本中分離鑒定出大腸桿菌104份、沙門氏菌19份。

2.2 致病性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，104份大腸桿菌中有49份接種小鼠后72 h內(nèi)導(dǎo)致死亡，挑取肝臟，將病原菌接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，有黑色金屬光澤的圓滑菌落出現(xiàn);19份沙門氏菌中有15份接種小鼠后72 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，小鼠腸道內(nèi)積聚大量淡黃色液體，腸系膜水腫，接種SS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，長出無色、中心帶有黑褐色、不透明的菌落。結(jié)果表明，104份大腸桿菌中具有致病性的有49份，19份沙門氏菌中具有致病性的有15份;117份樣本中具有致病性的大腸桿菌占41.88%，具有致病性的沙門氏菌占12.82%。

3 討論

仔豬腹瀉是生豬養(yǎng)殖中的常發(fā)病，多發(fā)生于1月齡以內(nèi)的仔豬，發(fā)病數(shù)量占總發(fā)病豬數(shù)量的35%～45%，嚴(yán)重危害豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[8]。原先腸道內(nèi)無菌群定殖的新生仔豬，隨著 覓食、呼吸等生理過程的進(jìn)行，進(jìn)入體內(nèi)的細(xì)菌逐漸在腸道內(nèi)定殖，并且為保持仔豬腸道內(nèi)菌群平衡、防止有害菌侵入，與腸黏膜的保護(hù)屏障形成動(dòng)態(tài)平衡。由于飼養(yǎng)環(huán)境的突然改變，仔豬斷奶產(chǎn)生的應(yīng)激、氣溫的劇變等因素的影響，導(dǎo)致抵抗力下降，打破了腸道內(nèi)細(xì)菌與腸黏膜保護(hù)屏障的動(dòng)態(tài)平衡，外來病原菌入侵后引發(fā)仔豬腹瀉[9]。

引起仔豬腹瀉發(fā)生的誘因很多，如飼喂發(fā)霉變質(zhì)飼料、豬舍通風(fēng)換氣不暢、環(huán)境衛(wèi)生差、免疫力下降等，均會(huì)誘發(fā)仔豬腹瀉[10]。吉林是國家生豬養(yǎng)殖的主要區(qū)域之一，因?yàn)闁|北區(qū)域四季氣候的變化幅度較大，季節(jié)溫差變化明顯，導(dǎo)致仔豬腹瀉性疾病發(fā)生率高，對(duì)生豬養(yǎng)殖危害嚴(yán)重。引發(fā)吉林地區(qū)仔豬腹瀉的主要病原菌對(duì)防治該病敏感藥物篩選以及防控措施的制定至關(guān)重要。該研究結(jié)果表明，致病菌大腸桿菌和致病性沙門氏菌是引起吉林地區(qū)規(guī)模化豬場仔豬腹瀉的主要病原菌，分別占仔豬腹瀉發(fā)病率的41.88%和1282%。

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