溶解氧變化對中華烏塘鱧酶活的影響及其低氧耐受力研究

馬粒雅 王聞 遲雯丹

摘要 將中華烏塘鱧置于密閉的玻璃容器中，在溶解氧濃度分別為3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（將魚憋2 h后）時分別進行取樣，測定肝臟、腸和鰓中的酶活。結果表明，中華烏塘鱧肝臟組織中的抗氧化酶活性最高，腸組織中免疫酶活性最高，而外周組織（鰓）的酶活性遠低于其他組織;當溶解氧濃度降至約0.31 mg/L時，抗氧化酶和免疫酶活性均明顯下降，這可能是中華烏塘鱧進入了一種類似休眠的狀態，整個新陳代謝降低僅能維持基本的生命狀態;當水中溶解氧幾乎消耗完全時，中華烏塘鱧為維持其基本生命特征而進行自身調節，抗氧化酶和免疫酶的活性又出現明顯升高。

關鍵詞 中華烏塘鱧;溶解氧;堿性磷酸酶;超氧化歧化酶;過氧化氫酶

中圖分類號 S917.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0091-04

Abstract Chinese black sleepers were cultured in closed glass vessels，and samples were collected when the concentration of dissolved oxygen was 3.5， 1.0， 0.5， 0.3， 0.05， 0 and 0 mg/L（dissolved oxygen disappeared for 2 hours）.The enzyme activities in the liver， intestine and gill were determined. The results showed that the activity of antioxidant enzymes was the highest in the liver and the activity of immune enzymes were most active in intestinal tissues， while both of them were much lower in the gill than that in the liver and intestinal tissues. When the dissolved oxygen concentration dropped to 0.31 mg/L，the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes decreased significantly， this might be caused by the fact that Chinese black sleepers entered a state similar to dormancy， so that the entire metabolism was reduced only to maintain the basic state of life. However， when dissolved oxygen in water was almost consumed completely， the activities of antioxidant enzymes and immune enzymes increased again， which might be derived from the selfregulation of Chinese black sleepers to maintain its basic life characteristics.

Key words Chinese black sleeper;Dissolved oxygen;Alkaline phosphatase（AKP）;Superoxide dismutase（SOD）;Catalase（CAT）

中華烏塘鱧隸屬塘鱧科烏塘鱧屬，廣泛分布于我國黃海南部，東海，南海以及日本海域[1]。中華烏塘鱧是一種低氧耐受性很強的魚類，通過對其在不同溶解氧濃度下堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性的研究來揭示其耐低氧能力[2]。它的存活率很高，能很快將傷口愈合并維持健康的生命體征。另外，中華烏塘鱧的最大特點是對低氧和干露的耐受性很強，即使只在離水的陰濕環境中也能生存7 d左右[3]，是一種能夠適應當前海洋生態環境變化的優良品種。目前對中華烏塘鱧的研究主要集中在繁殖、養殖方面，而對該種魚在低溶解氧條件下的存活機理迄今尚未見報道。

當魚類受到外界環境因素的影響時，激發非特異性免疫系統是機體用來抵抗外界環境的主要方式。磷酸酶是一類非特異性免疫酶，其活力是衡量免疫功能和機體狀態的指標，反映了機體對外界環境的防御能力[4]。堿性磷酸酶（AKP）是其中重要的一種機體功能調節酶，通過促進營養的轉運和吸收來加強機體的非特異性免疫能力[5]。當魚類受到環境脅迫時，堿性磷酸酶活性被激發以抵抗外界條件對自身的影響。目前已有研究表明環境條件（如水溫[6-7]、鹽度[8-9]、溶解氧[10-11]、重金屬[12-13]、有機污染物[14-15]等）的變化能引起魚體內堿性磷酸酶活性的變化，產生應激反應。

魚類在水體中不同環境下的生命體征也可以用抗氧化酶活力來反映，從而判定魚類是否受到外界環境的脅迫。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內一種重要的抗氧化酶，主要通過催化歧化作用將過氧化物自由基轉化為過氧化氫（H2O2）和氧（O2），將生物體內有害的活性氧清除[16]。過氧化氫酶（CAT）通過催化分解作用將過氧化氫歧化分解為水（H2O）和氧氣（O2），防止細胞受到過氧化氫的毒害作用，為機體提供抗氧化防御能力[7]。目前國內外關于魚體內抗氧化酶活性受溫度[17-20]、鹽度[18-20]、溶解氧[21-22]等環境條件脅迫而發生變化的研究很多，但關于中華烏塘鱧的研究卻尚未報道。

筆者通過對低氧狀態下中華烏塘鱧不同組織內免疫酶和抗氧化酶活性的測定，探究低氧脅迫下中華烏塘鱧不同組織酶活性的差異及低氧條件對酶活性的影響，旨在初步探究中華烏塘鱧的耐低氧機制，為中華烏塘鱧的人工養殖和運輸提供一定的理論基礎，同時為實現其他生物在低氧條件下的存活提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗魚來源和試驗用水

試驗用魚為廣西海域直接捕撈的樣品魚，選取生命體征良好、平均體重（74.45±13.95）g、平均體長（17.55±1.25）cm的健康中華烏塘鱧進行試驗。

試驗用水為經沉淀和砂濾的天然海水，鹽度為25%～27%，pH為8.1～8.2[8]。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計。

試驗采用密封玻璃容器作為呼吸室進行中華烏塘鱧的耗氧試驗，基于非侵入式光學氧傳感器進行溶解氧測定，將溶氧膜固定于玻璃容器內壁中間位置，注滿海水放入試驗魚進行測定，以保持室溫25 ℃和密閉條件。

試驗設置8個組，Ⅰ組為對照組，只加滿海水不放入試驗魚;Ⅱ～Ⅷ組加滿海水分別放入10條魚，Ⅱ～Ⅷ組溶解氧濃度在魚的呼吸作用下隨時間而明顯下降，使用溶解氧測定儀（非侵入式光學氧傳感器，規格為PreSens Microx 4）每隔1 min對試驗容器內海水的溶解氧進行測定（海水的初始溶解氧濃度為6.0 mg/L），當溶解氧濃度降至約3.5、1.0、0.5、0.3、0.05、0、0 mg/L（溶解氧濃度降至0 mg/L后2 h）時分別進行取樣，在冰上進行無菌解剖，取肝臟、腸、鰓3種組織裝入冷存管中并按順序編號用液氮冷凍保藏，分別對3種組織的堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）進行酶活測定。

1.2.2 酶活性測定方法。

將冷凍的組織準確稱重，按質量體積比1∶9（g∶mL）加入定量生理鹽水在冰浴條件下配制成10%的組織勻漿，并保持4 ℃溫度，以2 500 r/min的轉速離心10 min，取上清液以供測定酶活性。酶活均使用南京建成生物有限公司試劑盒進行測定，按照說明書進行操作。

堿性磷酸酶（AKP）的活力單位定義為1 g組織蛋白在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位，然后再將金氏單位換算成國標。

超氧化物歧化酶（SOD）的活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為1個酶活力單位[11]。

過氧化酶（CAT）的活力單位定義為1 mg組織蛋白1 s分解1 mol的過氧化氫（H2O2）的量為1個酶活力單位[12]。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2013和SPSS 16.0統計軟件進行數據處理和分析，結果均以平均值±標準誤（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 中華烏塘鱧耗氧率測定

將中華烏塘鱧置于密閉的容器中，對其耗氧率進行測定。從圖1可以看出，在2 h內，中華烏塘鱧的耗氧率從最初的0.2 mg/（h·g）降低至002 mg/（h·g）。隨著溶解氧濃度的進一步降低，中華烏塘鱧表現出明顯的活力降低，僅有鰓和鰭微動，其耗氧率也緩慢下降，接近于零。持續4 h后，耗氧率降至零（容器內海水溶解氧濃度為0 mg/L），中華烏塘鱧仍能在這種狀態下存活4 h左右。

2.2 低氧脅迫下不同組織AKP活性的變化

對中華烏塘鱧不同組織中的AKP活性進行測定，觀察發現在低氧狀態下肝臟組織中AKP活性為10～20 U/mg，腸組織中AKP活力為400～1 200 U/mg，鰓中AKP活性為9～12 U/mg。從圖2可以看出，腸組織中AKP活性遠高于肝臟和鰓，而肝臟中AKP活性略高于鰓。這表明腸組織是中華烏塘鱧體內AKP酶的主要分布區，在溶解氧較低的狀態下腸組織受到影響，會分泌更多的AKP以適應環境的變化。

因為中華烏塘鱧體內不同組織所含AKP活性的差異較大，分別對肝臟、腸和鰓中溶解氧濃度對AKP活性的影響進行分析。從圖2可以看出，隨著溶解氧濃度的逐漸降低，肝臟和腸中AKP活性基本不發生變化。當溶解氧濃度進一步降低時，AKP活性開始上升;溶解氧濃度達到0.31 mg/L時，AKP活性出現峰值隨后開始下降（P>005）;當溶解氧濃度達到0.05 mg/L時，AKP活性再次升高（P>0.05）。鰓中AKP活性也隨著溶解氧濃度的降低呈現先上升后下降的趨勢，但變化范圍并不大，且各試驗組間無顯著差異（P>005）。

2.3 低氧脅迫下不同組織抗氧化酶活性的變化

對中華烏塘鱧不同組織中SOD和CAT活性分別進行測定，發現低氧狀態下肝臟組織中SOD活性為550～750 U/mg，腸組織中SOD活性為170～200 U/mg，鰓中SOD活性為50～75 U/mg（圖3）。從圖3可以看出，SOD活性在肝臟、腸和鰓中從高到低依次為肝臟、腸、鰓，且肝臟中SOD活性遠高于其他組織。CAT活性在中華烏塘鱧體內各組織中的分布比例與SOD活性相似，其活性分別為肝臟35～55 U/mg，腸組織2～5 U/mg以及鰓組織0.4～0.8 U/mg（圖4）。這表明抗氧化酶分布在中華烏塘鱧體內的不同組織中，但肝臟所占的比重較大，且SOD活性相較于CAT活性高得多。

圖3呈現出肝臟、腸和鰓組織中SOD活性隨著溶解氧濃度下降的變化趨勢。肝臟和腸組織中SOD活性的變化趨勢與AKP活性相似，SOD活性先不隨溶解氧濃度而變化，當溶解氧濃度達到1.04 mg/L時SOD活性開始上升，達到峰值時開始呈下降趨勢，最終當溶解氧濃度幾乎為0 mg/L時，SOD活性又逐漸增大（P>0.05）。鰓中的SOD活性隨溶解氧濃度的下降呈上升下降交替變化的趨勢，當溶解氧濃度下降為005 mg/L時，SOD活性不再下降而呈現明顯的上升趨勢（P>0.05）。

圖4分別顯示出肝臟、腸和鰓組織中CAT活性隨著溶解氧濃度下降的變化趨勢。肝臟和腸中CAT活性隨著溶解氧濃度的降低而呈現出先升高后下降的趨勢，且各試驗組間無顯著差異（P>0.05），當溶解氧完全耗盡時，試驗魚體內CAT活性開始上升（P>0.05）。鰓中CAT的活性始終保持在0.5 U/mg左右，幾乎不隨溶解氧濃度的變化而發生變化（P>0.05）。

3 討論

3.1 低氧脅迫對不同組織AKP活性的影響

魚類在整個生存過程中主要依靠非特異性免疫系統抵抗外界條件的影響。AKP作為生物體內第四道防線中非常重要的非特異性免疫酶之一，其活力是魚類自身免疫系統的重要指標[23]。該研究發現在中華烏塘鱧肝臟、腸和鰓組織中腸組織的AKP活性較高，且受氧濃度的影響較大，而肝臟的AKP活性略高于鰓。依據相關文獻報道，腸組織與營養物質消化、吸收和轉運有著密切關系[24-25]，這與AKP的作用相適配，因此在中華烏塘鱧腸內AKP活性較高。肝臟是生物體內主要的解毒器官，通過AKP的作用將有毒物質分解，以維持穩定狀態[26-28]，因此肝臟中也存在一定量的AKP。鰓主要具有呼吸、濾食和排泄等功能，并不是魚類的免疫器官，因此AKP的活性較小。

當溶解氧濃度大于0.45 mg/L時，中華烏塘鱧的生命體征良好，體內的免疫性酶不受溶解氧變化的影響而保持穩定狀態。隨著溶解氧濃度的進一步下降，中華烏塘鱧做出應激反應，通過提高AKP的活性來加強自身的非特異性免疫能力。當溶解氧濃度達到0.31 mg/L時，中華烏塘鱧為了維持基本生命體征而降低自身新陳代謝水平，使機體進入近似休眠狀態，AKP活性也隨之下降。當溶解氧濃度下降至0.05 mg/L時，試驗魚呼吸受阻，生命體征出現異常，抗氧化酶通過將體內的自由基轉換，以得到更多的氧氣維持呼吸，而轉化過程中產生的有毒有害物質可以被AKP降解，因此AKP的活性升高。

3.2 低氧脅迫對不同組織抗氧化酶活性的影響

與其他有氧生物一樣，魚體內具有完善的抗氧化防御系統，以抵抗正常新陳代謝活動時產生的對身體有害的活性氧物質[29]。SOD和CAT是抗氧化酶系統的重要組成部分，對于維持體內自由基平衡有重要的作用[30]。肝臟是生物體內新陳代謝和氧氣消耗的主要組織，肝臟中SOD通過歧化作用將過氧化物自由基轉化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）以在低氧狀態下維持生命，而CAT可將轉化產物過氧化氫（H2O2）分解為水（H2O）和氧氣（O2），在得到生命所需氧氣的同時將過氧化氫分解，以提高自身抗氧化能力?？寡趸阜植荚谥腥A烏塘鱧體內的不同組織中，但肝臟所占的比重較大，且SOD的活性相較于CAT活性高得多。

當溶解氧濃度大于0.45 mg/L時，中華烏塘鱧體內抗氧化防御系統相關的SOD和CAT通過自身的活性調節來維持體內自由基的平衡，并未隨著溶解氧的降低有明顯變化。當溶解氧濃度進一步下降時，中華烏塘鱧開始出現應激反應通過提高抗氧化酶活性來加強機體抗氧化能力，維持生命體征的正常。當溶解氧濃度降低至0.31 mg/L時，抗氧化酶活性降低，中華烏塘鱧表現出明顯的活力減少，僅有鰓和鰭微動，整體新陳代謝水平下降。當溶解氧濃度基本耗盡時，試驗魚無法吸收水中的氧進行呼吸，只能通過調節抗氧化酶活性來促進氧化自由基的分解生成氧氣，以供自身呼吸。

該研究通過對中華烏塘鱧在低氧條件下耗氧率及不同組織中免疫酶和抗氧化酶活性變化進行分析，觀察發現中華烏塘鱧在溶解氧濃度開始下降的過程中耗氧率快速下降，免疫酶和抗氧化酶的活性有明顯的上升趨勢;然而，當溶解氧濃度降至0.31 mg/L時，中華烏塘鱧活力明顯降低。為了維持其生命特征，整個機體的新陳代謝水平開始下降，導致免疫酶和抗氧化酶下降。隨著氧氣的進一步消耗，中華烏塘鱧的耗氧率降為0 mg/（h·g），免疫活性酶和抗氧化活性酶的活性明顯升高，使其仍能在這種狀態下維持4 h左右。初步認為中華烏塘鱧的耐氧機制大約在溶解氧濃度為0.31 mg/L時開始啟動，通過降低自身的新陳代謝水平維持生命特征，使機體處于近似于休眠狀態。當水中溶解氧幾乎為零時，為了維持機體基本的生命特征，體內的酶又重新被激活，肝臟中抗氧化酶通過分解體內氧化自由基來維持生命，同時免疫酶將產生的有毒有害物質轉運，并在腸組織中通過免疫酶的作用將其降解吸收。

參考文獻

[1] 鐘愛華，李明云.中華烏塘鱧的生物學特性及人工育苗研究進展[J].浙江海洋學院學報（自然科學版），2002，21（3）：269-272.

[2] 張華軍，李卓佳，張家松，等.凡納濱對蝦免疫指標變化與其養殖環境理化因子的關系[J].大連海洋大學學報，2011，26（4）：356-361.

[3] 鄭守專.中華烏塘鱧池塘養殖技術[J].現代農業科技，2012（18）：271-272.

[4] 謝麗玲，謝俊，趙斌，等.重金屬污染下龜殼攀鱸組織中ACP和AKP的活力比較[J].生態毒理學報，2016，11（3）：323-330.

[5] 薛曉強，趙月，王帥，等.飼料脂肪水平對血鸚鵡幼魚肝臟免疫及抗氧化酶的影響[J].中國漁業質量與標準，2018（3）：61-67.

[6] 彭婷，胡庭俊，林勇，等.低溫脅迫對羅非魚血液生化、免疫及抗氧化指標的影響[J].水產科學，2012，31（5）：259-263.

[7] 李文龍，梁興明，梁萌青，等.溫度對大菱鲆幼魚生長及免疫相關酶活性的影響[J].水產科學，2017，36（3）：311-316.

[8] 支兵杰，劉偉，趙春剛，等.鹽度對大麻哈魚幼魚消化酶及堿性磷酸酶活力的影響[J].上海海洋大學學報，2009，18（3）：289-294.

[9] 白秀娟，盧伙勝，劉曉彬，等.鹽度、pH脅迫對茂名海域文昌魚磷酸酶活性的影響[J].海洋通報，2009，28（4）：42-46.

[10] 王曉雯，朱華，馬國慶.高溶氧對西伯利亞鱘幼魚非特異性免疫指標的影響[J].四川農業大學學報，2017，35（1）：93-98.

[11] 鄭慧，李彬，榮小軍，等.鹽度和溶解氧對刺參非特異性免疫酶活性的影響[J].漁業科學進展，2014，35（1）：118-124.

[12] 孔祥會，劉占才，郭彥玲，等.汞暴露對草魚器官組織中堿性磷酸酶活性的影響[J].中國水產科學，2007，14（2）：270-274.

[13] 詹付鳳，趙欣平.重金屬鎘對鯽魚堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響[J].四川動物，2007，26（3）：641-643.

[14] 田麗粉，任仲，崔毅，等.勝利原油對褐牙鲆仔稚魚的急性毒性和幼魚堿性磷酸酶的影響[J].海洋水產研究，2008，29（6）：95-100.

[15] 劉伍香，杜青平，李彥旭，等.1，2，4-三氯苯對斑馬魚體內SOD、CAT和AKP活性影響[C]//持久性有機污染物論壇2011暨第六屆持久性有機污染物全國學術研討會論文集.北京：中國化學會，2011.

[16] LUSHCHAK V I，LUSHCHAK L P，MOTA A A，et al.Oxidative stress and antioxidant defenses in goldfish Carassius auratus during anoxia and reoxygenation[J].American journal of physiology regulatory integrative & comparative physiology，2001，280（1）：100-107.

[17] 馮廣朋，莊平，章龍珍，等.溫度對中華鱘幼魚代謝酶和抗氧化酶活性的影響[J].水生生物學報，2012，36（1）：137-142.

[18] 郭黎，馬愛軍，王新安，等.鹽度和溫度對大菱鲆幼魚抗氧化酶活性的影響[J].大連海洋大學學報，2012，27（5）：422-428.

[19] 強俊，任洪濤，徐跑，等.溫度與鹽度對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化酶活力的協同影響[J].應用生態學報，2012，23（1）：255-263.

[20] 楊健，陳剛，黃建盛，等.溫度和鹽度對軍曹魚幼魚生長與抗氧化酶活性的影響[J].廣東海洋大學學報，2007，27（4）：25-29.

[21] 況新宇，王曉雯，朱華.高溶氧量對西伯利亞鱘抗氧化酶活力及肝臟損傷相關指標的影響[J].水產科技情報，2016，43（4）：198-202.

[22] 楊凱.溶氧水平對黃顙魚生長、代謝及氧化應激的影響[D].武漢：華中農業大學，2010.

[23] WAN X，BI J C，GAO X J，et al.Partial enteral nutrition preserves elements of gut barrier function，including innate immunity，intestinal alkaline phosphatase （IAP）level，and intestinal microbiota in mice[J].Nutrients，2015，7（8）：6294-6312.

[24] 張健東，陳剛.中華烏塘鱧耗氧率和窒息點的研究[J].水產養殖，2002（4）：28-31.

[25] 莊平，王妤，章龍珍，等.鹽度驟降對點籃子魚存活率及肝臟抗氧化酶活性的影響[J].復旦學報（自然科學版），2011，50（3）：366-372.

[26] 豐程程，張穎，張永泉，等.哲羅魚胚胎至仔稚幼魚期主要免疫指標和抗氧化酶的活性變化[J].淡水漁業，2013，43（6）：35-38，50.

[27] MCCORMICK S D.Endocrine control of osmoregulation in teleost fish[J].American zoologist，2001，41（4）：781-794.

[28] 施兆鴻，岳彥峰，彭士明，等.飼料脂肪水平對褐菖鲉血清生化指標、免疫及抗氧化酶活力的影響[J].中國水產科學，2013，20（1）：101-107.

[29] DE ZOYSA M，WHANG I，LEE Y，et al.Transcriptional analysis of antioxidant and immune defense genes in disk abalone（Haliotis discus discus）during thermal，lowsalinity and hypoxic stress[J].Comparative biochemistry & physiology part B：Biochemistry & molecular biology，2009，154（4）：387-395.

[30] IM E，KIM Y S，KIM Y S，et al.Mo1755 myeloid differentiation factor 88（MYD88）is the linchpin of antitumor immunity against phosphatase and tensin homologue（PTEN）associated intestinal tumor development and metastasis[J].Gastroenterology，2015，148（4）：703.