湖北棗陽煙區(qū)煙葉赤星病病原鑒定

周鵬 朱聞君

摘要 為明確湖北棗陽煙區(qū)煙草赤星病病原菌的種類，給產(chǎn)區(qū)綜合防治煙草赤星病提供依據(jù)。從棗陽煙區(qū)采集典型煙草赤星病樣本進行病原菌分離，在致病性測定的基礎(chǔ)上通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對病原菌進行鑒定。結(jié)果顯示，分離出的菌株ZY-1為煙草赤星病病原菌，其分生孢子卵形或橢圓形，褐色，具有3～6個橫隔膜和1～4個縱隔膜，分生孢子鏈較短呈樹狀，多分枝，病原菌rDNA-ITS 序列分析結(jié)果表明，菌株ZY-1與鏈格孢（A.alternata）同源性最高，達100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定為鏈格孢（A.alternata），這是首次在湖北棗陽煙區(qū)發(fā)現(xiàn)由鏈格孢（A.alternata）引起的煙草赤星病。

關(guān)鍵詞 煙草赤星病;鏈格孢;分子鑒定

中圖分類號 S435.72 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0146-03

Abstract Typical disease spot specimens were collected from different areas and pathogen isolation and pathogenicity tests were carried out to determine tobacco brown spot pathogen species in Zaoyang area of Hubei and providing basis for comprehensive control of tobacco brown spot. The results showed that the strain ZY-1 isolated from disease spot were confirmed to be pathogens of tobacco brown spot. Its conidia are oval with 3-6 diaphragms and 1-4 mediastinal membranes. The sporangial chains were mostly shortbranched. The results of sequences analysis of rDNA - ITS showed the strain ZY-1 had the highest homology with A. alternata， up to 100%. The pathogen was identified as A. alternata based on the results of morphological and molecular biology identification. It was the first time that A. alternata caused tobacco brown spot was found in Zaoyang of Hubei Province.

Key words Tobacco brown spot;A. alternata;Genetic identification

流行速度快等特點，在溫濕度適宜時，短時間內(nèi)即可造成大面積病害流行，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，降低工業(yè)使用價值，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大損失[2]，已成為煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

引起煙草赤星病的病原菌屬于半知菌類，鏈格孢屬。該病主要發(fā)生在煙草大田生長中后期，從煙株下部葉開始發(fā)生，病斑自上而下逐步發(fā)展，典型癥狀是初期為黃褐色圓形小點，以后擴大到1～2 cm，病斑圓形或不規(guī)則圓形，周圍有黃色暈圈，上面產(chǎn)生明顯的以病斑中央為圓心的同心輪紋，質(zhì)脆、易破碎，嚴(yán)重時病斑愈合形成大的病斑[3]。

目前已知引起煙草赤星病的鏈格孢種類有鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）、鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）、細極鏈格孢（A.tenuissima）4個種[4-5]。山東部分地區(qū)煙草赤星病的病原菌主要為鏈格孢（A.alternata）[6]，湖北各煙區(qū)煙草赤星病主要病原菌有鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）、鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）、細極鏈格孢（A.tenuissima）4個種，其優(yōu)勢種群為長柄鏈格孢（A.longipes）[7]，河南省煙草赤星病病原菌為鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）和鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）3個種[4]，貴州省煙草主栽區(qū)赤星病病原菌為鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）[2]，彭希文等[8]鑒定出云南煙區(qū)煙草赤星病病原菌有鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes），胡中會等[9]對云南省28個產(chǎn)煙區(qū)28個供試菌株進行了rDNA- ITS 序列分析，28個供試菌株與GenBank 中登錄的鏈格孢屬7 個種（包括5個小孢子種Alternaria citri，A.alternata，A.longipes，A.mali，A.gaisen和2個大孢子種A.porri，A.solani）14個菌株的序列進行了聚類分析。

筆者提取供試菌株基因組DNA，采用形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS序列分析的分子生物學(xué)方法鑒定湖北省襄陽市棗陽煙區(qū)煙草赤星病病原菌類型，以期為湖北棗陽煙區(qū)煙草赤星病的流行監(jiān)測及綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料于2019年6月從湖北襄陽市棗陽市清潭鎮(zhèn)不同煙田采集具有煙草赤星病典型特征的病葉樣品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

①PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

②PCR及電泳所需試劑：Taq PCR Master Max（包括 0.1 U/μL Taq DNA polymerase，0.4 mmol/L each dNTP 2×Taq Buffer，PCR enhance reagent and proteide steady reagent）。

③試驗所用引物由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離。

采用組織分離法分離病原菌。在帶有煙草赤星病典型特征的病葉病斑處，用剪刀或解剖刀從病健交界處切取3～4 mm大小的病組織數(shù)塊，先用75%乙醇消毒30 s，0.1%升汞溶液消毒30 s，再用無菌水漂洗3次，后用滅菌的濾紙吸干組織表面的水分，移至PDA培養(yǎng)基平板上，置于溫度25 ℃、相對濕度75%、12 h/12 h光暗交替的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。

1.3.2 病原菌的純化。

用無菌接種針挑取培養(yǎng)物菌落邊緣少許菌絲于新的PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)純化3次，獲得菌株的純培養(yǎng)。純化的菌株移入PDA斜面于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 病原菌致病性測定。

采用離體葉片接種法，取湘煙三號的新鮮健康葉片，用70%乙醇表面消毒后再用無菌水沖洗2～3次，放入消過毒的培養(yǎng)皿中，用直徑6 mm的打孔器在培養(yǎng)7 d的PDA平板上打取邊緣菌絲塊，接種至葉片上，用保鮮膜封培養(yǎng)皿保濕，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。葉片發(fā)病后，從病斑上再次分離病原物，比較其與接種用的菌株形態(tài)特征是否一致。

1.3.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離得到的致病菌株在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后觀察菌落形態(tài)、顏色等形態(tài)學(xué)特征。將單孢菌株接種到PDA平板上，培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d后，在無菌條件下用滅菌的刮鏟或棉簽刮掉平板上的菌絲，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d，在顯微鏡下觀察分生孢子梗。用移液槍移取5 mL滅菌水，用刮鏟輕刮菌落，再用滅菌的脫脂紗布過濾，取2～3 mL過濾后的菌液制成玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病菌的分生孢子形態(tài)。

1.3.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定。

參考Sambrook等[10]的方法，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA，以其總DNA為模板，用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對病原菌rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和0.5 μg /mL溴化乙錠（EB）溶液染色后檢查擴增結(jié)果。用DNAMAN（版本5.2.2）軟件校對、拼接供試菌株的ITS區(qū)序列（包括ITS1、58S rDNA 和ITS2）序列，然后與互聯(lián)網(wǎng)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中的ITS區(qū)相關(guān)序列進行同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草赤星病病原菌分離及致病性測定

從湖北棗陽煙區(qū)不同煙田分離獲得一株病原菌，命名為ZY-1，對分離純化的病原菌菌株進行致病性測定，能引起健康煙葉產(chǎn)生病斑，病斑從接種點逐漸擴展，病斑為褐色，周圍有黃色暈圈（圖1）。

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落圓形，呈灰白色，菌落邊緣氣生菌絲絨狀，氣生菌絲發(fā)達，菌落邊緣有淡黃色的環(huán)帶。分生孢子卵形或橢圓形，褐色，具有3～6個橫隔膜和1～4個縱隔膜，分生孢子鏈較短呈樹狀，多分枝。參照張?zhí)煊頪11]對鏈格孢屬真菌形態(tài)特征的描述，及楊濤等[7]、祖艷青等[4]、唐承成等[2]對煙草赤星病病原菌的分離鑒定結(jié)果，初步鑒定分離的病原菌為鏈格孢（A.alternata）（圖2）。

2.3 病原菌分子鑒定

用真菌生物核糖體DNA通用引物ITS1和ITS4對病原菌rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，擴增出的片段長度約為600 bp（圖3）。將測序結(jié)果在GenBank中進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)供試菌株與鏈格孢（A.alternata）同源性最高，達100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，該病原菌為鏈格孢（A.alternata）（表1和圖4）。

3 結(jié)論與討論

不同地區(qū)引起煙草赤星病的種類不同，目前已知引起煙草赤星病的鏈格孢種類主要有鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（ A.longipes）、鴨梨鏈格孢（A.yaliinficiens）、細極鏈格孢（A.tenuissima）4個種，黎妍妍等[5]、萬科[12]、關(guān)博元等[13]對4種煙草赤星病病原菌的致病力進行了測定，發(fā)現(xiàn)4種煙草赤星病病原菌的致病力存在顯著差異，溫度、pH、碳氮源利用等生物學(xué)特性上也存在差異。因此對病原菌種類進行分類，能為煙區(qū)制定針對性防治措施提供參考。該研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對湖北襄陽市棗陽煙區(qū)煙草赤星病病原菌進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起棗陽煙區(qū)煙草赤星病的病原菌為鏈格孢（A.alternata），這是在湖北襄陽棗陽煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)由鏈格孢（A.alternata）引起的煙草赤星病。

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年