高產(chǎn)黃原膠基因工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究

馬建榮 黎敬鴻 余永紅

摘要 采用控制變量的方法對(duì)高產(chǎn)黃原膠基因工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。通過改變發(fā)酵相關(guān)碳源、氮源、接種量、時(shí)間等培養(yǎng)條件進(jìn)行分析得到發(fā)酵的最優(yōu)條件。經(jīng)過試驗(yàn)確定，在含有5 g細(xì)菌蛋白胨，3 g酵母提取物，20 g甘油，6%蔗糖，加去離子水至1 L，調(diào)pH至7.0所配制的培養(yǎng)基下，以接種量為0.5%接種突變菌XccYH1，30 ℃培養(yǎng)4 d，發(fā)酵所得的黃原膠產(chǎn)量最多。

關(guān)鍵詞 野油菜黃單胞菌;黃原膠;發(fā)酵;優(yōu)化

中圖分類號(hào) TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0175-03

Abstract To optimize the fermentation condition of highyield xanthan gum genetic engineering bacteria by controlling variable methods.Changing the culture conditions such as fermentationrelated carbon source，nitrogen source，inoculation amount and culture time to obtain the optimum fermentation conditions.It has been experimentally determined to be inoculated in a medium containing 5 g of bacterial peptone，3 g of yeast extract，20 g of glycerol，6% of glucose，added deionized water to 1 L，and adjusted pH to 7.0.The 0.5% of mutant XccYH1 was cultured at 30 ℃ for 4 days，the yield of xanthan gum obtained by fermentation was the most.

Key words Xanthomonas campestris;Xanthan gum;Fermentation;Optimization

單胞菌屬（Xanthomnas）是植物病原菌中較大的類群，能侵染400多種植物，包括許多重要的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物[1]，如水稻（白葉枯病，X.oryzae pv.oryzae）[2]、棉花（角斑病，X.axonopodis pv.malvacearum）[3]、十字花科植物（黑腐病，X.campestris pv.campestris，以下簡(jiǎn)稱Xcc）[4]、柑橘（潰瘍病，X.axonopodis pv.citri）[5]等，侵染后影響農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

Xcc是研究病原菌與寄主植物相互作用的模式菌株，其侵染寄主植物過程中，產(chǎn)生多種致病因子，包括胞外多糖（EPS）、脂多糖、胞外酶（果膠酶、纖維素酶、淀粉酶和蛋白酶等）以及黏附素等[7]。Xcc分泌的胞外多糖，又稱為黃原膠。雖然黃原膠是黃單胞菌的致病因子，但在其他領(lǐng)域卻具有重要應(yīng)用價(jià)值[8]。黃原膠是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)的幾種微生物多糖中最具有特色的一種，也是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大、用途最廣的微生物多糖。目前，全世界黃原膠的年產(chǎn)量已超過20萬噸，在發(fā)酵工業(yè)中占重要地位，也為相關(guān)行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[8]。其常作為助懸劑、增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等，在醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品、洗滌劑、涂料、石油開采等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[9-10]。

但我國(guó)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量有待提高，隨著Xcc全基因組測(cè)序完成，黃原膠合成相關(guān)的代謝途徑和分子機(jī)制已經(jīng)研究清楚，為分子生物學(xué)手段定向改造提供了可能[11]。獲得黃原膠高產(chǎn)基因工程菌株，優(yōu)化發(fā)酵的相關(guān)條件，發(fā)展我國(guó)黃原膠發(fā)酵的生產(chǎn)力是一種切實(shí)可行的方法[12]。

前期對(duì)黃原膠合成基因簇下游基因Xc_1672進(jìn)行敲除，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變株XccYH1顯著提高了黃原膠產(chǎn)量，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。該研究擬通過控制變量法探究黃原膠發(fā)酵的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和試劑。

黃原膠高產(chǎn)菌株XccYH1由本實(shí)驗(yàn)室通過基因工程方法獲得。抗生素利福平購自Sigma公司。

1.1.2 儀器。

PB-10 pH計(jì)（SARTORIUS AG）;MP2002電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;ZHWY200B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）;LS-B50L-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）;QL-902漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;DHG-9240鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 野油菜黃單胞菌胞外多糖的檢測(cè)。

將菌株XccYH1接種于NYG液體培養(yǎng)基（5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母粉，20 g/L甘油）中，30 ℃（200 r/min）搖床培養(yǎng)24 h后，調(diào)整菌體濃度至OD600約為1.0，并按1%的比例接種至含4%碳源的NYG中（含相應(yīng)抗生素），30 ℃ （200 r/min）搖床培養(yǎng)5 d后，加入4倍體積的無水乙醇沉淀胞外多糖，邊注入邊攪拌，然后將絮狀沉淀物取出后置于42 ℃充分干燥，所得即為黃原膠。以黃原膠重量作為衡量發(fā)酵效果的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 碳源對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

以淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖作為培養(yǎng)基碳源，考察碳源對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。在NYG中加入4%淀粉、4%葡萄糖、4%麥芽糖和4% 蔗糖作為培養(yǎng)基，按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

1.2.3 碳源濃度對(duì)黃原膠發(fā)酵的試驗(yàn)。以上一步試驗(yàn)所得最佳碳源作為培養(yǎng)基的碳源，考察碳源濃度對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。在NYG中加入2%、4%、6%和8%最佳碳源作為培養(yǎng)基，按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

1.2.4 氮源對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

以蛋白胨、細(xì)菌蛋白胨和牛肉浸取物作為培養(yǎng)基的氮源，考察氮源對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。將NYG培養(yǎng)基中的蛋白胨改變成蛋白胨、細(xì)菌蛋白胨和牛肉浸取物，按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

1.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，并在接種后2、3、4、5 d進(jìn)行收集測(cè)量，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

1.2.6 接菌量對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

分別在培養(yǎng)基中加入0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的菌體，按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

1.2.7 菌種穩(wěn)定性對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。

將XccYH1劃線接種到NYG培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，標(biāo)記為1代。每隔1 d重新接菌到平板上，直到接菌至10代。選取1代、4代、7代、10代菌株進(jìn)行黃原膠發(fā)酵。按照“1.2.1”方法進(jìn)行黃原膠發(fā)酵，每組發(fā)酵設(shè)計(jì)平行做3個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響

為進(jìn)一步提高基因工程菌XccYH1的黃原膠產(chǎn)量，首先探索不同碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響。由圖1可知，以淀粉、葡萄糖和麥芽糖為碳源時(shí)，黃原膠產(chǎn)量無顯著性差異，而以蔗糖為碳源時(shí)，所產(chǎn)的黃原膠產(chǎn)量最高，后續(xù)試驗(yàn)中以蔗糖作為碳源測(cè)定黃原膠產(chǎn)量。

2.2 碳源濃度對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響

進(jìn)一步考察添加不同濃度碳源時(shí)，基因工程菌黃原膠的產(chǎn)量變化。由圖2可知，在低濃度碳源（2%～6%）時(shí)，黃原膠產(chǎn)量隨著濃度的增加而顯著增加，當(dāng)添加6%蔗糖時(shí)黃原膠產(chǎn)量最高，達(dá)20.3 g/L。但繼續(xù)提高碳源濃度到8%，顯著抑制菌體生長(zhǎng)，也沒有檢測(cè)到黃原膠。因此，碳源濃度為6%時(shí)，黃原膠產(chǎn)量最高。

2.3 氮源對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)室常用的氮源中，細(xì)菌蛋白胨的效果最好，所產(chǎn)黃原膠產(chǎn)量最高，而以牛肉浸取物為氮源時(shí)，黃原膠產(chǎn)量最低。因此，檢測(cè)條件下，細(xì)菌蛋白胨為最優(yōu)氮源。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)生產(chǎn)成本有重要影響。為探索基因工程菌XccYH1的最佳發(fā)酵時(shí)間，該研究測(cè)定了第2～5天所產(chǎn)生黃原膠的產(chǎn)量（圖4），結(jié)果顯示4～5天發(fā)酵產(chǎn)生的黃原膠產(chǎn)量相當(dāng)，無顯著性差異，但第3天產(chǎn)生的黃原膠約為第4天產(chǎn)量的92%，而第2天產(chǎn)量?jī)H為第4天產(chǎn)量的74%，發(fā)酵第1天沒有檢測(cè)到黃原膠的產(chǎn)生。以上結(jié)果說明，該基因工程菌的最佳發(fā)酵時(shí)間為4 d，而這一特點(diǎn)與野生菌沒有差異。

2.5 接菌量對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量的影響

接種量直接影響種子液的培養(yǎng)成本，同時(shí)也能直接影響菌體生長(zhǎng)延滯期時(shí)長(zhǎng)，直接影響工業(yè)生產(chǎn)成本，該研究繼續(xù)探索了不同接種量對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響（圖5），結(jié)果顯示接種量為0.5%～4.0%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生的黃原膠產(chǎn)量無明顯差異，推測(cè)其原因可能是該基因工程菌生長(zhǎng)與野生菌無明顯差異，在發(fā)酵條件下24 h內(nèi)都能生長(zhǎng)到平臺(tái)期，不影響黃原膠的合成。

2.6 基因工程黃原膠高產(chǎn)菌的穩(wěn)定性研究

基因工程菌的穩(wěn)定性往往是能否進(jìn)入工業(yè)化應(yīng)用的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，在非抗生素壓力條件下穩(wěn)定性好的菌種將具有更好的應(yīng)用前景，該研究將XccYH1菌株在無抗性的培養(yǎng)基上連續(xù)劃線傳10代后，菌落形態(tài)沒有差異，進(jìn)一步考察了傳不同代數(shù)時(shí)黃原膠的產(chǎn)量（圖6）。結(jié)果顯示，該菌株產(chǎn)黃原膠能力沒有明顯改變，第4代菌株的黃原膠產(chǎn)量為第1代菌株的98%，第7代為95%，第10代菌株的黃原膠產(chǎn)量仍有94%。以上結(jié)果說明，基因工程菌XccYH1菌株具有非常好的穩(wěn)定性，可以滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。

3 結(jié)論與討論

野油菜黃單胞菌（Xcc）是十字花科植物黑腐病菌的病原菌，在全球范圍內(nèi)引起植物病害，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。Xcc在植物侵染過程中產(chǎn)生眾多的致病因子，包括蛋白酶、纖維素酶、胞外多糖等，因此Xcc也是研究細(xì)菌與植物互作的模式菌種[2]。另一方面，Xcc產(chǎn)生的胞外多糖（黃原膠）又具有重要的工業(yè)價(jià)值，在食品、藥品、化妝品等諸多領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。

該研究利用控制變量法，探究在不同碳源、不同碳源濃度、不同氮源、不同發(fā)酵時(shí)間、不同接種量發(fā)酵條件下，基因工程菌的黃原膠產(chǎn)量差異，結(jié)果表明黃原膠發(fā)酵的最佳碳源是蔗糖，最佳碳源濃度是6%，最佳氮源為細(xì)菌蛋白胨，最佳培養(yǎng)時(shí)間為4 d，接種量對(duì)發(fā)酵沒有顯著性影響。

該研究還探索了基因工程菌黃原膠產(chǎn)量的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示在無抗生素選擇壓力時(shí)，該基因工程菌的穩(wěn)定性較好，第10代菌株的黃原膠產(chǎn)量仍有第1代菌株的94%，說明該菌株能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。黃原膠是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸等組成的酸性雜多糖，碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響非常顯著[13]。該研究也發(fā)現(xiàn)在低濃度時(shí)，黃原膠產(chǎn)量隨著碳源濃度增加而顯著提高，但當(dāng)蔗糖濃度增加到8%時(shí)，菌株不能生長(zhǎng)，推測(cè)是因?yàn)檎崽菨舛冗^高以致滲透壓過大，反而有了抑菌效果。該研究對(duì)基因工程菌進(jìn)行了發(fā)酵條件的初步優(yōu)化，為該菌株的工業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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