健婦膠囊中阿魏酸含量測(cè)定方法的改進(jìn)

朱玉芳 劉瀟瀟

【摘 要】 目的：改進(jìn)健婦膠囊中阿魏酸的含量測(cè)定方法。方法：采用5%碳酸鈉溶液代替乙醚作為新的供試品提取溶劑，運(yùn)用高效液相色譜法，以SHARPSIL-H C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-1%醋酸溶液（35∶[KG-*3/5]65）為流動(dòng)相，流速為0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果：測(cè)得阿魏酸在0.02～0.48 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.0000）;平均回收率為91.3%，RSD為 1.3% （n=6） ;運(yùn)用改進(jìn)后的提取方法的測(cè)定結(jié)果約為原方法結(jié)果的3倍。結(jié)論：改進(jìn)后的方法遵循化合物的性質(zhì)，較原方法更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

【關(guān)鍵詞】 健婦膠囊;阿魏酸;高效液相色譜法;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）21-0031-04

Abstract：Obstract To improve the method of determination of ferulic acid in Jianfu capsule. Mwthods sing 5% sodium carbonate solution instead of ether as a new extraction solvent，andtheHigh Performance Liquid Chromatography （HPLC） analysis was carried out onSHARPSIL-H C18（250mm×4.6m， 5μm）columnwith methanol-1% acetic acid（35∶[KG-*3/5]65） as the mobile phase eluted at the flow rate of 0.8mL·min-1. Thedetection wavelength was set at 322 nm and the column temperature was set at 30℃.Results Ferulic acid showed good linear relationship in the range of 0.02 - 0.48μg （r=1.000 0）.Average recovery was 91.3%， and RSD was 1.3% （n=6）.The result of the improved extraction method is about 3 times of the original method.Conclusion The improved method follows the properties of the compound. Compared with the original method， it is simpler， faster and more accurate.

Keywords：Jianfu Capsules; Ferulic Acid;HPLC;Content Determination

健婦膠囊由海狗腎、鹿胎、山茱萸、酒當(dāng)歸、炒白術(shù)等11 味藥組成，具有補(bǔ)血養(yǎng)血，活血化瘀，調(diào)經(jīng)止帶的功效，臨床常用于治療赤白帶下、血崩血漏、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)[1]。酒當(dāng)歸活血通經(jīng)，為本方中主要藥味之一，主含阿魏酸、揮發(fā)油、維生素B12、葉酸等成分[2-5]。健婦膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中酒當(dāng)歸含量測(cè)定方法操作繁雜，結(jié)果重現(xiàn)性差，提取效率低。為了更加有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保療效，本研究從化合物的性質(zhì)和規(guī)律入手，對(duì)原提取方法進(jìn)行改進(jìn)，建立HPLC法測(cè)定健婦膠囊中阿魏酸的含量，為健婦膠囊質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀（島津公司）;Sartorius CP244S/CP225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;Thermo Fisher D低溫離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）;Elmasonic S 300H超聲儀（德國(guó)Elma公司）;Milli-Q超純水制備儀（ 美國(guó)Millipore 公司） 。

1.2 試藥 阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110773-201614，含量以99.0%計(jì)）;甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純;健婦膠囊（批號(hào)：130801、131001、131201、141101、141102、141103、160401、160402、160403），缺當(dāng)歸陰性樣品由實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為 SHARPSIL -H C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-1%醋酸溶液（35∶[KG-*3/5]65），檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm，流速為0.8 ?mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸20μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入5%碳酸鈉溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率350 W，頻率37kHz）20分鐘，放冷，再稱定重量，用5%碳酸鈉溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘5000轉(zhuǎn)）8 min，精密吸取上清液25 mL，用乙醚洗滌2次，每次25 mL，棄去乙醚液，水溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，用乙醚振搖提取5次，每次25 mL，合并乙醚提取液，低溫水浴揮干乙醚，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺當(dāng)歸陰性對(duì)照樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄色譜圖，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，供試品溶液顯示對(duì)應(yīng)的色譜峰，陰性對(duì)照溶液無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明，陰性溶液對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)干擾。如圖1所示。

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對(duì)照品0.01210 g（十萬(wàn)分之一天平稱取），加甲醇制成每1 mL中含阿魏酸19.1664 μg的對(duì)照品溶液，分別精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，其回歸方程為：Y=7.3E+6X-3773.0（r=1.0000），阿魏酸在0.02～0.48 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為19.1664 μg/mL的阿魏酸對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得阿魏酸峰面積的RSD=0.1%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于1、4、8、12、16、20、24 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)得樣品中阿魏酸峰面積的RSD=0.2%。說(shuō)明樣品中阿魏酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取健婦膠囊樣品（批號(hào)：160401）6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果RSD為0.8%，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn) 取已知阿魏酸含量的樣品（批號(hào)：160401）6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入濃度為17.9685 μg/mL的對(duì)照品溶液5 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，平均回收率為91.3%，RSD為1.3%，表明該方法可行。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.11 樣品的含量測(cè)定 取健婦膠囊樣品九批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算阿魏酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取阿魏酸對(duì)照品溶液在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在波長(zhǎng)為322 nm處有最大吸收，故以322 nm作為阿魏酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。如圖2所示。

3.2 提取溶劑的選擇 阿魏酸化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸（Ferulic acid），是一種芳香酸，在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在，主要與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結(jié)合態(tài)。根據(jù)阿魏酸的理化性質(zhì)，采用堿解法可以水解出游離態(tài)的阿魏酸，故選取5%碳酸鈉提取結(jié)合乙醚萃取以增加阿魏酸的提取率。取3批樣品（批號(hào)：160403、160402、160401），分別按原方法和新建立的方法對(duì)酒當(dāng)歸中的阿魏酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，采用新建立的方法測(cè)定健婦膠囊中阿魏酸的含量結(jié)果約為按照原測(cè)定結(jié)果的3倍，可見(jiàn)原方法對(duì)樣品中阿魏酸提取不完全，其原因是原方法標(biāo)準(zhǔn)采用乙醚作為提取溶劑，僅檢測(cè)出游離態(tài)的阿魏酸，提取效率低。采用5%碳酸鈉溶液提取，能水解結(jié)合態(tài)的阿魏酸，提取效率高，能更好地對(duì)健婦膠囊中的酒當(dāng)歸進(jìn)行質(zhì)量控制。見(jiàn)表3。

3.3 含酒當(dāng)歸中成藥的質(zhì)量控制 《中國(guó)藥典》2015年版一部收載含酒當(dāng)歸的中成藥品種中，有8個(gè)（小金丸/片/膠囊、中風(fēng)回春丸/片、當(dāng)歸龍薈丸、固本益腸片、參茸白鳳丸、參茸固本片、獨(dú)活寄生丸、豨薟通栓丸/膠囊）均采用薄層色譜法對(duì)其中酒當(dāng)歸進(jìn)行檢測(cè)，其前處理方法中，中風(fēng)回春丸/片采用加氨水提取，其他品種均采用直接用乙醚提取。鑒于薄層色譜鑒別不需進(jìn)行回收率考察，故采用乙醚提取即可。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，采用高效液相色譜法對(duì)中成藥中酒當(dāng)歸進(jìn)行阿魏酸含量測(cè)定，其前處理方法大多采用加堿溶液進(jìn)行提取，以保證提取完全，回收率符合藥典規(guī)定。因此，對(duì)于中成藥中酒當(dāng)歸的質(zhì)量控制，可視處方組成、處方量及制法采用適宜的檢測(cè)方法，進(jìn)而確定科學(xué)簡(jiǎn)捷的前處理方法。

3.4 結(jié)論 酒當(dāng)歸能活血通經(jīng)，當(dāng)歸經(jīng)過(guò)酒炙，活血作用增強(qiáng)，是健婦膠囊處方中重要藥味之一。健婦膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JZ20020011，為2000年前研發(fā)，已不符合實(shí)際需要，因此，需要優(yōu)化酒當(dāng)歸中阿魏酸的含量測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)所建立的阿魏酸測(cè)定方法較原方法提取效率高了3倍，操作更加簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于健婦膠囊中阿魏酸的含量測(cè)定，為中成藥中酒當(dāng)歸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-06-04 編輯：劉 斌）