妊娠合并宮頸癌中唾液內源性磷酸化肽段的診斷價值

江絮萍，李杰萍，何拉曼，黃海燕

0 引 言

宮頸癌是女性發生頻率很高的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1-3]。國際上通常把妊娠期、產褥期和產后6個月內發生的宮頸癌稱為妊娠合并宮頸癌，也稱妊娠相關性宮頸癌[4]。目前，宮頸癌篩查和診斷的方法主要分為三步：首先是初篩，即進行陰道分泌物或脫落細胞涂片；初篩陽性患者再進行陰道鏡檢；鏡檢結果懷疑癌變患者則最后通過鏡下取活組織做病理切片確診[5-6]。對于妊娠期婦女而言，由于擔心宮頸檢查或取活組織產生的創傷引起流產，部分患者在產前檢查時不檢查宮頸或不進行宮頸細胞學檢查，從而導致漏診和誤診。此外，陰道流血容易被誤認為與妊娠有關，從而忽略上述檢查[7]。因此，尋找一種新的既無創簡便，同時又準確高效的妊娠合并宮頸癌診斷方法是十分有意義的。

唾液作為一種極易取得，且成分同身體健康狀況高度相關的體液，在近10余年中已經成為很多腫瘤診斷技術研究中的診斷液[8-9]。唾液的成分復雜[10]，蛋白/肽段種類極其豐富[11]。腫瘤的發生、發展和轉移同異常的蛋白/肽段的磷酸化水平通常有很強的關聯性，而體內蛋白/肽段的磷酸化水平變化會直接在唾液中表現出來[12-14]。因此，可以通過直接分析唾液中內源性磷酸化肽段(不用酶解而直接存在的磷酸化肽段)來進行疾病的早期診斷。目前，唾液中內源性磷酸化肽段的表達種類與表達量用于妊娠合并宮頸癌診斷的相關研究還不完善。為此，本研究采集Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者和健康孕婦的唾液，對其中的內源性磷酸化肽段進行富集后，再利用基質輔助激光解析(Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)質譜進行定性定量檢測。根據質譜數據分析其中的差異，初步探究唾液內源性磷酸化肽段在妊娠合并宮頸癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2016年至2018年期間在武警福建省總隊醫院婦產科生產的健康孕婦(38例)，以及同期在武警福建省總隊醫院(10例)、上海第一婦嬰(18例)和福建省人民醫院(8例)接受妊娠合并宮頸癌檢查的患者。妊娠合并宮頸癌患者的納入標準：①按照2009年FIGO臨床分期標準劃分，經病理檢查證實為Ⅰ～Ⅲ期宮頸癌；②具有完整的診療記錄；③采樣前未接受腫瘤切除手術；④采樣前未接受放療或化療。排除標準：除宮頸癌外，還患有其他重大疾病的患者。健康孕婦的納入標準為未診斷出患有重大疾病。共有74例受試者納入本研究，年齡(33.9±14.3)歲。其中，健康孕婦38例(健康孕婦組)，年齡(33.1±13.5)歲。妊娠合并宮頸癌患者36例，年齡(36.1±12.1)歲，按臨床分期分為：Ⅰ期組12例，年齡(32.4±8.4)歲；Ⅱ期組13例，年齡(34.1±14.1)歲；Ⅲ期組11例，年齡(35.2±10.7)歲。本研究經醫院倫理委員會批準(批準號：第12號)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2唾液采集方法每位健康孕婦在妊娠中期(20～28周)內采集唾液樣品2份，每位患者在確診為妊娠合并宮頸癌后3 d內采集唾液樣品2份。所有受試者均在上午10-11點之間采集唾液。采集前2 h內禁止飲食，采集前10 min清洗口腔。使用德國薩斯特公司(Sarstedt)的唾液采集管，并按照其推薦步驟采集唾液。每份獲得的唾液樣品各取200 μL置于離心管中，冷凍離心干燥后存于-80 ℃冰箱待用。

1.3唾液內源性磷酸化肽段富集方法使用美國賽默飛世爾公司(ThermoFisher)的磷酸化肽段富集試劑盒(High-Select TiO2Phosphopeptide Enrichment Kit)，并按照試劑盒的推薦步驟依次操作，完成對上述干燥后的唾液樣品的富集。最終得到的含磷酸化肽段的洗脫液為質譜測試樣品。

1.4質譜測試方法使用美國愛博才思公司(AB SCIEX)的5800 MALDI-TOF/TOF質譜分析樣品。具體步驟為取1 μL洗脫液點在MALDI靶板上，干燥后再點上0.7 μL DHB(25 mg/mL)基質，再次干燥后進行質譜分析。質譜檢測質荷比(m/z)范圍1000～3000。每份洗脫液均按上述方法在靶板上點2個樣品點，每個點進行2次質譜分析。除正常的質譜測試外，在健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者的洗脫液樣品中各隨機選取一份，分別進行7次重復性實驗(內源性磷酸化肽段+質譜分析)。

1.5質譜數據分析定性分析方法：首先選出一張譜圖中所有信噪比(S/N)≥10的一級質譜峰，依次進行串級質譜分析；如主要碎片離子同母離子相差98 Da(丟失H3PO4)，則證明母離子中含有磷酸根，母離子對應肽段為磷酸化肽段；后續的譜圖中，如發現同之前鑒定到的磷酸化肽段質荷比數相差±0.1 Da以內的一級質譜峰，即認為是同一磷酸化肽段，不用再次進行串級質譜分析。

定量分析方法：直接使用質譜信號強度代表譜圖中的磷酸化肽段豐度；未鑒定到的磷酸化肽段豐度記為0；每例受試者的唾液磷酸化肽段豐度使用全部8張譜圖(2份唾液樣品×每份樣品2個樣品點×每個樣品點質譜分析2次)的平均值。

各組受試者中各條唾液內源性磷酸化肽段的相對豐度的計算方法為：首先計算各條磷酸化肽段在各組受試者唾液樣品中的平均豐度；然后將所有磷酸化肽段在各組中的平均豐度分別在各組之間進行歸一化(令最大值為100)，得到最終表內數據。相對豐度為0即為在該組中未鑒定到該條肽段。

健康-妊娠合并宮頸癌P值的計算方法為：對于任意一條唾液磷酸化肽段，將38例健康孕婦組中每例受試者的對應唾液磷酸化肽段豐度數據，同36例Ⅰ～Ⅲ期宮頸癌患者組中每例受試者的對應唾液磷酸化肽段豐度數據相比較，使用t檢驗的方法計算P值。

按照每條磷酸化肽段的相對豐度同該條磷酸化肽段在各組受試者唾液樣品中的平均豐度的哪個值最接近就判斷為對應的疾病狀態，再同實際臨床診斷結果相比對，統計得到各條磷酸化肽段在不同組癌癥患者中的診斷準確率。

1.6統計學分析使用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。計量資料采用平均數表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數(百分率)表示，采用卡方檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 唾液內源性磷酸化肽段檢測方法的驗證不經過富集，直接進行MALDI質譜分析的唾液樣品的質譜譜圖中無磷酸化肽段質譜信號峰。經過富集后，再進行MALDI質譜分析的唾液樣品的質譜譜圖中磷酸化肽段質譜峰清晰可見。典型的受試者的唾液樣品在進行磷酸化肽段富集前后的MALDI質譜圖見圖1。在所有24條信噪比大于10的質譜峰中有16條磷酸化肽段，比例高達67%(16/24)。重復性實驗結果發現，4組唾液樣品在7次重復性實驗中鑒定磷酸化肽段種類的重合度均大于90%，相同質譜峰的信號強度的相對標準偏差(RSD)均小于10%。

a：富集前(無磷酸化肽段信號)；b：富集后(磷酸化肽段，使用星號標記)

圖1 一位受試者的唾液樣品在進行磷酸化肽段富集前后的質譜圖

2.2唾液內源性磷酸化肽段的檢測結果在全部74例受試者的唾液樣品中，共鑒定到25條內源性磷酸化肽段。其中，健康孕婦22條(88%，22/25)，Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者20條(80%，20/25)，Ⅱ期患者21條(84%，21/25)，Ⅲ期患者19條(76%，19/25)。4組受試者的唾液樣品中鑒定到的內源性磷酸化肽段及其相對豐度見表1。15條(60%，15/25)唾液磷酸化肽段的豐度在健康孕婦和妊娠合并宮頸癌患者之間差異有統計學意義(P<0.05)。健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者之間共同存在的內源性磷酸化肽段有13條，占總共鑒定到的52%(13/25)。僅存在于健康孕婦唾液中有3條肽段(12%，3/25)，質荷比為1270.3、1589.4和2004.7。僅存在于妊娠合并宮頸癌患者唾液中有3條肽段(12%，3/25)，質荷比為1076.4、2119.7和2722.8。從健康孕婦唾液同妊娠合并宮頸癌患唾液中肽段含量的差異來看，健康孕婦唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液最高的質譜信號強度之比大于2的磷酸化肽段有3條(12%，3/25)，質荷比為1270.3、1589.4、2004.7。健康孕婦唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液最低的質譜信號強度(不含0)之比小于0.5的有7條(28%，7/25)，質荷比為1076.4、1230.3、1461.4、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。從肽段含量的變化趨勢來看，從健康孕婦到Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液中含量依次增加的磷酸化肽段有2條(8%，2/25)，質荷比為1461.4和2722.8；依次下降的磷酸化肽段有1條(4%，1/25)，質荷比為1784.6。綜上，共有11條唾液內源性磷酸肽段(44%，11/25)是潛在的妊娠合并宮頸癌診斷標志物。它們的質荷比分別為1076.4、1230.3、1270.3、1461.4、1589.4、1784.6、2004.7、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。僅存在于癌中的3條磷酸化肽段(質荷比為1076.4、2119.7和2722.8)能夠最方便的區分出健康孕婦與妊娠合并宮頸癌患者。統計這3條磷酸化肽段在不同組癌癥患者中的診斷準確率。結果為質荷比為1076.4的診斷準確率分別為Ⅰ期45%、Ⅱ期43%、Ⅲ期52%；質荷比為2119.7的診斷準確率分別為Ⅰ期66%、Ⅱ期56%、Ⅲ期51%；質荷比為2722.8的診斷準確率分別為Ⅰ期44%、Ⅱ期40%、Ⅲ期48%。

表1 各組受試者中各條唾液內源性磷酸化肽段(使用質荷比表示)的相對豐度

質荷比(m/z)健康孕婦組(n=38)Ⅰ期組(n=12)Ⅱ期組(n=13)Ⅲ期組(n=11)P值1000.247100073<0.011076.407633100<0.011114.33777100590.0421155.31004870340.0911230.319491000<0.011270.3100000<0.011311.49810083810.251386.45293100430.191426.49437901000.0921461.41969791000.0471481.599010067<0.011538.53110039890.0741589.4100000<0.011596.58313971000.0811637.64567100130.0611704.498851000<0.011752.67623100650.0871784.61009873200.0541899.637100260<0.012004.7100000<0.012119.703010072<0.012323.72310067720.0322541.815010069<0.012722.807981100<0.012837.88277151000.053

3 討 論

3.1 唾液內源性磷酸化肽段檢測方法的合理性唾液成分復雜，且內源性磷酸化肽段豐度極低[15]。直接用MALDI質譜進行分析所得到的譜圖雜亂，高豐度成分將磷酸化肽段信號完全抑制，導致無磷酸化肽段信號。因此，需要先使用富集材料(如TiO2)抓取唾液中的內源性磷酸化肽段，然后通過洗滌富集材料將絕大部分非目標物質去除，最終得到雜質較少、濃度較高的磷酸化肽段洗脫液后再進行MALDI質譜分析。本研究中使用的磷酸化肽段富集試劑盒可以保證富集方法的有效性。實驗結果顯示在富集后的唾液MALDI質譜圖中，大部分信噪比大于10的質譜峰為磷酸化肽段。與相關富集分析唾液中內源性磷酸化肽段文獻相對比，本文中的富集效果(67%)同國內外的研究水平相近[16-17]。使用商用唾液采集管和磷酸化肽段富集試劑盒還可以保證整個方法的重復性。重復性實驗結果顯示，在各組受試者的唾液樣品中，本研究采用的方法在定性和定量方面均具有較好的重復性和穩定性。這為使用唾液內源性磷酸化肽段作為指標對妊娠合并宮頸癌患者進行診斷打下了基礎。

3.2唾液內源性磷酸化肽段的診斷價值唾液內源性磷酸肽段在健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者之間差異有統計學意義(P<0.05)。通過這些差異，在本研究的結果部分共分析總結出11條可能成為妊娠合并宮頸癌診斷標志物的唾液內源性磷酸肽段，表明唾液內源性磷酸化肽段對妊娠合并宮頸癌具有一定的診斷價值。對于診斷指標而言，首要目的是區分健康與疾病狀態。在上述11條肽段中，3條僅存在于健康孕婦唾液中(m/z：1270.3、1589.4和2004.7)和3條僅存在于妊娠合并宮頸癌患者唾液中(m/z：1076.4、2119.7和2722.8)的內源性磷酸化肽段能最清楚的區分健康孕婦和Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者。同時，根據僅存在于癌中的3條肽段的量的差異，還可以進一步區分具體的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期。對于癌癥而言，早期癌癥患者有更高的幾率可以治愈，而晚期的癌癥患者則通常難以治愈[18]。因此癌癥的早期診斷具有更重要意義。值得注意的是，質荷比為2119.7的唾液內源性磷酸化肽段診斷Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者的準確率均超過了50%，且診斷Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者的準確率達到了66%。說明該唾液內源性磷酸化肽段可以較準確的區分出Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期(特別是Ⅰ期)妊娠合并宮頸癌患者，具有診斷早期妊娠合并宮頸癌的能力。這一準確率水平同現有文獻中報道的通過檢測血清miRNA[19-22]，或者聯合檢測組織中蛋白標志物[23]，從而進行宮頸癌早期診斷的方法相近。當然，由于使用的樣品為唾液，因此本文的方法更加簡便，對患者無傷害。

綜上所述，唾液內源性磷酸化肽段在妊娠合并宮頸癌中有很高的診斷價值。本研究共發現11條唾液內源性磷酸肽段是潛在的妊娠合并宮頸癌診斷標志物。其中，質荷比為2119.7的磷酸化肽段還可以較準確的區分具體的癌癥臨床階段。特別是利用該磷酸化肽段區分Ⅰ期妊娠合并宮頸癌的準確率達到了66%，具有重要的研究意義和早期診斷價值。當然，這些唾液內源性磷酸化肽段診斷妊娠合并宮頸癌的可靠性還有待未來更多的臨床樣本進行驗證。