乳酸菌和木糖葡萄球菌對產氣莢膜梭菌 抑制能力分析

張 歡，李沛軍，田興壘，陳 倩，孔保華

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

亞硝酸鹽是香腸等腌制肉制品中常用的添加劑，具有抑菌、抗氧化、呈色、賦予產品風味等功能，其中，呈色與抑菌作用是其在肉制品中應用的最重要原因[1-3]。 然而，亞硝酸根與肉類中的仲胺或叔胺反應會生成致癌、致畸和致突變的亞硝基化合物，加之其本身的毒性，因而應用受限[4-5]。為此，科研人員進行了大量研究以期找出能夠部分或完全替代肉制品中亞硝酸鹽的天然替代物[6-7]，但到目前為止，基于各種原因鮮見此類物質在肉制品中廣泛應用[8]。

目前，微生物發酵法替代肉制品中的亞硝酸鹽是一個全新的研究領域，一些細菌可通過接種或本身存在于發酵肉制品中，除賦予發酵產品特殊風味和口感外，還可有效抑制有害菌的增殖生長[9-12]。還有研究發現一些菌株可以產生NO與肉中的肌紅蛋白作用形成亞硝基肌紅蛋白，使肉呈現鮮艷的亮紅色[13-14]。前期Li Peijun等[15]選用本實驗室的5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌作為受試菌株，結果發現其中1 株木糖葡萄球菌和1 株發酵乳桿菌在培養基體系中可將肌紅蛋白轉化為氧合肌紅蛋白，在肉糜體系中將高鐵肌紅蛋白轉化為亞硝基肌紅蛋白，均具有良好的呈色效果。

肉類腌制中添加亞硝酸鹽，其抑菌作用中最主要是抑制肉毒梭狀芽孢桿菌生長和產毒素，保障肉制品 安全[16-17]。基于以上Li Peijun等[15]對呈色菌株的獲得，本研究擬探究這5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌體外抑制肉毒梭菌增殖的能力，獲取1 株抑菌能力強的菌株，與之前獲得的呈色效果好的菌株復配，制成復合呈色抑菌劑從而替代肉制品中亞硝酸鹽的添加。然而，肉毒梭菌毒性大且難以獲得，基于前人研究，發現產氣莢膜梭菌與其具有相似的生理活性和生長習性，且該菌易得，毒性相對較小，對操作環境要求不高，在實驗過程中可以很好替代肉毒梭菌進行相關研究[18-19]。目前，Nieto-Lozano[20]和Enan[21]等分別發現乳酸片球菌和能夠產植物乳桿菌素的植物乳桿菌UG1能夠有效抑制產氣莢膜梭菌；Enan等[22]將這種細菌素應用到雞肉、火雞肉和牛肉樣品中，發現實驗組中的有害菌得到了極好的控制。

本研究以產氣莢膜梭菌替代肉毒梭狀芽孢桿菌，擬以5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌作為受試菌株，通過混合培養以及條件培養，分別研究這些菌株及其發酵上清液對菌體本身生長、芽孢萌發與生長、芽孢形成的抑制作用，評價并篩選抑菌能力最強的目標菌株，同時探究抑菌機理，以期獲得具有抑菌作用的發酵劑，為發酵肉制品的安全提供良好的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）ATCC 13124（type A）、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）KLDS1.0709和清酒乳桿菌（L. sake）AS1由中國工業微生物菌種保藏管理中心提供；彎曲乳桿菌（L. curvatus）、植物乳桿菌（L. plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）從哈爾濱風干腸中分離獲得并保存于東北農業大學食品學院畜產品加工研究室。

MRS（de Man, Rogosa and Sharp）液體培養基 廣東環凱微生物科技有限公司；mDS（medium D plus sucrose）芽孢形成培養基、mDS-G（medium D plus sucrose-glucose）培養基、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養基、甘露醇鹽瓊脂（mannitol salt agar，MSA）培養基 北京陸橋生物科技有限公司；瓊脂、氯化鈉、乳酸均為分析純。

1.2 儀器與設備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限 公司；AL-104精密電子天平、DELTA 320 pH計 上海梅特勒-托利多儀器設備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫用儀器廠；搖床培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；754PC紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；ZHJH-1109超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試菌株的培養

將發酵乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌和木糖葡萄球菌分別在MRS液體培養基，產氣莢膜梭菌在BHI培養基中活化2 代至對數生長末期，6 000×g離心10 min，收集各個菌體沉淀，然后取一定量的菌體沉淀分別接種到8 mL mDS-G培養液中，依據前期菌體濃度-OD600nm的標準曲線，將木糖葡萄球菌和其他乳酸菌分別調至所需濃度對應的OD值，使木糖葡萄球菌終濃度為6（lg（CFU/mL）），其他5 株乳酸菌終濃度各為7（lg（CFU/mL）），用于后續研究。

1.3.2 產氣莢膜梭菌芽孢的制備

芽孢的制備參照Cevallos-Cevallos等[23]的方法，將1.3.1節活化好的產氣莢膜梭菌以2%的量接種到50 mL mDS培養基中，37 ℃厭氧培養12 h，80 ℃加熱30 min除去活細胞，制備得到產氣莢膜梭菌芽孢。

1.3.3 產氣莢膜梭菌生長的抑制

1.3.3.1 混合培養

參照Teo等[24]的方法，略作改動。在1.3.1節含有不同受試菌株的mDS-G培養液中同時添加產氣莢膜梭菌菌株，使其終濃度達到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，測定培養液pH值、受試菌數和產氣莢膜梭菌菌數。其中，乳酸菌計數采用MRS瓊脂培養基，木糖葡萄球菌計數采用MSA瓊脂培養基，產氣莢膜梭菌計數采用BHI瓊脂培養基，37 ℃培養48 h，進行計數。

1.3.3.2 條件培養

參照Wrigley[25]的方法，將1.3.1節接種有各受試菌的mDS-G培養液于37 ℃厭氧培養24 h后，測定各培養液pH值，通過0.22 μm無菌濾膜過濾除去受試菌株，再接種產氣莢膜梭菌，使其終濃度達到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，對產氣莢膜梭菌進行活菌計數。產氣莢膜梭菌計數方法同上。

1.3.4 產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長的抑制

1.3.4.1 混合培養

將1.3.2節制備的產氣莢膜梭菌芽孢添加到1.3.1節處理好的6 株受試菌株mDS-G培養液中，并使其終濃度達 到3（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，測定培養液pH值、各受試菌數和產氣莢膜梭菌數。

1.3.4.2 條件培養

將1.3.1節接種有各受試菌的mDS-G培養液于37 ℃厭氧培養24 h后，測定各培養液pH值，通過過濾除去受試菌株，再接種產氣莢膜梭菌芽孢，使其終濃度達到 3（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，對產氣莢膜梭菌進行活菌計數。

1.3.5 產氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制

1.3.5.1 混合培養

參照Wrigley[25]的方法，略作改動。考慮到芽孢形成需要較高的pH值，經預實驗，將所用mDS產芽孢培養基pH值調節為6.8。將產氣莢膜梭菌接種到8 mL mDS芽孢形成培養基中，使其終濃度達到7（lg（CFU/mL））；同時接種6 株受試菌體沉淀，使乳酸菌終濃度為 7（l g（C F U/m L）），木糖葡萄球菌濃度為 6（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，測定培養液pH值及其受試菌株菌落數和產氣莢膜梭菌芽孢數。

1.3.5.2 條件培養

參照Wrigley[25]的方法，先將6 株受試菌株菌體分別接種到mDS培養基（pH 6.8）中，調節乳酸菌終濃度為 7（l g（C F U/m L）），木糖葡萄球菌濃度為 6（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，發現各菌株幾乎不生長或生長現象不明顯，繼續培養至48 h后，測定培養液pH值。通過過濾除去菌體，再接種產氣莢膜梭菌菌株，使其終濃度達到7（lg（CFU/mL））。37 ℃厭氧培養24 h后，測定產氣莢膜梭菌芽孢數。

1.3.6 抑菌機理分析

1.3.6.1 pH值對產氣莢膜梭菌生長及芽孢萌發的影響

為驗證乳酸菌發酵引起的培養基pH值降低是否為抑制產氣莢膜梭菌生長的因素，分別用乳酸調節mDS-G培養基pH值至一系列值（6.8、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0和4.8），滅菌后分別接種產氣莢膜梭菌菌株（終濃度為7（lg（CFU/mL）））或其芽孢（終濃度為3（lg（CFU/mL）））。37 ℃厭氧培養24 h后，測定其中產氣莢膜梭菌數。

1.3.6.2 抑菌物質對產氣莢膜梭菌生長的影響

在“產氣莢膜梭菌生長的抑制”系列實驗中，發現植物乳桿菌除可以導致培養基具有較低pH值這一抑制產氣莢膜梭菌條件外，還應該代謝產生了某種抑菌物質，而上述pH值梯度實驗也從側面說明了這一點。為進一步驗證是否存在該抑菌物質，將植物乳桿菌和彎曲乳桿菌（產酸能力基本一致）接種到mDS-G培養基中進行厭氧培養，發酵后調節二者pH值和對照組一致（pH 6.8），分別用80 ℃加熱30 min滅菌和0.2 μm無菌濾膜的方式除去受試菌，再分別接種產氣莢膜梭菌（終濃度為 7（lg（CFU/mL））），37 ℃厭氧培養24 h后，測定其中產氣莢膜梭菌數。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 抑制產氣莢膜梭菌生長分析

2.1.1 混合培養

圖 1 受試菌與產氣莢膜梭菌混合培養對產氣莢膜梭菌的抑制作用Fig. 1 Inhibition of C. perfringens by LAB and S. xylosus in mixed culture

由圖1可知，各組乳酸菌數均升高至8（lg（CFU/mL）） 以上，且彼此間無顯著性差異（P＞0.05），木糖葡萄球菌數生長到7.14（lg（CFU/mL））。通過對比可發現，植物乳桿菌組和清酒乳桿菌組中產氣莢膜梭菌數最低，經培養后分別降低到5.62（lg（CFU/mL））和 5.96（lg（CFU/mL）），而對照組中產氣莢膜梭菌數為8.58（lg（CFU/mL）），表明這兩株菌不僅抑制了產氣莢膜梭菌的生長，且對其有一定的殺死作用。發酵乳桿菌、戊糖片球菌和彎曲乳桿菌組中產氣莢膜梭菌數維持在6～7（lg（CFU/mL）），這表明這3 株乳酸菌對產氣莢膜梭菌的生長具有一定的抑制作用，但對其幾乎沒有殺死能力。另外，木糖葡萄球菌組中產氣莢膜梭菌數最高，達到7.88（lg（CFU/mL））。Gioia等[26]將植物乳桿菌和德氏乳桿菌分別與產氣莢膜梭菌共培養24 h后，發現這兩株菌均具有很好的抑制產氣莢膜梭菌增殖能力，且前者抑制能力優于后者，推測這可能與乳酸菌的產酸以及抑菌物質的能力有關。本實驗結果亦表明乳酸菌的產酸能力與其抑菌能力密不可分。

2.1.2 條件培養

圖 2 不同受試菌株條件培養基對產氣莢膜梭菌的抑制作用Fig. 2 Inhibition of C. perfringens by LAB and S. xylosus in conditioned culture

由圖2可知，經過24 h的厭氧培養，彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、發酵乳桿菌和植物乳桿菌組的發酵上清液pH值降至4.9～5.0之間，對應的產氣莢膜梭菌生長受到強烈抑制；戊糖片球菌組和木糖葡萄球菌組pH值分別降為5.18和6.27，兩組對應的產氣莢膜梭菌細胞未受破壞，這表明乳酸菌代謝產生的有機酸是抑制產氣莢膜梭菌增殖的關鍵因素，Schoster等[27]在17 株商業益生菌對產氣莢膜梭菌和艱難梭狀芽孢桿菌的抑制研究中也證實了這一結論。另外值得注意的是，植物乳桿菌組中并未發現產氣莢膜梭菌的存在，這進一步表明，該組中除較低的pH值這一抑菌條件外，也存在其他的抑菌物質。

2.2 抑制產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長分析

2.2.1 混合培養

產氣莢膜梭菌存活在營養不良或不適合其生長的外界環境時，可形成芽孢[28]。由圖3可知，經過24 h的混合厭氧培養，各組受試菌株均生長良好。與對照組相比，在接種乳酸菌的體系中，產氣莢膜梭菌芽孢萌發受到明顯抑制，經過24 h的厭氧培養，菌數不超過 5.89（lg（CFU/mL）），這表明僅有少量的芽孢萌發并進行二次生長，而木糖葡萄球菌組中，產氣莢膜梭菌的芽孢萌發并未受到抑制，其菌數達到了7.08（lg（CFU/mL））。 這可能是乳酸菌在發酵的過程中產生了的機酸抑制了芽孢的萌發，Lee等[29]以不添加亞硝酸鹽的乳化腸為研究模型，結果發現添加2%的白醋（主要成分為乙酸）可使產氣莢膜梭菌芽孢不能在2 周內萌發。

圖 3 受試菌與產氣莢膜梭菌混合培養對其芽孢萌發及生長的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on spore germination and growth of C. perfringens in mixed culture

2.2.2 條件培養

圖 4 不同受試菌株條件培養基對產氣莢膜梭菌芽孢萌發及 生長的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on spore germination and growth of C. perfringens in conditioned culture

由圖4可知，經過24 h的厭氧培養，多數乳酸菌處理組pH值降為4.9～5.0，戊糖片球菌組pH值為5.16，木糖葡萄球菌組最終pH值為6.21。在所有乳酸菌發酵得到的條件培養基中，產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長受到了較強的抑制。木糖葡萄球菌處理組中，產氣莢膜梭菌數達到了6.75（lg（CFU/mL）），雖略低于對照組，但考慮到菌株間的競爭作用，認為其并未對其芽孢的萌發及生長產生抑制作用。對比各組條件培養基pH值不難發現，產氣莢膜梭菌芽孢的萌發和生長，與條件培養基的初始pH值有很大相關性。

2.3 抑制產氣莢膜梭菌芽孢形成分析

2.3.1 混合培養

由于產氣莢膜梭菌在形成芽孢時，會產生腸毒素，且其一旦形成芽孢，將更難以殺滅[30]。因此，為研究不同菌株對產氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制作用，首先將6 株受試菌株與產氣莢膜梭菌同時接種于mDS產芽孢培養基中混合培養，37 ℃厭氧培養24 h后，分別測定受試菌株數和產氣莢膜梭菌芽孢數。由于mDS培養基中以高分子聚合物淀粉為碳源，各株受試乳酸菌對其利用效果很差，因此導致了乳酸菌生長緩慢，而未對產氣莢膜梭菌芽孢形成有效的抑制作用[31]；木糖葡萄球菌雖然有生長，但亦未觀察到其對芽孢形成的抑制作用（數據未列出）。

2.3.2 條件培養

圖 5 不同受試菌株條件培養基對產氣莢膜梭菌芽孢形成的抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of LAB and S. xylosus on sporulation of C. perfringens in conditioned culture

如圖5所示，經過48 h的厭氧培養，菌落計數結果顯示，彎曲乳桿菌和清酒乳桿菌基本沒有顯示出生長跡象，其中活菌數有所下降，這表明二者不能利用淀粉作為其營養物質，因此，亦不能抑制產氣莢膜梭菌芽孢的形成。發酵乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌數稍有增長，相應培養基pH值也有所降低，其對應的條件培養基中未發現芽孢的生成。由于產氣莢膜梭菌芽孢形成需要較高的pH值和不存在游離單糖兩個條件[30]，因此，這也就很好地解釋了這3 株乳酸菌可以抑制其芽孢形成的現象。同樣，盡管木糖葡萄球菌生長，但亦未觀察到其對應條件培養基對芽孢形成有抑制作用。

2.4 抑菌機理分析

2.4.1 培養基pH值對產氣莢膜梭菌和其芽孢萌發及生長的影響

2.4.1.1 培養基pH值對產氣莢膜梭菌生長的影響

表 1 培養基初始pH值對產氣莢膜梭菌生長的影響Table 1 Influence of initial medium pH on C. perfringens growth（lg（CFU/mL））

由表1可知，隨著培養基pH值下降，產氣莢膜梭菌數亦呈現下降趨勢。與2.1.1節混合培養對產氣莢膜梭菌生長的抑制能力研究結論一致，即pH值下降是乳酸菌抑制產氣莢膜梭菌生長的主要原因，而植物乳桿菌則可能存在其他途徑抑制該病原菌的生長。隨著pH值下降至5.0以下，產氣莢膜梭菌顯著降低（P＜0.05），這解釋了在條件培養中多數乳酸菌抑制產氣莢膜梭菌生長而戊糖片球菌對其抑制作用不明顯的問題，同時也表明植物乳桿菌具備分泌某種抑菌物質的能力，可以使產氣莢膜梭菌數降為0。總之，乳酸菌發酵葡萄糖產酸降低培養基pH值是決定乳酸菌抑制產氣莢膜梭菌生長的主要因素，這主要是因為有機酸可穿過細菌細胞膜，在胞內發生解離后釋放出無法穿過細胞膜的電荷陰離子和質子，對必需代謝反應的抑制進一步造成了對細菌的生長抑制[32]。另外，植物乳桿菌可能存在其他抑制產氣莢膜梭菌生長的途徑。

2.4.1.2 培養基pH值對產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長的影響

表 2 培養基不同初始pH值對產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長的影響Table 2 Influence of initial medium pH on spore germination and growth of C. perfringens （lg（CFU/mL））

由表2可知，隨著培養基pH值下降，產氣莢膜梭菌菌數下降，表明低pH值是抑制產氣莢膜梭菌芽孢萌發及二次生長的關鍵因素。該結果與抑制產氣莢膜梭菌芽孢萌發及生長實驗均表明，無論是乳酸菌發酵還是直接調節培養基pH值，都不能殺死或破壞產氣莢膜梭菌芽孢，在混合培養中，植物乳桿菌處理組中產氣莢膜梭菌數最少（圖3）的原因可能是在混合培養初期，部分芽孢萌發得到的活細胞在二次生長的過程中受到來自植物乳桿菌抑菌物質的作用，抑制了其生長。因此，乳酸菌發酵葡萄糖產酸降低培養基pH值是決定乳酸菌抑制產氣莢膜梭菌芽孢萌發的最主要因素，而當芽孢一旦萌發，植物乳桿菌分泌的抑菌物質會協同低pH值作用，抑制其二次生長[33]。

2.4.2 抑菌物質對產氣莢膜梭菌生長的影響

表 3 不同處理方式對產氣莢膜梭菌生長的影響Table 3 Influence of different treatments on C. perfringens growth

經過對植物乳桿菌和彎曲乳桿菌進行24 h的厭氧發酵，兩組mDS-G培養基pH值分別降低至4.91和4.93 （表3），表明二者發酵葡萄糖產酸水平總體相當。將兩組培養基pH值調節至6.80后使用兩種方式滅（除）菌，再同時向3 種培養基中接種產氣莢膜梭菌。培養后計數結果顯示，無論是加熱殺死還是過濾除去條件菌，植物乳桿菌組均對產氣莢膜梭菌均有更強的抑制作用（P＜0.05）。由于其pH值已經調節和對照組一致，因此，抑菌作用只能源自其分泌的抑菌物質，考慮到該抑菌物質的耐熱性，推斷其為植物乳桿菌分泌的細菌素。而對于兩組彎曲乳桿菌組（加熱或過濾），產氣莢膜梭菌落數均達到7.8（lg（CFU/mL））以上，略低于對照組的 8.14（lg（CFU/mL）），這可能是因為雖然處理組培養基pH值與對照組相同，但由于前期彎曲乳桿菌的生長，消耗了部分培養基營養成分所致。此外，對比條件培養實驗結果（圖2）可知，條件培養組中并未檢測到產氣莢膜梭菌活細胞，而本實驗中將其pH值調回6.80后，測定其活細胞數為4（lg（CFU/mL））。這說明在條件培養中，較低pH值和細菌素的協同作用，抑制了產氣莢膜梭菌生長。

3 結 論

5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌對產氣莢膜梭菌增殖、芽孢生長及萌發、芽孢形成抑制作用不同，其中，植物乳桿菌對產氣莢膜梭菌抑制能力最強，這是因為植物乳桿菌除產酸抑菌外，還可產生耐高溫的細菌素，其他4 株乳酸菌效果次之，而木糖葡萄球菌無明顯的抑制作用。研究為抑制產氣莢膜梭菌增殖提供了解決方法，后續可以將本實驗中具有良好抑菌作用的植物乳桿菌與前期研究得到的呈色菌種（發酵乳桿菌或木糖葡萄球菌）進行復配，應用于發酵肉制品中，為微生物發酵法部分替代亞硝酸鹽提供一條很好的途徑。