響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乳球菌KLDS4.0325 產(chǎn)葉酸的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件

焦雯姝，關(guān)嘉琦，史佳鷺，李柏良，陸婧婧，閆芬芬，李 娜，占 萌，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳酸菌是能夠利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，呼吸方式主要為兼性厭氧、耐氧性厭氧和嚴(yán)格厭氧。乳酸菌并不是微生物在分類學(xué)上的名稱，而是一種慣用叫法。研究證實(shí)，乳酸菌能夠抑制腸道病原菌的生長(zhǎng)，緩解腹瀉、乳糖不耐癥和便秘，降膽固醇，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[1-2]，乳酸菌發(fā)酵后所產(chǎn)生的葉酸、核黃素、γ-氨基丁酸、色氨酸等物質(zhì)對(duì)于人體健康有很高的價(jià)值。

隨著全基因組測(cè)序方法的快速發(fā)展，使研究人員可以從基因水平上了解微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和組成，進(jìn)而挖掘和控制其生物學(xué)功能[3]。乳酸乳球菌KLDS4.0325的全基因組序列已經(jīng)上傳到了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為：CP006766。通過對(duì)KLDS4.0325基因組序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)在嘌呤代謝途徑和苯丙氨酸合成葉酸途徑中，KLDS4.0325在基因水平上均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的葉酸合成能力[4]。

葉酸是一種水溶性維生素，又稱VB9，是大多數(shù)生物體內(nèi)一碳單位的供體，在維持人體機(jī)能和代謝活動(dòng)中發(fā)揮著不可或缺的作用[5]，它參與了人體中兩種至關(guān)重要的反應(yīng)，分別是核酸的生物合成和與DNA合成和修復(fù)有關(guān)的甲基化反應(yīng)[6-7]，同時(shí)，葉酸在同型半胱氨酸再生蛋氨酸的過程中發(fā)揮重要作用[8]。然而，人類是無法從頭合成葉酸的[9]，葉酸攝入量不足會(huì)引起一系列的疾病[10]。目前，工業(yè)上合成葉酸的方法以化學(xué)合成法居多，但有研究發(fā)現(xiàn)，天然葉酸的低攝入和合成葉酸的過攝入均與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)[11-12]，同時(shí)過多地?cái)z入化學(xué)合成的葉酸會(huì)間接地引起VB12缺乏癥[13]。近些年來，利用食品級(jí)微生物通過發(fā)酵的方法強(qiáng)化食品中天然葉酸的含量被廣泛研究[14-15]。因此，一株高產(chǎn)葉酸的益生菌的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)于人體健康和天然葉酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)都有著舉足輕重的作用。在乳酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生葉酸的過程中易受發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、對(duì)氨基苯甲酸（p-aminobenzoic acid，pABA）的添加量、溫度及pH值變化等因素的影響[16]，因此探究乳酸菌葉酸發(fā)酵培養(yǎng)的最佳發(fā)酵條件是乳酸菌大量制備葉酸的關(guān)鍵。為了使乳酸乳球菌KLDS4.0325能夠合成更多的葉酸，本研究采用M17培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗(yàn)確定其最佳的氮源和碳源，通過響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乳球菌KLDS4.0325的前體物質(zhì)添加量及發(fā)酵條件，以期為該菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）KLDS4.0325，來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）。

M17肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；培養(yǎng)基各組分均購(gòu)于北京博奧拓達(dá)有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)，純度≥98%） 天津阿爾法生物科技有限公司；純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G L-2 1 M 高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；2996高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters公司；ODS-3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液中的葉酸含量

1.3.1.1 樣品前處理

將乳酸菌發(fā)酵液振蕩混勻后離心（10 000×g，4 ℃，10 min），取上清液，凍干濃縮10 倍后，用0.22 μm濾膜過濾，備用。將葉酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度0.05 mg/mL。

1.3.1.2 色譜條件

待測(cè)發(fā)酵液樣品和0.0 5 m g/m L 葉酸標(biāo)樣前處理后進(jìn)行液相色譜分析：固定相為O D S-3 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外檢測(cè)器（波長(zhǎng)280 nm）；流動(dòng)相甲醇-PBS（pH 7.2～7.4）為10∶90（V/V）； 流速1 mL/min；柱溫30 ℃；運(yùn)行時(shí)間12 min；流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾后超聲波脫氣30 min[17-18]。

以沒有接種的M 1 7 培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測(cè)定KLDS4.0325在30 ℃培養(yǎng)24 h后，發(fā)酵上清液中葉酸含量。結(jié)果以每毫升發(fā)酵液中葉酸的質(zhì)量表示。乳酸菌產(chǎn)葉酸量按下式計(jì)算：

式中：Y為乳酸菌的胞外葉酸產(chǎn)量；X為發(fā)酵液中總?cè)~酸含量；X0為空白組中葉酸含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

對(duì)M17培養(yǎng)基中的碳源及氮源進(jìn)行優(yōu)化，確定出菌株KLDS4.0325產(chǎn)葉酸的最佳碳源和氮源。選擇發(fā)酵初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、pABA以及谷氨酸添加量為影響葉酸產(chǎn)量的主要因素，通過單因素試驗(yàn)選擇Box-Behnken試驗(yàn)的影響因素與水平。使用篩選出的最佳碳源和氮源代替M17培養(yǎng)基中的碳源和氮源成分，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)。

1.3.2.1 碳源的影響

分別使用5.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、乳糖、α-半乳糖及麥芽糖替換M17培養(yǎng)基原有的碳源成分，分別以不接種的相應(yīng)培養(yǎng)基為空白組，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.3.1節(jié)中方法進(jìn)行葉酸含量的分析，同時(shí)測(cè)定第24小時(shí)的OD600nm值。

1.3.2.2 氮源的影響

分別使用17.5 g/L的檸檬酸銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母浸粉及牛肉膏替換M17培養(yǎng)基原有的氮源成分，分別以不接種的相應(yīng)培養(yǎng)基為空白組，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.3.1節(jié)中方法進(jìn)行葉酸含量的分析，同時(shí)測(cè)定第24小時(shí)的OD600nm值。

1.3.2.3 發(fā)酵初始pH值的影響

分別設(shè)置pH 4.2、5.2、6.2、7.2，以2%的接種量接種乳酸乳球菌KLDS4.0325，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，按照1.3.1節(jié)中方法進(jìn)行葉酸含量的分析。

1.3.2.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

以2%的接種量接種乳酸乳球菌KLDS4.0325，培養(yǎng)溫度30 ℃，從0 h開始，每隔2 h取樣，按照1.3.1.1節(jié)中方法離心，收集上清液-20 ℃?zhèn)溆谩＿B續(xù)取樣36 h后，按照1.3.1節(jié)中方法進(jìn)行葉酸含量的分析。

1.3.2.5 發(fā)酵溫度的影響

以2%的接種量接種乳酸乳球菌KLDS4.0325，發(fā)酵初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為25、30、36、42、45 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行葉酸含量的分析。

1.3.2.6 接種量的影響

分別設(shè)置1%、2%、4%與6%的接種量接種乳酸乳球菌KLDS4.0325，發(fā)酵初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，檢測(cè)葉酸含量。

1.3.2.7 pABA和谷氨酸添加量的影響

將pABA分別以20、30、40、50、60 mg/L的量加入到液體培養(yǎng)基中，谷氨酸添加量分別為0、2、4、6、8 g/L， 發(fā)酵初始pH 6.5，培養(yǎng)溫度30 ℃，發(fā)酵24 h結(jié)束后，檢測(cè)葉酸含量。

1.3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量影響顯著的因素為試驗(yàn)因素，以葉酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示。對(duì)葉酸產(chǎn)量進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)試驗(yàn)生成的等高線和響應(yīng)面圖確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

表 1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.4 模型的驗(yàn)證

利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。同時(shí)，在發(fā)酵過程中，每2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值，在最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間第24小時(shí)取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析與顯著性差異分析，運(yùn)用Origin9.0軟件進(jìn)行作圖，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 KLDS4.0325發(fā)酵液中的葉酸含量

2.1.1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.3.1.2節(jié)色譜條件，以葉酸標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)x， 峰面積為縱坐標(biāo)y，得其回歸方程為：y＝68 096x+941.37，R2＝0.998。

2.1.2 乳酸乳球菌KLDS4.0325發(fā)酵上清液中葉酸的HPLC檢測(cè)

圖 1 HPLC法檢測(cè)乳酸乳球菌KLDS4.0325發(fā)酵上清液中 葉酸含量Fig. 1 HPLC chromatogram of folic acid present in the fermentation supernatant of L. lactis KLDS4.0325

如圖1所示，質(zhì)量濃度0.05 mg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為10.272 min。菌株KLDS4.0325發(fā)酵上清液的液相色譜圖在第10.271分鐘處有峰，與標(biāo)品的分析結(jié)果一致，可以定量。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源的影響

碳源是影響菌體代謝與生長(zhǎng)的重要元素，不同碳源對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量及生長(zhǎng)量如圖2所示。乳酸乳球菌KLDS4.0325可以利用多種碳源，方差分析結(jié)果顯示不同種類的碳源對(duì)該菌株的葉酸產(chǎn)量和生長(zhǎng)量均有顯著影響（P＜0.05）。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，葉酸產(chǎn)量達(dá)到（0.382±0.032）μg/mL，顯著高于其他其他碳源（P＜0.05）。從生長(zhǎng)量看，以蔗糖為碳源時(shí)第24小時(shí)的OD600nm值顯著高于其他碳源（P＜0.05），葡萄糖其次。由于不同碳源的結(jié)構(gòu)不同，乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)葉酸的最適碳源為葡萄糖，這與Lai?o等[19]的研究結(jié)果一致。而生長(zhǎng)的最適碳源為蔗糖，葡萄糖僅次于蔗糖，因此確定葡萄糖為乳酸乳球菌KLDS4.0325產(chǎn)葉酸的最佳碳源。

圖 2 碳源對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 2 Influence of carbon sources on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

2.2.2 氮源的影響

氮源分為有機(jī)氮源與無機(jī)氮源，微生物可以將有機(jī)氮源酶解成小分子物質(zhì)，被菌體吸收轉(zhuǎn)化后進(jìn)一步參與代謝，最后形成微生物所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；無機(jī)氮源則可以調(diào)節(jié)外部環(huán)境的pH值和菌體的代謝，但是其利用速率較有機(jī)氮源快[20]。不同氮源對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量及生長(zhǎng)量的影響如圖3所示，當(dāng)以酵母浸粉為單一氮源時(shí)，乳酸乳球菌KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量和生長(zhǎng)量均顯著高于其他組別（P＜0.05）。從生長(zhǎng)量來看，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源更能促進(jìn)該菌株的生長(zhǎng)。

圖 3 氮源對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 3 Influence of nitrogen sources on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

2.2.3 初始pH值的影響

圖 4 初始pH值對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 4 Influence of initial medium pH on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為5.2時(shí)，葉酸的產(chǎn)量最高，達(dá)到了（0.291±0.008）μg/mL，但與pH 6.2差異不顯著（P＞0.05），與其他組有顯著差異，并且對(duì)比于使用未優(yōu)化的M17培養(yǎng)基的結(jié)果（0.260 μg/mL）有顯著提高，所以確定pH 5.2為培養(yǎng)基最佳初始pH值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

在乳酸菌合成葉酸的通路中，需要多種關(guān)鍵酶的參與，如GTP環(huán)化水解酶I，二氫葉酸合成酶，二氫葉酸還原酶，葉酰聚谷氨酸合酶等[21]，培養(yǎng)基的初始pH值可能是通過影響這些關(guān)鍵酶的活性，影響菌株合成葉酸的速率，進(jìn)而影響菌株單位時(shí)間內(nèi)的葉酸產(chǎn)量，同時(shí)培養(yǎng)基的初始pH值也會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖[22]。Wilbert等[23]研究發(fā)現(xiàn)，較低的pH值有利于提高嗜熱鏈球菌的胞外葉酸產(chǎn)量，從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，某些乳酸乳球菌可能也具備這一特點(diǎn)。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

圖 5 乳酸乳球菌KLDS4.0325的生長(zhǎng)與葉酸產(chǎn)量曲線Fig. 5 Growth curve and folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

如圖5所示，0～2 h乳酸乳球菌KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)率最高，這可能是由于菌體自身生長(zhǎng)需要葉酸[24]，刺激了葉酸合成相關(guān)基因的表達(dá)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，葉酸產(chǎn)量略有下降，可能是因?yàn)樵谶@一時(shí)期菌體的生長(zhǎng)速率驟升，導(dǎo)致菌體消耗葉酸的速率大于合成葉酸的速率。進(jìn)入穩(wěn)定期后，葉酸產(chǎn)量不斷積累，在第24小時(shí)達(dá)到最大值（0.260 μg/mL），而后略有下降。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇24 h為乳酸乳球菌KLDS4.0325的發(fā)酵時(shí)間。

2.2.5 發(fā)酵溫度的影響

圖 6 溫度對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

如圖6所示，菌株在36 ℃恒溫發(fā)酵時(shí)，葉酸的產(chǎn)量最高（0.283±0.006）μg/mL，但與30 ℃時(shí)無顯著差異（P＞0.05），與其他溫度處理組具有顯著差異，綜合考慮，選擇36 ℃為最佳發(fā)酵溫度，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。

據(jù)報(bào)道，不同菌株產(chǎn)葉酸的最適溫度差異較大，而且受到pH值的影響。例如，微小桿菌RB3在初始pH值為5.5、18 ℃時(shí)的葉酸產(chǎn)量最高，而在初始pH值為7、28 ℃時(shí)的葉酸產(chǎn)量最高[25]。這種現(xiàn)象可能是通過溫度和pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和對(duì)酶的活性的影響而表現(xiàn)出來的。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)探究了初始pH值和溫度對(duì)KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響的交互作用。

2.2.6 接種量的影響

圖 7 接種量對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 7 Effect of inoculum amount on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

如圖7所示，在接種量為1.0%、2.0%、4.0%、6.0%的 4 組之間KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量均無顯著差異（P＞0.05），因此，該因素不參與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.7 pABA和谷氨酸添加量的影響

pABA是乳酸菌合成葉酸的重要前提物質(zhì)[26-27]，盡管乳酸乳球菌KLDS4.0325合成pABA的通路是完整的[28]，但Wilbert等[23]研究表明pABA是乳酸乳球菌合成葉酸的限速步驟，在培養(yǎng)基中添加pABA可以提高葉酸產(chǎn)量。

從圖8A可以看出，加入適量的pABA顯著提高了乳酸乳球菌KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量，當(dāng)pABA添加量為 40.0 mg/L時(shí)，葉酸產(chǎn)量最高為（0.369±0.030）μg/mL，約是未添加pABA的1.42 倍，但與添加量為50.0 mg/L時(shí)無顯著差異（P＞0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇40.0 mg/L作為Box-Bohnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，外源添加pABA可以提高乳酸菌的葉酸產(chǎn)量，但提高的程度和pABA添加量不同菌株有差異。張海燕[29]研究了Lactobacillus plantarumJH-M1-6-30在pABA質(zhì)量濃度為20.0 mg/L時(shí)，葉酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，劉友群[30]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌CH-2在添加3% pABA的MRS液體培養(yǎng)基中的葉酸產(chǎn)量會(huì)較普通MRS培養(yǎng)基提高約兩倍。

除了pABA外，環(huán)境中的谷氨酸也是合成葉酸及其衍生物的前體物質(zhì)[31]，圖8B結(jié)果表明，加入適量的谷氨酸可以提高乳酸乳球菌KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量，當(dāng)谷氨酸添加量為6.0 g/L時(shí)，葉酸產(chǎn)量最高為（0.521±0.042）μg/mL， 約是未添加谷氨酸的2 倍，但與添加量為4.0 g/L和8.0 g/L無顯著差異（P＞0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇6.0 g/L作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖8 pABA（A）和谷氨酸（B）添加量對(duì)乳酸乳球菌KLDS4.0325 葉酸產(chǎn)量的影響Fig. 8 Effect of concentration of pABA (A) and glutamate (B) on folic acid production of L. lactis KLDS4.0325

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment with experimental results

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)發(fā)酵溫度、初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果如表3所示。所選擇的回歸模型的P＜0.05，表明整體模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著的影響，具有可信度；而失擬項(xiàng)P＝0.052 6＞0.05，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小，殘差主要由隨機(jī)誤差引起，模型選擇適當(dāng)；該模型的相關(guān)系數(shù)R＝0.957 3，校正相關(guān)系數(shù)為0.914 5，信噪比15.452＞4，表明模型可信度很高。葉酸產(chǎn)量Y對(duì)初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量、溫度的多元二次回歸方程為：

葉酸產(chǎn)量＝0.80+0.19A+0.025B+0.057C-0.16D+ 0.028AB+0.020AC-0.079AD+0.034BC-0.056BD-0.088CD-0.28A2-0.086B2-0.072C2-0.25D2

表 3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由回歸方程所做的響應(yīng)面立體圖與等高線圖如圖9所示，主要反映了初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量以及溫度之間的相互作用，通過方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 8.0.6分析計(jì)算，最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH 5.35、pABA添加量41.50 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、溫度35.40 ℃，此時(shí)模型預(yù)測(cè)KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量為0.851 μg/mL。

圖 9 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖Fig. 9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on folate production

2.5 回歸模型的驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)模型優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)實(shí)際條件，設(shè)置初始pH 5.40、pABA添加量42.0 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、 溫度35.40 ℃為發(fā)酵條件，對(duì)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中KLDS4.0325葉酸產(chǎn)量的平均值為0.814 μg/mL，與預(yù)測(cè)值擬合度達(dá)95.65%，表明優(yōu)化模型可靠。在最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間第24小時(shí)的細(xì)胞密度為2.13×109CFU/mL，在最優(yōu)條件下，菌株KLDS4.0325的生長(zhǎng)情況如圖10所示。

圖 10 最優(yōu)條件下乳酸乳球菌KLDS4.0325的生長(zhǎng)曲線Fig. 10 Growth curve of L. lactis KLDS4.0325 under optimal conditions

3 結(jié) 論

針對(duì)KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量，通過單因素試驗(yàn)，確定了M17培養(yǎng)基中的最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母浸粉，最佳發(fā)酵時(shí)間24 h，并篩選出了對(duì)KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量具有主要影響的4 個(gè)因素，初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量和溫度。利用響應(yīng)面 Box-Behnken試驗(yàn)建立了二次多項(xiàng)式回歸模型，最終確定發(fā)酵條件為初始pH 5.40、pABA添加量42.0 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、溫度35.40 ℃，在此條件下KLDS4.0325的葉酸產(chǎn)量（0.814 μg/mL）比優(yōu)化前（0.260 μg/mL）提高了3.13 倍。