基于16S rRNA技術(shù)分析α-乳白蛋白對 大鼠腸道菌群的影響

李夢寒，王志勇，盛 雪，崔東影，席恩澤，湯夢琪，張惠愷，許曉曦,，馬春麗,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院，黑龍江 哈爾濱 150088）

嬰兒時期腸道菌群尚未完善，免疫系統(tǒng)不夠成熟，腸道、呼吸道等極易被感染。母乳或嬰兒配方奶粉作為嬰兒首先攝入的食物，對嬰兒的健康產(chǎn)生重要影響[1]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)的嬰兒患哮喘、肥胖癥、兒童期白血病、嬰兒猝死綜合征和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病的患病風險偏低[2]，這是因為母乳中含有豐富的生物活性物質(zhì)有助于嬰兒腸道菌群的良好穩(wěn)態(tài)及免疫系統(tǒng)的發(fā)育，如 α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、母乳低聚糖、分泌的抗體、乳鐵蛋白等。

α-LA是母乳中的生物活性蛋白之一，占總蛋白質(zhì)的20%～25%，在成熟母乳中的質(zhì)量濃度為（2.44±0.64）g/L[3]。 它能為嬰兒提供豐富的必需氨基酸，如色氨酸和半胱氨酸[4]，并促進礦物質(zhì)吸收[5]；參與乳糖合成以促進乳的分泌[6]；其熔球狀態(tài)能抗病毒感染并促進癌細胞凋亡[6]。在α-LA消化過程中，會生成各種生物活性肽，其中一些生物活性肽具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抑制血壓升高等 活性[7]，更重要的是，已有報道表明在α-LA體外消化過程中產(chǎn)生抗菌肽和刺激雙歧桿菌生長的肽鏈，它們很有可能作用于腸道細菌并調(diào)整腸道菌群保持動態(tài)平衡，從而進一步影響嬰兒的免疫系統(tǒng)與生長發(fā)育[8]。因為腸道菌群的紊亂不但與哮喘、濕疹、小兒肥胖、壞死性小腸結(jié)腸炎等嬰幼兒疾病相關(guān)[9]，還有可能影響成年后炎性腸病、腸易激綜合征、心血管疾病[10]、精神疾病[11]、I型糖尿病，甚至是癌癥的發(fā)病風險[12]。

嬰兒配方奶粉是在牛乳的基礎(chǔ)上，調(diào)整和強化蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)素加工而成的，并且在設(shè)計上要盡可能接近母乳[13]。牛乳和母乳中乳清蛋白的構(gòu)成不同，母乳中的乳清蛋白以α-LA為主，而牛乳中以β-乳球蛋白為主，并且這種蛋白不存在于母乳中。這就導致嬰兒配方奶粉中添加了母乳中不存在的β-乳球蛋白，而主要的α-LA相對缺乏[14]。α-LA作為母乳中重要的免疫蛋白，除了能為嬰兒提供必需氨基酸等各種營養(yǎng)物質(zhì)外，還可能具有調(diào)整腸道菌群的作用，可幫助腸道有益菌快速穩(wěn)定地定植在嬰兒腸道中，減少有害菌的黏附繁殖，它們的定植有助于嬰幼兒先天免疫系統(tǒng)的形成。所以，在嬰兒配方奶粉中補充α-LA對于嬰兒的生長發(fā)育意義重大。然而，添加過少的α-LA可能不能對嬰兒的腸道菌群起到調(diào)整的作用，添加過多的蛋白質(zhì)則會增加嬰兒的氮負荷，造成腎臟負擔[15]。因此，探究α-LA在嬰兒配方奶粉中的適宜添加量，在保證其最大程度的發(fā)揮生物活性的同時減少用量，意義十分重大。

在前期體外實驗中，探究不同添加量的α-LA對腸道益生菌和有害菌的增殖或抑制作用，以此為基礎(chǔ)，參考母乳中α-LA添加量，本實驗再次篩選出高添加量α-LA（200 mg/kg）、中添加量α-LA（100 mg/kg）、低添加量α-LA（20 mg/kg）3 個劑量，以SD大鼠為動物模型，采用16S rRNA測序技術(shù)探討α-LA對腸道菌群多樣性及物種組成的影響，重點分析不同添加量α-LA對腸道益生菌、潛在有害菌的促進或抑制作用，從而選擇出調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群的最佳添加量，為進一步的嬰兒喂養(yǎng)實驗提供研究基礎(chǔ)，最終為嬰兒配方奶粉中α-LA科學的添加量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物

α-LA（WPC-8800） 美國Hilmar Ingredients公司。

實驗選用4 周齡清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量150 g左右，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司。許可證號：SPF級 90～110 g SCXK（京）2016-0026。飼養(yǎng)期間給予自由采食和飲水。維持室內(nèi)溫度（23±2）℃、相對濕度40%～70%、12 h晝夜循環(huán)采光。飼養(yǎng)大鼠所用的鼠籠、飲用水瓶等用具均用稀釋后的84消毒液浸泡30 min后，用自來水清洗干凈、自然晾干。飲用水經(jīng)高壓滅菌后自然降至室溫供大鼠飲用。墊料每隔3～4 d更換一次，其他操作嚴格遵守鼠房規(guī)范。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BPG-9070A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限 公司；BSA224S分析天平 德國Sartorius公司；MX-S可調(diào)式混勻儀 美國Scilogex公司；VD-1320型無菌操 作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；DW-86L490J型 -80 ℃超低溫冰箱 青島海爾集團。

1.3 方法

1.3.1 分組及取樣

大鼠適應(yīng)3 d后正式開始實驗，40 只大鼠隨機分為4 組，對照組（A組）、高添加量組（B組）、中添加量組（C組）、低添加量組（D組），每組各10 只大鼠。A、B、C、D四組大鼠分別灌喂0.5 mL的生理鹽水，200、100、20 mg/kg的α-LA。每天灌喂時間固定，灌喂持續(xù)整個實驗周期28 d。

分別于實驗的第14、28天每組隨機選取3 只大鼠，心臟取血。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)解剖，使用75%的乙醇溶液擦拭大鼠腹部，消毒后的手術(shù)剪打開大鼠腹腔將腸道完整分離出來，在結(jié)腸末端取1～2 顆大鼠糞便保存于滅菌后的EP管中，液氮速凍后在-80 ℃冰箱保存。樣本分組情況如表1所示。

表 1 樣品分組表Table 1 Grouping of experimental rats

1.3.2 大鼠腸道菌群分析

1.3.2.1 大鼠糞便測序?qū)嶒炦^程

大鼠糞便樣品從-80 ℃冰箱取出后立刻放入干冰內(nèi)寄送到北京奧維森基因科技有限公司，然后進行如下測序?qū)嶒炦^程：首先用糞便組基因DNA提取試劑盒提取大鼠糞便DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增。選擇擴增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域，合成帶有錯位堿基的融合引物。同時保證樣本的擴增循環(huán)數(shù)一致，使絕大多數(shù)樣本能夠擴增出濃度合適的產(chǎn)物。混合同一樣本的3 份PCR產(chǎn)物后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。使用酶標儀對PCR產(chǎn)物檢測定量，并進行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建MiSeq PE文庫后采用Illumina Miseq PE 300平臺進行高通量測序。

1.3.2.2 生物學信息分析

Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，下機數(shù)據(jù)PE reads去除barcode和primer拼接后得到raw tags，raw tags經(jīng)進一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列clean tags。在0.97相似度下利用qiime（v1.8.0）軟件進行可分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋。將OTU代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫比對，得到每個樣本的物種分類信息，并在各個水平上注釋。一方面，基于聚類結(jié)果，進行α多樣性分析和β多樣性分析；另一方面，基于注釋結(jié)果，可以得到各水平的物種組成信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

α多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)使用Statistix 8進行顯著性分析后用OriginPro 8.5.1軟件作圖，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腸道菌群多樣性分析

2.1.1 α多樣性分析

在微生物擴增子測序中，α多樣性分析了樣品中兩個因素，豐富度（物種類別的多樣性）和均勻度（物種組成多少的整體分布）[16]，本實驗以稀釋性曲線、物種數(shù)目飽和度曲線、α多樣性指數(shù)3 個角度評估α多樣性。

稀釋性曲線是基于OTU聚類結(jié)果利用mothur做稀釋性分析，利用R語言工具制作的曲線圖。它可以用來評估樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理，也可以用來比較不同樣本的物種豐富度[17]。由圖1可知，大鼠腸道菌群的稀釋曲線隨樣品序列數(shù)目增加趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，測序結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。在測序深度相同的情況下，B4、B6、C5、B5、C4的豐富度明顯高于其他樣品，說明第28天時高添加量組、中添加量組提高了大鼠菌群的豐富度。

物種數(shù)目飽和度曲線也是分析樣本中微生物多樣性的一種方法，它可以從物種豐富度和物種均勻度兩個方面解釋多樣性[18]。由圖2可知，24 個樣品的曲線趨勢相似。在水平方向上，各樣品曲線寬度反映豐富度，曲線在橫軸上的范圍較大，體現(xiàn)出不同樣品的物種豐度可能有較大差異，其中B4、B5豐富度最高，A2、A3豐富度最低。另一方面，曲線形狀反映了樣本中物種的均勻度，圖中各個樣品曲線平滑程度較好，僅末端有部分曲折，整體趨勢平緩，說明物種分布均勻。

圖 1 基于OTU總數(shù)的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves

圖 2 基于OTU總數(shù)的物種數(shù)目飽和度曲線Fig. 2 Rank abundance curves

α多樣性指數(shù)包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)，通過單樣品的多樣性分析可以反映微生物群落的豐富度和均勻度。本實驗采用Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)評估各樣本的α多樣性，進而分析各實驗組的多樣性。Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)評價物種豐富度，數(shù)值越大豐富度越高；Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)均可基于豐富度和均勻度兩個方面評價多樣性，數(shù)值越大說明該環(huán)境的物種越豐富，同時各物種分配越均勻。

圖 3 基于OTU總數(shù)的α多樣性指數(shù)圖Fig. 3 α-Diversity indexes based on the total number of OTUs

由圖3可知，Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、PD whole tree指數(shù)變化趨勢相似。在大鼠飼喂第14天時，各多樣性指數(shù)柱形圖幾乎持平，不同添加量的蛋白對提高大鼠糞便菌群α多樣性效果不顯著 （P＞0.05）；飼喂第28天時，高添加量組、中添加量組各多樣性指數(shù)均高于對照組，在Shannon指數(shù)中，高添加量組多樣性顯著高于對照組（P＜0.05）。低添加量組多樣性與對照組無顯著差異（P＞0.05）。說明第14天時各蛋白濃度組不能提高菌群多樣性，第28天時高添加量、中添加量蛋白發(fā)揮出生物活性，顯著提高了大鼠腸道菌群的豐富度和均勻度。

2.1.2 β多樣性分析

β多樣性主要分析了樣本與樣本間微生物群落組成的相似性[19]。NMDS法是評估β多樣性的方式之一，它以點的形式將樣本包含的物種信息反映在多維空間上，通過點與點之間的距離體現(xiàn)樣本間的差異程度[20]。由圖4可以看出，在大鼠飼養(yǎng)第14天時，每組內(nèi)各個樣品點分布區(qū)域比較密集，樣品個體差異性較小，每組內(nèi)3 個樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似，平行度較好。AA、BA、CA、DA各組形成的圓圈兩兩均有交集，說明組間差異性較小，此時不同添加量的α-LA對腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。飼養(yǎng)第28天時，AB、DB兩組所形成的圓圈面積小，樣品平行度好，BB組、CB組稍差，這可能與大鼠的個體差異相關(guān)。第28天時各組的圓圈交集較少，群落組成出現(xiàn)差距，此時α-LA發(fā)揮出了生物活性，對腸道菌群群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使實驗組與對照組區(qū)分顯著。

圖 4 大鼠腸道菌群NMDS分析圖Fig. 4 NMDS analysis of rat intestinal flora

綜合α多樣性和β多樣性分析可知，本實驗測序量足夠大，結(jié)果可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。在大鼠飼喂第14天時，各組AA、BA、CA、DA在豐富度、均勻度、群落結(jié)構(gòu)上均無顯著差異，此時各蛋白添加量組并未完全發(fā)揮生物活性；在飼喂第28天時，BB （P＜0.05）、CB（P＞0.05）組的多樣性明顯提高，群落結(jié)構(gòu)與對照組AA組相比差距很大，此時α-LA完全發(fā)揮出了生物活性，它對于腸道菌群的調(diào)整是一個溫和的漸進過程。王瑞[21]分析了不同月齡嬰幼兒腸道菌群OTU數(shù)量及α多樣性。D1W為0～6 月齡嬰兒樣品；D2W為6～12 月齡較大嬰兒樣品；D3W為12～36 月齡幼兒樣品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D1W樣品OTU數(shù)量和豐富度均顯著低于D2W、D3W（P＜0.05），而D2W、D3W的Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。由此可推測6～12 月是嬰兒腸道菌群繁衍的關(guān)鍵時期，在此時期長時間補充高添加量α-LA、中添加量α-LA可更好的提高嬰兒腸道菌群多樣性，調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，促進更多種類的益生菌在腸道內(nèi)定植繁衍，減少腸道有害菌的黏附占位，使嬰兒腸道菌群健康發(fā)展。

2.2 物種組成分析

2.2.1 基于門分類水平的分析

經(jīng)物種組成分析可得知一個或多個樣本在各分類水平上的分類學比對情況。采用統(tǒng)計學的分析方法，能觀測樣本在門、綱、目、科、屬5 個水平的群落結(jié)構(gòu)[16]。本實驗重點分析了門水平和屬水平。

探究不同添加量的α-LA對門水平上腸道菌群組成的影響，結(jié)合圖5可知，各組樣本生成的OTU主要由5 個門構(gòu)成：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia），其中厚壁菌門和擬桿菌門占絕對主導地位。此外，由圖6可以看出，其他相對豐度較高的門還有柔膜菌門（Tenericutes）、藍菌門（Cyanobacteria）等。第28天時BB、CB組出現(xiàn)了浮霉菌門（Planctomycetes）、綠 灣 菌 門（ C h i o r o f l e x i ） 、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、醋酐菌門（Acidobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）等新菌門，說明高添加量α-LA和中添加量α-LA在第28天時有效提高了大鼠腸道菌群的多樣性，與上述α多樣性分析相符合。

圖 5 大鼠腸道菌群門水平物種組成分析柱狀圖Fig. 5 Analysis of intestinal flora composition at the phylum level

補充不同添加量的α-LA會影響大鼠門水平上腸道菌群組成，且隨時間變化，如圖6所示：第14天時，相比于對照組，各添加量蛋白組提高了放線菌門的相對豐度，蛋白添加量由高到低分別提高0.49%、0.49%、1.44%；BA組降低了厚壁菌門豐度并提高擬桿菌門相對豐度，CA、DA組對厚壁菌門、擬桿菌門整體影響不大。第28天時，隨α-LA添加量提高，厚壁菌門相對豐度不斷提高，同時擬桿菌門、變形菌門相對豐度不斷下降。高添加量BB組、中添加量CB組、低添加量DB組分別使擬桿菌門下降9.49%、20.61%、27.88%，使變形菌門分別下降0.9%、1.8%、2.08%，使厚壁菌門分別提高5.46%、18.97%、25.88%。不同蛋白添加量組對放線菌門相對豐度均有不同水平的提高，對疣微菌門影響不顯著。拉姆卓嘎[22]探究了嬰兒在不同喂養(yǎng)方式下對腸道菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群呈動態(tài)變化：從出生后的14 d～4 個月這段期間，厚壁菌門相對豐度從33.3%增至53.4%；變形菌門從53.4%下降至17.5%，放線菌門從8.6%增至27.3%。這個趨勢與大鼠腸道菌群在28 d時的變化十分相似，由此可以推測，母乳中的α-LA對腸道菌群門水平的影響十分顯著。

圖 6 大鼠腸道菌群門水平熱圖Fig. 6 Heatmap of the intestinal flora at the phylum level

2.2.2 基于屬分類水平的分析

圖 7 大鼠腸道菌群屬水平熱圖Fig. 7 Heatmap of the intestinal flora at the genus level

由圖7可知，乳桿菌（Lactobacillus）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的未知屬Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1、阿克曼氏菌（Akkermansia）、木質(zhì)真菌（Eubacterium xylanophilumgroup）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）下的未知屬Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia、布勞特氏菌（Blautia）、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1、普氏菌科（Prevotellaceae）下的未知屬（Prevotella_9、Prevotella_1、Prevotellaceae_UCG-001）、擬桿菌（Bacteroides）等為大鼠腸道中相對豐度較高的菌屬。比較第14天與第28天時的熱圖發(fā)現(xiàn)，第14天時各樣本微生物主要分布在特定的幾種屬上，其余屬分布豐度較低，而第28天時大量屬的豐度均有提高，樣本分布均勻度提高，這再次印證了上述α多樣性分析。

由圖8可知，灌喂α-LA會影響大鼠腸道菌群屬水平上的組成。實驗結(jié)果顯示，第28天時中添加量、低添加量蛋白使乳桿菌相對豐度分別提高9.89%、26.29%，而高添加量蛋白使其豐度下降3.29%。乳桿菌是一種優(yōu)質(zhì)的益生菌，已有大量文獻資料表明其促進腸上皮細胞增殖、參與調(diào)解結(jié)腸粘液層、重塑黏蛋白糖基化等功能[23]。第28天時蛋白添加量由高到低分別使木質(zhì)真菌相對豐度提高0.31%、0.18%、0.45%；高添加量蛋白降低布勞特氏菌的相對豐度，而中、低添加量蛋白維持或提高其相對豐度；各蛋白添加量組均能維持毛螺旋菌科成員Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia以及梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1相對豐度保持恒定。毛螺旋菌科能將復雜的多糖降解為乙酸、丁酸和丙酸[24]，布勞特氏菌是醋酸鹽生產(chǎn)者、木質(zhì)真菌、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1是丁酸鹽生 產(chǎn)者[25]，這些短鏈脂肪酸被胃腸道中的上皮細胞迅速吸收，參與細胞的調(diào)節(jié)過程，如基因表達、趨化性、分化、增殖和凋亡[26]。此外，短鏈脂肪酸還能影響細胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[27]。第14天時高添加量蛋白降低阿克曼氏菌的相對豐度，中、低添加量蛋白對其有一定的促進作用。對于瘤胃球菌科成員Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1，各蛋白組有維持其相對豐度的趨勢。阿克曼氏菌是新興的益生菌，具有改善糖尿病大鼠的肝功能、減少糖毒性和脂毒性、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥、恢復正常的腸道菌群等功能[28]。瘤胃球菌科成員可抑制霍亂弧菌感染，移植到發(fā)育不良的小鼠體內(nèi)可改善其生長和代謝異常[29]。阿克曼氏菌和瘤胃球菌科在長壽老人糞菌中相對豐度均較高，可能成為長壽信號之一[30]。

圖 8 大鼠腸道菌群屬水平物種組成分析柱狀圖Fig. 8 Analysis of intestinal flora composition at the genus level

此外，α-LA可降低普氏菌科成員相對豐度，蛋白添加量由高到低分別使普氏菌科下的未知菌屬Prevotella_9豐度下降2.01%、2.26%、2.3%；使普氏菌科下的未知菌屬Prevotellaceae_UCG-001相對豐度下降3.89%、3.97%、4.26%。普氏菌科豐度會在早期類風濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)增加，并被證明參與了關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制[31]；由于它是負責支鏈氨基酸生物合成和胰島素抵抗的主要物種，因此也與缺血性心血管疾病和2型糖尿病的風險相關(guān)[32]。α-LA呈濃度依賴的趨勢降低了擬桿菌屬相對豐度，蛋白添加量由高到低分別使其豐度分別下降3.33%、4.78%、6.68%。研究表明，擬桿菌屬的細胞表面脂蛋白BtuG2與VB12的親和度高于內(nèi)源因子，因此其豐度提高可能導致VB12缺乏[33]；該物種與多種疾病相關(guān)，包括結(jié)腸直腸癌、肝病的發(fā)病風險[34]。除此之外，α-LA對大腸桿菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）體現(xiàn)出極強的抑制作用，中添加量蛋白組抑制效果最好，將其相對豐度由1.90%降至0.01%。

嬰兒腸道菌群的定植是一個連續(xù)而復雜的動態(tài)過程。有研究報道，嬰兒期是腸道菌群定植的最佳時期，到1 歲時腸道內(nèi)微生物接近于成人，屬于相對成熟及穩(wěn)定期[35]。不同喂養(yǎng)方式對嬰兒腸道菌群的影響產(chǎn)生較大差異，母乳喂養(yǎng)能提高嬰兒腸道中雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）、韋榮球菌科（Veronococcidae）、毛螺旋菌科、永榮氏球菌屬（Veillonella）等腸道益生菌的相對豐度，同時降低大腸桿菌-志賀菌屬、克雷白桿菌屬（Klebsiella）等腸道有害菌的相對豐度[36]。母乳喂養(yǎng)兒腸道優(yōu)勢益生菌的維持時間長，促進了菌群穩(wěn)態(tài)的建立。

在本實驗中，不同添加量的α-LA起到了與母乳相似的作用，它同樣促進腸道優(yōu)勢益生菌的繁殖，并抑制腸道有害菌的生長。從益生菌的角度分析，中、低蛋白組提高了益生菌乳桿菌、布魯克士菌、阿克曼士菌相對豐度，而高添加量蛋白組作用相反；高、中、低蛋白組均能提高木質(zhì)真菌并維持瘤胃球菌科成員、毛螺旋菌科成員、梭菌科下的未知屬Clostridium sensu stricto_1相對豐度保持恒定。從有害菌角度分析，α-LA使普氏菌科成員、擬桿菌屬相對豐度有不同程度的降低，作用效果隨濃度降低而提高；對有害菌大腸桿菌-志賀菌屬體現(xiàn)出極強的抑制作用，中添加量組抑制效果最好，將其相對豐度由1.90%降至0.01%。由此可知，不同添加量的α-LA均能維持或促進腸道益生菌繁殖，中、低添加量蛋白效果更好；對腸道中潛在有害菌起到抑制作用，高、中添加量蛋白效果更好。

3 結(jié) 論

經(jīng)實驗探究，中添加量α-LA（100 mg/kg）為調(diào)節(jié)腸道菌群的最佳添加量，主要實驗結(jié)論如下：1）第14天時不同添加量的α-LA對大鼠腸道菌群的多樣性無明顯影響，第28天時高添加量蛋白組、中添加量蛋白組在提高物種多樣性的同時兼顧了均勻性。第14天時各濃度組聚集成團，交叉區(qū)域范圍廣，區(qū)分不明顯；第28天時各組圓圈交集較少，實驗組與對照組區(qū)分顯著，蛋白對群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。大鼠腸道菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主，各濃度蛋白組對于門水平的調(diào)節(jié)與母乳相似。中、低蛋白組能提高乳桿菌、布勞特氏菌、阿克曼氏菌的相對豐度；各濃度組均能使普氏菌科成員、擬桿菌相對豐度有不同程度的降低，作用效果隨濃度降低而提高；各濃度組均能提高木質(zhì)真菌相對豐度并維持瘤胃球菌科成員、毛螺旋菌科成員、梭菌科下的未知屬相對豐度保持恒定。2）中添加量α-LA能在提高菌群多樣性的同時溫和的提高益生菌相對豐度，降低潛在有害菌的相對豐度，有利于長期維持腸道的健康。本實驗結(jié)果可為嬰兒喂養(yǎng)實驗提供參考值，最終為嬰兒配方奶粉中α-LA科學的添加量提供理論支持。