解淀粉芽孢桿菌mtnN基因對其生物合成 S-腺苷甲硫氨酸的影響

阮麗英，溫志友，魏雪團,

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.愛荷華州立大學食品科學與人類營養系，美國 愛荷華州 埃姆斯 50013）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）是廣泛存在于生物體內的一種重要的生物活性物質，參與轉甲基、轉硫和轉氨丙基等多種類型的生化反應[1-2]，從而影響體內核酸、蛋白質和磷脂等物質的合成與代謝[3-4]。 SAM顯著影響細胞代謝活動，充足的SAM是維持機體正常運轉的重要保證，缺乏SAM會出現一系列不良癥狀[5-6]。 研究表明，SAM對肝病、關節炎及抑郁癥等疾病具有良好的預防和治療效果[7-11]。因此，開發SAM相關的功能食品和藥品具有重要的價值。

SAM可通過微生物發酵生產，由微生物體內的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L-甲硫氨酸和ATP合成[12]。 目前S A M 的研究主要集中在酵母菌、大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌，多通過強化微生物表達S-腺苷甲硫氨酸合成酶，進而將更多的L-甲硫氨酸轉化為SAM[13-14]。如He Junyun等[15]在畢赤酵母中強化表達外源S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因SAM2，并敲除SAM分支途徑中的β-胱硫醚合成酶基因，經發酵條件優化后，工程菌在5 L發酵罐中SAM產量高達13.5 g/L。然而，以甲硫氨酸為底物成本較高，且甲硫氨酸轉化率較低（15%～42%），導致SAM價格高[16-17]。有研究者通過葡萄糖或天冬氨酸為原料合成SAM。如Chen Yawei等[18]以葡萄糖為底物從頭合成SAM，通過調控ATP和NADPH強化了E. coli合成SAM的能力，然而目前的產量不足10 mg/L； Han Guoqiang等[19]敲除了谷氨酸棒桿菌SAM支鏈途徑和抑制因子基因（mcbR、thrB和Ncgl2640），強化表達了血紅蛋白基因和甲硫氨酸合成酶基因，以葡萄糖為底物，SAM產量達到196.7 mg/L。總體而言發酵產量較低，有待進一步提高。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有食用安全、生長快速、易于培養等優點，目前已廣泛應用于食品、醫藥、化妝品和農業領域[20-21]。近年來，隨著芽孢桿菌系統生物學和基因操作工具的發展，極大推動了芽孢桿菌代謝工程的發展[22-23]。KEGG數據庫顯示，B. amyloliquefaciens中存在完整的SAM代謝途徑，然而還鮮見通過B. amyloliquefaciens發酵生產SAM的報道。在B. amyloliquefaciens中，基因mtnN編碼S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteine nucleosidase，SAHN，EC 3.2.2.9），如圖1所示，該酶既可以參加SAM循環途徑，又可以參加甲硫氨酸循環途徑，這兩個循環途徑都消耗SAM[24]。因此，提出假設：阻斷或降低mtnN基因的表達可同時抑制SAM循環途徑和甲硫氨酸循環途徑，從而促進SAM的積累。為驗證這個假設，本研究通過基因敲除技術和反義RNA抑制技術構建系列工程菌株，考察mtnN基因對B. amyloliquefaciens合成SAM的影響，闡釋了mtnN基因對SAM合成的影響規律，為SAM高產菌株的代謝工程育種提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本研究所用到的菌株和質粒如表1、2所示。其中 E. coli DH5α用于構建載體。

1.1.2 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物

本研究所用的主要引物見表3，引物合成和質粒測序由武漢擎科創新生物科技有限公司和北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

表 3 實驗所用PCR引物Table 3 Sequences of primers used for PCR in this study

1.1.3 培養基

Luria-Bertani（LB）培養基：蛋白胨10.0 g/L，酵母浸出粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.2～7.4，固體培養基加瓊脂1.5%。

B. amyloliquefaciens電轉化感受態制備所用生長培養基：LB培養基中添加0.5 mol/L山梨醇；洗滌培養基：0.5 mol/L甘露醇，0.5 mol/L山梨醇，10%（體積分數）甘油；恢復培養基：LB培養基中含有0.5 mol/L山梨醇，0.38 mol/L甘露醇。

SAM發酵培養基：蔗糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿5 g/L，天冬氨酸3 g/L，尿素2 g/L，(NH4)2SO46.3 g/L， NaCl 2.5 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 4.2 g/L，pH 6.5～6.7。

1.1.4 工具酶和試劑

Trans Start?FastPfu DNA聚合酶、Trans Start?easy Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；dNTPS、DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DL5000 Marker 日本TaKaRa公司；瓊脂糖 西班牙Spanish公司；DNA抽提試劑盒 武漢楚誠正茂科技工程有限公司；DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒 美國Omega BioTek公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、四環素（tetracycline，Tet）、溶菌酶、山梨醇、甘露醇（Biosharp進口分裝） 武漢楚誠正茂科技工程有限公司； 甲醇為色譜級，其他均為國產分析級純或進口分裝。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Alpha Imager EP凝膠成像系統 美國Alpha Innotech公司；AR5120通用型精密天平 美國奧豪斯公司；CR21G高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；H Q L 3 0 0 B 恒溫大幅振蕩搖床 武漢中科科儀技術發展有限責任公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司； MLS-3750高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；QL-861渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Research?固定量程移液器 德國艾本德股份公司；SKP-02.420電熱恒溫培養箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀 美國Bio-Rad公司；722型分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；DELTA 320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分子水平操作

E. coli質粒的小量抽提：美國Omega BioTek公司的質粒提取試劑盒，參照說明書中提取步驟。

PCR擴增：所用引物見表3，依次加入常規PCR體系（表4）各成分，混勻后進行擴增反應。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃延伸5 min；12 ℃保持5 min。其中，退火溫度依據引物的Tm值，延伸時間依據基因片段大小和聚合酶擴增效率。

表 4 常規PCR體系Table 4 Reaction system of conventional PCR

SOE-PCR依次加入各成分（表5），混勻后進行擴增反應。SOE-PCR程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，先運行8 個循環，后運行：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環，72 ℃延伸5 min，12 ℃保持5 min。其中，退火溫度依據引物的Tm值，延伸時間依據基因片段大小。

表 5 SOE-PCR體系Table 5 Reaction system of SOE-PCR

DNA的純化及回收：按照純化及膠回收試劑盒（美國Omega BioTek公司）說明書上的步驟純化回收DNA。

1.3.2 mtnN基因缺失菌株的構建

重組載體的構建：選取m t n N 基因上下游序列約500 bp為同源臂片段，設計上游同源臂片段引物（ΔmtnN-AF和ΔmtnN-AR）和下游同源臂片段引物（ΔmtnN-BF和ΔmtnN-BR）。以B. amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，分別擴增得到上下游同源臂片段，產物純化回收后作為兩段同源臂SOE-PCR的模板，用引物ΔmtnN-AF和ΔmtnN-BR進行擴增，產物純化回收后與敲除載體T2(2)-ori同時用BamHI和XbaI進行雙酶切，產物回收后用T4連接酶4 ℃連接過夜，連接產物轉化至E. coli DH5α感受態細胞，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，確定為陽性克隆后，提取質粒測序，構建成功的敲除載體為T2(2)-oriΔmtnN。

感受態的制備：B. amyloliquefaciensHZ-12平板劃線，挑取適量菌體接種于5 mL液體LB培養基，37 ℃、180 r/min培養8 h；培養物轉接于50 mL生長培養基中，37 ℃、250 r/min培養3 h，使OD600nm達1.5～2.5；將培養液倒入無菌的50 mL離心管中，置冰上預冷10 min，6 500 r/min離心5 min收集菌體；用20 mL預冷的洗滌培養基洗滌菌體3～4 次，6 500 r/min離心5 min，棄上清液，將菌體重懸于800 μL洗滌培養基中，每100 μL分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存備用。

電轉化：將5～10 μL質粒DNA（50 ng/μL）加入B. amyloliquefaciensHZ-12感受態細胞，輕柔混勻后轉移到預冷的2 mm電轉化杯中，冰浴10 min后，電脈沖轉化儀2.4 kV電擊一次，迅速加入800 μL恢復培養基，于37 ℃、100 r/min恢復培養3 h，涂布于含Kan抗生素平板，37 ℃靜置培養16～18 h。挑取轉化子單菌落劃線于Kan抗性平板，培養10～12 h后進行菌落PCR驗證。

單交換菌株的篩選及驗證：驗證正確的陽性轉化子接種于含Kan抗生素的LB液體培養基中，45 ℃、 180 r/min培養12 h；培養物稀釋10-6倍涂布Kan抗性平板，45 ℃恒溫培養箱中靜置培養；挑單菌落劃線于Kan抗性平板，45 ℃培養10 h左右，用驗證引物和T2引物進行菌落PCR驗證。

雙交換菌株的篩選及驗證：獲得的單交換菌株在5 mL LB液體培養基中連續傳代，每代12 h，每次取100 μL前一代培養物接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養；將最后一代培養物稀釋105～106倍，涂布LB平板；對其上長出的單菌落分別對應點種于LB平板和含Kan的LB平板上；選取在LB平板生長而在含Kan的平板不生長的單菌落進行PCR驗證，篩選雙交換菌株。

1.3.3 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構建

重組載體的構建：通過引物m t n N a s R N A-F 和mtnNasRNA-1-R，以互補于目標基因的5’端不翻譯序列和目標基因編碼區的序列為模板進行擴增，通過NcoI和XhoI對具有反義RNA序列的pUC19-asRNA質粒和PCR得到的目的片段asRNA分別進行雙酶切，然后將酶切后的質粒和片段連接進行轉化，得到含有目的片段asRNA的質粒pUC19-mtnNasRNA。通過引物P43-F和mtnNasRNAP43-R擴增P43啟動子，通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R（質粒本身含有的終止子下游引物），以質粒pUC19-mtnNasRNA為模板進行擴增，PCR產物回收純化后，以引物P43-F和rrnB-R進行SOE-PCR，用BamHI和XbaI對得到的片段進行雙酶切，回收純化后與同樣經過雙酶切純化后的穿梭質粒pHY300進行酶連，轉化后得到質粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物P43-F和mtnNasRNA-P43-R擴增P43啟動子，通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R（mtnNasRNA-3-R），以質粒pHY-mtnNasRNA-1為模板進行擴增，產物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質粒同時用限制性內切酶NcoI和XhoI進行雙酶切，產物回收后進行酶連，轉化后得到質粒pHY-mtnNasRNA-2（pHYmtnNasRNA-3），所用的引物如表3所示。

電轉化：按1.3.2節方法制備B. amyloliquefaciensHZ-12的感受態細胞，將抽提得到的表達質粒pHYmtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3以及空載體pHY300PLK分別電轉化感受態細胞，涂布Tet抗性平板，37 ℃培養12～16 h得到轉化子，取一定數量的轉化子分別進行菌落PCR驗證，引物用pHY300-F和pHY300-R。

1.3.4 發酵培養條件

從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養基中，37 ℃培養基12 h。挑取適量菌體于裝有50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min培養9 h（反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌種子培養基中加 8 μg/mL Tet抗生素）。吸取1.5%菌液接種于裝有25 mL發酵培養基的250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min發酵培養60 h，每個菌設置3 個搖瓶重復。

1.3.5 SAM的高效液相色譜檢測

取發酵液0.5 mL，加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸提取1 h（每15 min振蕩一次），10 000 r/min離心5 min。取800 μL上清液，加100 μL 2 mol/L NaOH溶液調pH值。利用高效液相色譜檢測，色譜柱為XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測器為紫外檢測器，流動相為甲醇與40 mmol/L NH4H2PO2-2 mmol/L庚烷磺酸鈉（18∶82，V/V），流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm。

1.4 數據處理

每組實驗設計3 個重復，采用SPSS 20.0進行數據統計分析，評估數據差異的顯著性，計算±s，采用 Origin 8.5進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 mtnN基因缺失對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

2.1.1 mtnN基因缺失菌株的構建

利用1.3.2節方法構建重組載體T2(2)-oriΔmtnN，利用表3中相應的引物擴增構建T2(2)-oriΔmtnN的上下游同源臂，上下游同源臂大小分別為776 bp和784 bp，二者經SOE-PCR融合后的產物大小為1 560 bp，上下游同源臂SOE-PCR融合片段與T2(2)-ori質粒經酶切和酶連后轉化至E. coli DH5α，選取驗證正確的陽性轉化子，抽提質粒并用BamHI和XbaI酶切質粒，電泳檢測結果如圖2所示，重組質粒酶切片段大小與預期相符合，構建好的敲除質粒測序結果顯示正確，表明敲除質粒T2(2)-oriΔmtnN構建成功。

圖 2 重組質粒T2(2)-oriΔmtnN雙酶切驗證Fig. 2 Identification of recombinant plasmid T2(2)-oriΔmtnN by double enzymatic digestion

將已構建完成的重組質粒T2(2)-oriΔmtnN電轉化至B. amyloliquefaciensHZ-12中，篩選出陽性轉化子，并按照1.3.2節的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經菌落PCR驗證正確的雙交換菌株，抽提其基因組DNA，并用ΔmtnN-YF和ΔmtnN-YR分別驗證陽性交換突變株和原始菌株B. amyloliquefaciensHZ-12，片段大小分別為1 965、2 681 bp，PCR驗證電泳圖如圖3所示，回收陽性交換突變株PCR產物經測序確認堿基正確無誤。將構建成功的缺失mtnN基因的菌株命名為HZ-12ΔmtnN。

圖 3 HZ-12ΔmtnN菌株的PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of PCR-amplified products from strain HZ-12ΔmtnN

2.1.2 mtnN基因缺失對SAM含量的影響

為考察mtnN基因的缺失對B. amyloliquefaciens HZ-12合成SAM的影響，按照1.1.3節和1.3.4節發酵培養基和培養條件對工程菌株HZ-12ΔmtnN進行發酵驗證，發酵周期60 h。發酵結束后取樣檢測SAM產量和菌體生物量（OD600nm），結果如圖4所示。

圖 4 缺失mtnN基因對SAM產量及菌體生物量的影響Fig. 4 Effect of mtnN knockout on SAM yield and biomass

由圖4可以看出，工程菌HZ-12ΔmtnN的生物量相比于原始菌HZ12降低了26%，說明SAHN對菌體的生長有一定的作用，缺失后菌體的生長變緩。此外，工程菌 HZ-12ΔmtnN的SAM產量僅有4.54 mg/L，與原始菌HZ12相比降低了51%，這可能與菌體生長受阻有關。

2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對解淀粉芽孢桿菌SAM的影響

2.2.1 反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌的構建

為在不影響菌體生長繁殖的條件下，探索SAHN對B.amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響。利用反義RNA技術抑制mtnN基因的表達，考察抑制SAHN對B. amyloliquefaciensHZ-12 SAM合成的影響。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標基因5’端不翻譯區域結合位置有關，因此在mtnN基因5’端不翻譯區域選擇了不同的結合區域，結合長度分別為100、77 bp和144 bp，而基因編碼區域選擇的結合長度為100 bp。利用1.3.3節方法構建重組載體pHY-mtnNasRNA-1、pHYmtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3。以B. subtilis 168的基因組為模板，根據表3引物通過PCR擴增啟動子P43，大小為305 bp，通過引物mtnNasRNA-F和rrnB-R，以質粒pUC19-mtnNasRNA為模板擴增目的片段和rrnB終止子，大小分別為200、250 bp，經SOE-PCR融合后的產物大小為755 bp，SOE-PCR融合片段與質粒pHY300經酶切和酶連后轉化至E. coli DH5α，轉化后得到質粒pHYmtnNasRNA-1。通過引物mtnNasRNA-F和mtnNasRNA-2-R （mtnNasRNA-3-R），以質粒pHY-mtnNasRNA-1為模板擴增，大小分別為177、244 bp，產物回收純化后與pHY-mtnNasRNA-1質粒經酶切和酶連后轉化至 E. coli DH5α。選取驗證正確的陽性轉化子，抽提質粒并用BamHI和XbaI酶切質粒，電泳檢測結果如圖5所示，重組質粒酶切片段大小與預期相符合，構建好的質粒測序結果顯示正確，表明pHY-mtnNasRNA-1、 pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3質粒構建成功。

圖 5 重組質粒雙酶切驗證Fig. 5 Identification of recombinant plasmids by double enzymatic digestion

圖 6 重組菌株質粒PCR驗證Fig. 6 PCR validation of plasmids from recombinant strains

將已構建完成的重組質粒pHY-mtnNasRNA-1、pHY-mtnNasRNA-2和pHY-mtnNasRNA-3電轉化至B. amyloliquefaciensHZ-12中，用引物pHY-F/pHY-R進行菌落PCR驗證，挑選正確的陽性克隆子進行質粒DNA提取，通過PCR驗證（圖6），并測序進一步驗證，確認序列正確無誤，說明反義RNA抑制mtnN基因表達工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3構建成功。

2.2.2 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響

研究表明，反義RNA能一定程度抑制某特定基因的表達，而菌體的生長繁殖不受影響。為驗證反義RNA抑制mtnN基因對B. amyloliquefaciensHZ-12合成SAM的影響，按照1.1.3節和1.3.4節發酵培養基和培養條件對工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3以及對照菌株HZ-12/pHY300和原始菌HZ-12進行發酵驗證，發酵周期60 h。并測定發酵終點的SAM產量和菌體生物量（OD600nm）。

圖 7 反義RNA抑制mtnN基因表達對SAM含量的影響Fig. 7 Effect of mtnN expression inhibition by asRNA on SAM production

由圖7可以看出，工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3發酵后SAM產量分別為14.58、12.27 mg/L和12.49 mg/L， 相比于對照菌HZ-12/pHY300分別提高了44%、22%和24%，其中工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1效果最明顯。由于反義RNA的抑制效率與反義RNA在目標基因5’端不翻譯區域結合位置有關，所以在mtnN基因5’端不翻譯區域選擇不同的結合區域，對mtnN基因的抑制程度不同，從而影響SAM循環途徑，導致不同的SAM產量。而工程菌的生物量與對照菌相比沒有明顯差別，說明反義RNA抑制mtnN基因的表達既可促進SAM的積累，又不影響菌體的生長。

3 討 論

SAM是人體必需的生物活性輔因子，廣泛參與生物體內各種代謝反應，尤其是作為甲基供體參與生物體內一百多種甲基轉移酶催化反應[25-26]。mtnN基因同時參與SAM的兩個循環利用途徑，敲除或抑制該基因有望降低SAM的循環利用，促進SAM的積累。本研究基于基因敲除技術和反義RNA特異性抑制技術，成功構建了mtnN基因缺失菌株HZ-12ΔmtnN以及抑制mtnN的反義RNA工程菌HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1、HZ-12/pHY-mtnNasRNA-2和 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-3。通過發酵驗證，發現缺失mtnN基因的菌株生長受到嚴重抑制，這與其他研究結果一致，SAHN在細胞內具有重要作用，其活性的下降會造成胞內SAH的累積，SAH是SAM依賴甲基轉移酶的反饋抑制劑，胞內低濃度的SAH的積累就會使甲基轉移反應得到全面抑制，從而嚴重影響細菌的生長和分裂[27]。同時，缺失菌株HZ-12ΔmtnN SAM產量僅有4.54 mg/L，與原始菌HZ12相比降低了51%，這可能是其菌體生長受阻造成的直接結果。

傳統的基因敲除方法可能會導致菌體生長受緩甚至死亡，而反義RNA介導的調控機制可以被用于代謝途徑的微調，常用于平衡細胞生長和產物的合成[28-30]。同樣，本研究所構建的反義RNA抑制mtnN基因工程菌株，對菌體的生長沒有顯著的抑制作用。同時，工程菌的SAM產量相比于對照菌均有顯著的提高，特別是工程菌 HZ-12/pHY-mtnNasRNA-1，SAM的產量提高了44%。本研究通過反義RNA抑制技術精細調控mtnN基因，在不影響菌株生長的條件下，顯著增強了SAM的合成，為SAM生產菌的代謝工程育種提供了一種新型的策略?？傮w而言，目前從頭合成SAM的產率普遍較低。究其原因可能是目前微生物自身合成甲硫氨酸的能力普遍較弱，未來的研究需通過系統代謝工程改造強化菌株自身合成甲硫氨酸的能力，進一步提高SAM的產量。