康磚茶葉風味特征及揮發性成分分析

張 婷，倪 輝,2,，伍 菱,2，胡 陽,2，鄔應龍，黃高凌,2，李利君,2

（1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室， 廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021；3.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

茶葉是一類重要的農產品，根據茶葉原料品種和加工過程的不同，將茶葉分為六大類：綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶[1]。香氣是決定茶葉品質的關鍵因素之一[2]，闡明茶葉香氣特征是提高茶葉產品質量的重要研究內容。目前，香氣提取方法有超臨界流體萃取法、同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）法、頂空吸附法、吹掃捕集法以及固相微萃取法等[3]。其中，SDE法具有重復性好和效率高等優點[4]。此外，香氣化合物的分析檢測方法主要有氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術和氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術等，能實現多組分揮發性化合物的定性和定量分析及確定樣品中產生的關鍵香氣成分[5-6]。 自1893年Bamber用蒸餾法提取茶葉中的香精油開始，迄今已從茶葉中分離出包括醇、醛、酮、酯、酸、氮、氧雜環化合物等在內的700 多種香氣物質[7-8]。

黑茶是一類特殊的微生物后發酵茶，其生產和消費主要集中在中國和日本[9]。我國黑茶主要包括云南普洱茶、湖南茯磚茶、廣西六堡茶、湖北青磚茶和四川康磚茶[10]。在黑茶的香氣研究方面，相關學者利用SDE法結合GC-MS技術測定了茯磚茶主要揮發性成分為月桂烯、1-辛醇和月桂酸甲酯等18 種物質[11]。此外，劉澤森等[12]從檳榔香六堡茶中鑒定出66 種揮發性成分，且發現α-雪松醇、β-雪松烯、l,2,3-三甲氧基苯、β-芳樟醇和氧化芳樟醇是其主要揮發性成分；陳梅春等[13]采用頂空固相微萃取-GC-MS聯用法分析陳年普洱茶的揮發性成分，發現主要以高沸點的芳烴類及其衍生物和萜烯類化合物為主；鄭鵬程等[14]研究康磚茶葉主要揮發性成分為己醛、α-紫羅酮、反式-香葉基丙酮和β-紫羅酮，并采用峰面積歸一法對其揮發性成分定量分析。目前，已有許多學者研究黑茶的主要揮發性成分種類和含量，但是鮮有文獻報道黑茶的香氣特點及關鍵呈香化合物。

四川康磚茶（又稱藏茶）是我國典型的黑茶代表之一，是藏族人民煮奶茶的生活必需品[15]。目前國內外學者已經開始研究四川康磚茶發酵的功能微生物，對其風味特征及關鍵香氣成分尚未開展深入研究。因此，本研究的主要目的是綜合感官評價、GC-MS及GC-O分析，解析康磚茶葉揮發性成分及風味特征，為進一步改善康磚茶葉的品質提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

康磚茶葉（2017年）主要工藝流程：以做莊茶為原料，進行蒸揉、渥堆、烘干、篩分、蒸壓和干燥等，購于深圳東方高柏科技股份有限公司，購買后以錫箔袋密封，保存于4 ℃冰箱中備用。

正構烷烴（C8～C20）、環己酮 美國Sigma-Aldrich公司；己醛、庚醛、α-蒎烯、2-戊基呋喃、2-乙基己醇、苯乙醛、苯乙酮、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、α-萜品醇、香葉醇、雪松醇、反式-2-壬烯醛、藏花醛、反式-α-紫羅蘭酮、順式-香葉基丙酮、反式-β-紫羅蘭酮、吲哚、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯 美國Alfa Aesar公司；無水硫酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（色譜純） 瑞典歐森巴克化學公司。

1.2 儀器與設備

SDE裝置Likens-Nickerson儀器 鄭州鑫瑞化驗廠；電熱套 邦西儀器科技（上海）有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；QP-2010 Plus GC-MS聯用儀 日本島津公司；Rtx-5MS和Rtx-WAX色譜柱 美國Restek公司；OP275嗅聞儀 日本GL Science公司。

1.3 方法

1.3.1 SDE法提取康磚茶葉揮發性成分

由于康磚茶葉在飲食時通常要經過長時間的煮茶，因此，用SDE法提取其揮發性成分，模擬沸水煮茶葉的工藝。準確稱量30 g康磚茶葉于圓底燒瓶中，并加入300 mL超純水，萃取劑為100 mL正己烷，將兩個燒瓶放置于SDE裝置中，并用電熱套加熱至各自的沸點，萃取時間1.5 h。萃取結束后，冷卻至室溫，用分液漏斗進行分離，收集的有機相用無水硫酸鈉干燥24 h后，旋蒸濃縮至3 mL，再經高純氮氣吹至1 mL，得到濃縮的康磚茶葉提取物，密封放置-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 感官評價

參考相關文獻[16-17]和ISO 8589—2007，首先采用少量乙醇稀釋不同香氣的標準品，然后量取一定體積的超純水將標準品分別進行稀釋成1、4、9 分對應的濃度，并建立康磚茶葉氣味特征感官評價標準（表1），選取12 名感官評價成員（20～30 歲）包括8 名女性和4 名男性（均為培訓6 個月以上感官評價的人員），區別青草香、花香、木香、甜香和陳舊味的香氣特征和強度，其中1 分表示香氣強度較低，4 分表示香氣強度中等，9 分表示香氣強度較高。在此基礎之上取20 μL康磚茶葉提取物加入980 μL無水乙醇進行混勻稀釋，并取50 μL稀釋液滴在聞香條上，空氣中干燥90 s進行感官評價。評價過程中，室溫保持在（25±2）℃之間，相對濕度在50%～75%之間，室內無其他氣體干擾并保持通風。

表 1 康磚茶葉感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Kangzhuan tea

1.3.3 色譜條件

Rtx-5MS石英毛細柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：選擇程序升溫，進樣口溫度為230 ℃，初始溫度為50 ℃并保持2 min，以3 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min；載氣（He）流速3 mL/min， 進樣量1 μL；不分流進樣。

R t x-W A X 石英毛細柱（3 0 m×0.3 2 m m，0.25 μm）；升溫程序：選擇程序升溫，進樣口溫度為250 ℃，初始溫度為50 ℃并保持3 min，以3 ℃/min升溫至130 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持1 min；載氣（He）流速3 mL/min，進樣量1 μL；不分流進樣。

1.3.4 質譜條件

Rtx-5MS石英毛細柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）和Rtx-WAX石英毛細柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）電離方式均為電子電離，電離能量均為70 eV，質譜接口溫度分別為250 ℃和200 ℃；離子源溫度分別為220 ℃和200 ℃，掃描方式選擇Scan模式進行定性分析，離子碎片的掃描范圍均為m/z 35～500；溶劑延遲時間均為1.5 min；定量分析時質譜掃描方式設為單離子掃描（single ion monitoring，SIM）模式。

1.3.5 揮發性成分的定性和定量分析

1.3.5.1 定性分析

運用質譜數據庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進行相似度檢索，根據不同物質的基峰、質荷比和相對峰度做串連檢索與人工解析，質譜匹配度大于80%作為物質鑒定標準。計算待測組分的保留指數（retention index，RI），與文獻報道的保留指數進行對比定性，其中保留指數運算參照Vandendool等[18]的方法，將待測物質的特征離子和RIx與標準品比較進行定性。

式中：TR為保留時間；x為待測組分；n和n+1分別為待測組分出峰前后相鄰的兩個正構烷烴的碳原子數。

1.3.5.2 定量分析

具有標準品的揮發性成分，采用正己烷作為溶劑，并配制質量濃度梯度分別為0.5、1、5、10、50、80、100 μg/mL的混合標準品，按照1.3.3節和1.3.4節的GC-MS條件，并對混合標準品依次從低質量濃度到高質量濃度進行分析，進樣量均為1 μL，之后建立標準曲線對康磚茶葉揮發性成分進行定量。

不具有標準品的揮發性成分，精確吸取990 μL康磚茶葉提取物并加入10 μL環己酮（10 μg/mL）作為內標物進行混勻，進樣量為1 μL，之后采用內標法進行定量。

1.3.6 GC-MS-O條件

GC-MS的條件與1.3.3節描述的一致。嗅聞儀條件：以空氣（21% O2和79% N2混合）為載氣，流速 50 mL/min，加熱線溫度200 ℃，分流比1∶1。GC-O實驗采用香氣萃取稀釋法分析康磚茶葉提取物的氣味和強度，將提取物以正己烷為溶劑進行40、41、42、43倍稀釋，進樣針吸取每個稀釋倍數的樣品1 μL注射到GC進樣口，由3 個經過聞香訓練的人員進行嗅聞，并記錄保留時間、香氣特征和稀釋倍數。每個樣品重復3 次。

1.4 統計分析

通過Microsoft Office Excel 2010軟件計算實驗數據的均值和標準差，并繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 感官評價

康磚茶葉香氣提取物感官評價的雷達圖（圖1）顯示，其主要呈現花香和木香，其次是陳舊味和青草香以及輕微的甜香，這表明康磚茶葉的主要香氣輪廓為花香和木香，該結果不同于相關文獻報道普洱生茶和普洱熟茶主要以花香和陳舊味為主[19-20]，說明康磚茶葉與普洱茶的風味特征不同。

圖 1 康磚茶葉感官評價雷達圖Fig. 1 Radar map of sensory evaluation of Kangzhuan tea

2.2 揮發性成分的定性分析

對康磚茶葉進行GC-MS分析，得到該樣品中揮發性成分的總離子流圖（圖2），根據譜庫檢索、標準品比對及參考相關文獻，共鑒定出35 種揮發性成分（表2）， 包括8 種醇類、6 種醛類、8 種酮類、3 種萜烯類、4 種氧化物類以及6 種其他類化合物，該結果與鄭鵬程等[14]報道康磚茶葉主要揮發性成分種類相似。但與黃亞輝等[11]報道的茯磚茶揮發性化合物主要是醇類和酯類物質具有明顯不同，這表明康磚茶葉和其他黑茶品種的揮發性成分不同。

圖 2 康磚茶葉中揮發性成分的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatiles in Kangzhuan tea

表 2 康磚茶葉中揮發性成分鑒定結果Table 2 Identification of volatile compounds in Kangzhuan tea

2.3 揮發性成分的定量分析

表 3 康磚茶葉中揮發性成分的定量結果Table 3 Quantitation of volatile compounds in Kangzhuan tea

康磚茶葉揮發性成分經過標準曲線外標法進行定量（表3），可以得知醇類、醛類、酮類、萜烯類、氧化物類和其他類分別占揮發性成分總量的20.59%、9.96%、11.95%、3.49%、5.17%和48.83%，因此醇類、酮類和其他類在康磚茶葉提取物揮發性成分中相對含量較高，這與鄭鵬程等[14]采用頂空固相微萃取結合GC-MS研究康磚茶葉中酮類和醛類的相對含量高于其他類成分相似。由表3還可看出，醇類物質中，含量較高的化合物為2-乙基己醇（37.7 μg/mL）、雪松醇（34.8 μg/mL）、α-萜品醇（14.4 μg/mL）和芳樟醇（11.9 μg/mL）。相關研究表明，這些物質主要是由于茶葉發酵過程中微生物產生的胞外酶水解糖苷類香氣前體而生成[23]。

醛類物質中，苯乙醛（2 5.5 μ g/m L）、壬醛 （8.8 μg/mL）和己醛（8.4 μg/mL）是康磚茶葉含量較高的化合物。該類成分主要是不飽和脂肪酸的自動氧化和水解的產物[23]。此外，Xu Xiangjun等[23]發現茯磚茶中醛類的相對含量為51%，與之相比，本研究醛類物質相對含量（9.96%）明顯低于茯磚茶。

酮類物質中，順式-香葉基丙酮（20.2 μg/mL）、4-(2,4,4-三甲基-1,5-環己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮 （17.0 μg/mL）和6,10-二甲基-2-十一酮（6.2 μg/mL）為康磚茶葉含量較高的成分，這與Lv Shidong等[10]研究茯磚茶中含量較豐富的化合物為β-紫羅蘭酮和香葉基丙酮基本一致。Mapari等[24]的研究認為該酮類物質是由于類胡蘿卜素（植物烯或植物氟烯）發生氧化反應和縮合反應而生成的。

萜烯類物質中，主要包括花側柏烯（10.0 μg/mL）、α-雪松烯（5.7 μg/mL）和α-蒎烯（3.6 μg/mL）三種化合物。此外，芳樟醇氧化物I（5.1 μg/mL）、芳樟醇氧化物II（2.1 μg/mL）、芳樟醇氧化物III（4.6 μg/mL）和芳樟醇氧化物IV（16.8 μg/mL）均在康磚茶葉中檢測到。 Lv Shidong等[10]研究表明普洱茶和茯磚茶后發酵過程中，芳樟醇發生氧化作用而生成芳樟醇氧化物，從而導致芳樟醇含量急劇下降，且普洱茶和茯磚茶中芳樟醇氧化物相對含量分別為5.39%和3.77%。本研究結果與之相比，芳樟醇氧化物相對含量（5.17%）比茯磚茶的高，但比普洱茶略低，這表明不同品種的茶葉中芳樟醇氧化的程度是不同的。

1,2,3-三甲氧基苯（151.7 μg/mL）和二氫獼猴桃內酯（96.9 μg/mL）是康磚茶葉揮發性成分含量較高的化合物，分別占揮發性成分總量的27.43%和17.52%。這與有關學者研究二氫獼猴桃內酯是茯磚茶主要揮發性成分是一致的[10]。此外，Lv Haipeng等[19]指出1,2-二甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯等化合物是由于微生物和熱降解雙重作用下，通過沒食子酸的甲基化修飾而形成的。

2.4 揮發性成分的GC-O結果分析

將康磚茶葉提取物進行GC-O分析，從表4可知，共檢測到24 種香氣化合物，包括5 種醇類（FD值=26）、6 種醛類（FD值=102）、5 種酮類（FD值=89）、1 種萜烯類（FD值=1）、2 種氧化物類（FD值=20）和5 種其他類（FD值=17），該結果表明醛類、酮類和醇類為康磚茶葉主要香氣貢獻成分種類，這與青磚茶葉的香氣貢獻成分種類為醛類、酮類、芳香烴類和醇類的結果相似[25]。

表 4 康磚茶葉中香氣成分GC-O結果Table 4 GC-O analysis of odor compounds in Kangzhuan tea

醇類物質中，芳樟醇（FD值=16）呈現花香且是茶葉中常見的揮發性成分，主要是由糖苷類前體水解 生成[26-28]，然而芳樟醇并不是含量最高的醇類物質卻是香氣強度較大的化合物，原因是該物質具有比其他醇類較低的閾值；另外，香葉醇（FD值=4）呈現花香；α-萜品醇（FD值=4）呈現木香且黑茶后發酵過程中微生物的活性可以決定該物質的產生[20]。

醛類物質中，反式-2-壬烯醛（FD值=64）對康磚茶葉的香氣貢獻較大，呈現青草香；己醛（FD值=16）、苯乙醛（FD值=16）和壬醛（FD值=4）均對康磚茶葉貢獻青草香[20]，這表明感官評價中青草香是由該類物質貢獻的。

酮類物質中，反式-β-紫羅蘭酮（FD值=64）呈現花香和反式-α-紫羅蘭酮（FD值=16）呈現木香和陳舊味，兩者均是康磚茶葉主要的香氣貢獻成分。此外，FD值=4的香氣成分為順式-香葉基丙酮主要呈現花香和木香以及4-(2,6,6-三甲基-1,3-環己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮主要呈現甜香，這兩種香氣化合物在青磚茶葉中均檢測到，且前者是青磚茶葉的關鍵香氣成分[25]。

芳樟醇氧化物中，芳樟醇氧化物I（FD值=16）和芳樟醇氧化物II（FD值=4）均呈現花香，大量研究表明芳樟醇氧化物是普洱茶中貢獻花香味的關鍵香氣成分，且該類物質的產生也取決于后發酵過程中微生物的活性[10]。

1,2,3-三甲氧基苯（FD值=4）和1,2,4-三甲氧基苯（FD值=4）均呈現陳舊味，是康磚茶葉中主要貢獻陳舊味的化合物。此外，有文獻報道這兩種化合物是普洱熟茶中貢獻陳舊味的主要香氣化合物，而且普洱茶中甲氧基苯類物質貢獻的陳舊氣味強度高于茯磚茶[10]；二氫獼猴桃內酯（FD值=4）呈現木香和花香，對康磚茶葉的香氣貢獻程度中等，該物質也是茯磚茶和普洱茶的重要香氣化合物[19]。另外，1,2,3-三甲氧基苯和二氫獼猴桃內酯是康磚茶葉中含量較高的物質，但是其香氣貢獻程度卻不是最大的，原因在于這兩種化合物的閾值相對其他化合物較高。

圖 3 康磚茶葉5 種關鍵香氣的FD值Fig. 3 Flavor dilution factors of five key aromas in Kangzhuan tea

由圖3可知，康磚茶葉提取物FD值較高的特征香氣為花香和青草香，其次是木香和陳舊味以及甜香，然而該結果與康磚茶葉提取物感官評價的香氣輪廓不一致，原因是GC-O分析的是康磚茶葉提取物中每種揮發性香氣成分的香氣強度，而感官評價描述的是康磚茶葉提取物整體的香氣輪廓。相關研究表明，茶葉的整體香氣不僅與其單種成分的香氣強弱有關，而且還與各揮發性化合物之間的協同效應有關[29-31]，由于尚未對茶葉各成分協同效應進行研究，目前尚不明確哪些成分的協同對康磚茶葉的香氣具有明顯影響。

3 結 論

康磚茶葉主要香氣輪廓為花香和木香。GC-MS分析該茶葉共鑒定出3 5 種揮發性成分，包括8 種醇類（20.59%）、6 種醛類（9.96%）、8 種酮類（11.95%）、3 種萜烯類（3.49%）、4 種氧化物類（5.17%）和6 種其他類（48.83%），其含量較高的化合物為1,2,3-三甲氧基苯、二氫獼猴桃內酯、2-乙基己醇、雪松醇和苯乙醛。GC-O分析FD值為64的香氣化合物為反式-2-壬烯醛（青草香）和反式-β-紫羅蘭酮（花香）以及FD值為16的香氣化合物為芳樟醇（花香）、己醛（青草香）、苯乙醛（青草香）、反式-α-紫羅蘭酮（木香和陳舊味）和芳樟醇氧化物I（花香），這7 種化合物為康磚茶葉提取物的主要香氣貢獻成分。以上結果揭示了康磚茶葉的風味特征及主要香氣成分，為深入認識康磚茶葉香氣特征提供了數據參考。未來還需要對各揮發性成分協同作用進行深入研究。