黃山花菇多糖FMP31的化學結構與免疫活性研究

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(1.合肥工業大學食品與生物工程學院,安徽合肥 230009;2.功能性復合調味品安徽省重點實驗室,安徽界首 236500)

花菇是通過控制香菇生產過程中的生長條件,改變香菇發育過程,使菌蓋形成褐白相間花紋而形成的品種,是香菇中的上品。目前對花菇的報道主要集中在栽培與孢子選種方面[1],關于花菇化學成分與活性的研究不多,僅有一些關于花菇多糖提取工藝及體外抗氧化活性等的研究[2]。

黃山花菇是生長于黃山地區的花菇品種,以個大、顏色鮮艷及營養豐富著稱,為黃山地區有名的旅游特產。研究表明真菌蘑菇的營養價值與其多糖成分緊密相關,真菌多糖已被證明具有抗腫瘤、降血糖、增強免疫力等一系列營養健康價值[3-5]。為了加大促進黃山地區花菇資源開發利用與地方特色農副產品精深加工,本課題組近年來對黃山花菇主要化學組分多糖進行了系列研究,包括黃山花菇多糖的分離純化、多糖的結構表征、多糖的構效關系、多糖的營養作用機理等[6-8]。

本研究在前期工作基礎上,采用化學和光譜學結合的手段,解析了從黃山花菇中分離獲得的一多糖組分黃山花姑多糖Floral Mushroom Polysaccharide 3-1(FMP3-1)的精細結構,并測試了FMP3-1的免疫活性,為黃山花菇資源的開發利用提供了新基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃山花菇 由安徽黃山云樂靈芝有限公司提供,使用藥物粉碎機粉碎成粉末,經索氏提取器脫色脫脂烘干后備用;乙醇、三氯甲烷、正丁醇、過氧化氫、氯化鈉、溴化鉀、三氟乙酸、甲醇、硼氫化鈉、乙酸、乙酸酐、吡啶、無水硫酸鈉、氫化鈉、正己烷、碘甲烷、甲酸、甲苯等 均為分析純(AR),國藥集團化學試劑有限公司;DMEM培養基、噻唑藍 Hyclone公司;中性紅染色液 上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜、DEAE-Cellulose、Sephacryl S-300、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、二甲基亞砜、Griess試劑 Sigma-Aldrich公司。

W201B型旋轉蒸發儀 上海申勝生物技術有限公司;ST-16R型高速冷凍離心機、Multiskan Go 1510型酶標儀、Nicolet 67型紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;VNMRS600型核磁共振波譜儀、7980型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司;ALLINE系列E2695系統高效液相色譜儀 沃特世科技(上海)有限公司;Mco-17AIC型CO2培養箱 日本三洋電機株式會社;SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖FMP3-1的提取分離純化 黃山花菇粗多糖FMP的提取參考文獻[6]進行。取200 g黃山花菇粉末,在100 ℃下以1∶35的料液比提取2 h。之后用4層紗布過濾提取液,并收集濾液。經離心(8000 r/min,25 ℃,10 min)去除不溶性物以收集上清液,用4倍體積為95%的乙醇醇沉24 h。向沉淀物中加Sevege試劑(三氯甲烷∶正丁醇=1∶5～1∶4),其中Sevege試劑與多糖溶液的體積比為1∶5～1∶4,劇烈搖動20 min。重復幾次后,在分離漏斗中去除蛋白,減壓蒸發濃縮上清液(轉速為70 r/min,溫度為70 ℃),以去除三氯甲烷。將溶液用過氧化氫脫色3～4 h后,裝入3500 Da透析袋中,用自來水透析3 d,去離子水透析2 d。將透析液于-18 ℃冷凍24 h,于室溫融化后離心(8000 r/min,25 ℃,10 min)除去不溶物。之后將溶液冷凍干燥,得到黃山花菇水提粗多糖(FMP),稱其質量記為m(g),多糖得率的計算公式為:

獲得的粗多糖FMP通過DEAE-Cellulose陰離子交換層析柱(1.6 cm×40 cm)進行初步分離純化,依次用去離子水,0.1、0.2 mol/L的氯化鈉溶液進行洗脫,流速為2.5 mL/min,用自動部分收集器收集(4 min/管)0.2 mol/L氯化鈉洗脫液部分,用旋轉蒸發儀對其進行濃縮(轉速為70 r/min,溫度為60 ℃),使其體積減小到原體積的10%,冷凍干燥得到粗多糖FMP3。FMP3進一步通過Sephacryl S-300凝膠柱進行純化,凝膠柱色譜分離條件為:流動相超純水,流速0.2 mL/min,10 min/管。洗脫組分減壓蒸發濃縮(轉速為70 r/min,溫度為60 ℃)。濃縮液于25 ℃下以10000 r/min的轉速離心10 min。離心所得的上清液采用截留分子量為3500 Da的透析袋,于去離子水中透析3 d。透析后的溶液經冷凍干燥后得到多糖FMP3-1。

1.2.2 分子量測定 稱取10 mg FMP3-1,溶于10 mL去離子水中。將溶液于10000 r/min的轉速下離心10 min,取上清液用0.22 μm濾膜過濾。高效液相色譜(HPLC)系統為Waters E2695系統,檢測器為2424蒸發光散射檢測器(ELSD),凝膠柱型號為UltrahydrogelTM2000(7.8 mm×300 mm)和UltrahydrogelTM500(7.8 mm×300 mm),兩柱串聯。流動相為去離子水,流速為0.5 mL/min,試樣體積為20 μL。通過測定Detran系列標品葡萄糖的分子量,繪制標準曲線。

1.2.3 紫外光譜掃描 采用紫外光譜法檢測FMP3-1中的蛋白質和核酸含量,稱取10 mg FMP3-1溶于5 mL去離子水中,裝入石英比色皿中,于紫外掃描光譜儀上掃描,掃描波長范圍為190～400 nm。

1.2.4 紅外光譜掃描(FT-IR) 稱取1～2 mg多糖樣品和100～200 mg溴化鉀,將樣品和溴化鉀在研缽中混合研碎,壓片后在Nicolet 67型紅外光譜儀上測定,波數范圍是4000～500 cm-1。

1.2.5 單糖組成測定 FMP3-1的單糖組成分析采用GC法確定[6,9]。將5 mg多糖樣品放入安培管,加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸后,在120 ℃下水解4 h,水解完成后用旋轉蒸發儀減壓蒸干(轉速為70 r/min,溫度為70 ℃)。加入1～2 mL甲醇繼續蒸干,重復三次除去殘留的三氟乙酸。將完全水解后的樣品溶解在3～4 ml去離子水中,并在室溫下加入30 mg硼氫化鈉還原4 h,用25%乙酸中和溶液。在旋轉蒸發儀中蒸發至無水狀態后,加入3 mL乙酸酐和3 mL吡啶,并使反應在100 ℃下反應1 h。再加入3～4 mL甲苯進行減壓蒸干,重復數次以去除吡啶。加入三氯甲烷和去離子水各3 mL進行萃取,取有機層,重復數次,加入無水硫酸鈉以除盡水份,離心(10000 r/min,25 ℃,10 min)后取1 mL上清液進行GC檢測分析,檢測條件:N2:20 mL/min;H2:30 mL/min;空氣:200 mL/min;柱溫:230 ℃,檢測器溫度:250 ℃;氣化室溫度:280 ℃。

1.2.6 甲基化分析 FMP3-1的糖鏈連接方式采用甲基化法測定[8,10]。在100 mL的燒瓶中加入5 g帶油的氫化鈉,再加入25 mL正己烷。用玻璃棒攪拌后靜置1 h,倒出上清液,得到無油氫化鈉。擰緊橡膠塞,用氮氣吹干氫化鈉。在通氮氣的過程中,加入50 mL二甲基亞砜,于30 ℃下恒溫攪拌24 h,直至溶液變為深綠色,制得SMSM試劑。將FMP3-1放在真空干燥箱中干燥3～4 h(-0.1 MPa,50 ℃)。然后將35 mg干燥后的多糖溶解在5 mL干燥的二甲基亞砜中。然后在氮氣下快速加入2 mL SMSM試劑,混合0.5 h。在避光冷鹽浴條件下,慢慢向混合溶液中加入2 mL碘甲烷。在50 ℃油浴中攪拌1 h后,室溫下攪拌過夜。隨后過量的碘甲烷用氮吹除去。混合液用去離子水透析3 d(3500 Da透析袋)后,冷凍干燥得到甲基化多糖。稱重5 mg甲基化多糖,放入10 mL安培管中并加入4 mL 88%甲酸,用酒精噴燈封管。甲基化多糖于100 ℃下解聚6 h,并用旋轉蒸發儀減壓蒸干。之后步驟與GC處理相同。用GC-MS技術對其衍生物進行分析。質譜條件:掃描方式為 EI 源;離子源溫度設置為230 ℃;檢測器電壓為1.25 kV;掃描時間為0.5 s。

1.2.7 核磁共振分析 將FMP3-1樣品置于真空干燥箱中干燥過夜,稱取60 mg多糖樣品溶于0.6 mL D2O中,用核磁共振儀對其進行1H NMR、13C NMR、HSQC和HMBC波譜分析[8]。

1.2.8 FMP3-1的部分酸水解及GC分析 于10 mL安培管中加入5 mL 0.8 mol/L三氟乙酸和50 mg FMP3-1多糖樣品,密封口后在90 ℃烘箱中進行酸水解1 h。反應結束后,減壓蒸干三氟乙酸1 h,壓強為0.1 MPa。所得的水解產物用去離子水透析(3500 Da透析袋)、濃縮(轉速為70 r/min,溫度為60 ℃)、冷凍干燥,得到部分酸水解多糖FMP3-1S。FMP3-1S進一步進行GC分析,檢測條件參照1.2.5。

1.2.9 免疫活性評價 多糖的體外免疫活性實驗參照文獻[6,11]進行。使用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養基,在37 ℃,5% CO2條件下培養巨噬細胞RAW 264.7。實驗前,用DMEM培養液將細胞稀釋至1.0×105個/mL,取150 μL細胞液于96孔板中,貼壁培養24 h,分別加入50 μL濃度為20、50、100、200和500 μg/mL的多糖樣品溶液,培養48 h后,分別加入20 μL濃度為5 mg/mL的噻唑藍試劑,混勻,繼續培養4 h,移去上清液,加入200 μL二甲基亞砜,振蕩10 min后用酶標儀在570 nm下測定吸光度值。巨噬細胞NO釋放量和吞噬能力測定是向培養液中分別加入Griess試劑和中性紅染色液,反應結束后在540 nm下測定吸光度值。FMP3-1對細胞增殖活性的作用采用增殖指數來表示,增殖指數=Abssample/Abscontrol。每組實驗重復5次以上。

1.3 數據處理

數據以X±SD形式表示,采用Origin 9.1軟件繪制圖表,利用SPSS 22.0軟件進行數據統計處理,*表示差異顯著,P<0.05,**表示差異極顯著,P<0.01。

2 結果與分析

2.1 FMP3-1的結構分析

將干燥的黃山花菇粉末經索氏提取器脫色脫脂后,經熱水浸提獲得粗多糖FMP,多糖得率為6.4%。FMP通過DEAE-Cellulose陰離子交換樹脂進行初步純化,收集由0.2 mol/L氯化鈉洗脫的多糖FMP3,FMP3,再通過Sephacryl S-300凝膠柱進一步純化,獲得多糖組分FMP3-1。FMP3-1在HPGPC上顯示為均一對稱峰(圖1A),表明其為均一組分,測得平均分子量為5.74×105Da。紫外掃描結果(圖1B)顯示FMP3-1在260和280 nm處并沒有吸收峰,說明FMP3-1中不含有核酸和蛋白質。FMP3-1紅外圖譜(圖1C)顯示了多糖的典型吸收峰[8-9],其中3410和2920 cm-1附近的吸收峰歸功于O-H和C-H鍵的伸縮振動,1415 cm-1的吸收峰為糖環上C-H變形振動,1045 cm-1附近的吸收峰為C-O或C-O-H的彎曲振動峰,而1720 cm-1處無吸收峰表明多糖FMP3-1不含糖醛酸。

GC圖譜(圖1D)分析表明,FMP3-1由甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)和半乳糖(Gal)三種單糖組成,摩爾比為1.00∶9.23∶0.57。GC分析顯示的高含量葡萄糖組分表明FMP3-1的主鏈結構主要由葡萄糖殘基組成。由于在酸水解中多糖支鏈更容易斷裂,為了推斷FMP3-1的結構特征,對FMP3-1進行了部分酸水解實驗。部分酸水解產物FMP3-1S的GC分析結果(圖1E)表明FMP3-1S由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成,摩爾比率為1.00∶6.05∶0.49。與FMP3-1比較,葡萄糖和半乳糖占比例明顯降低,表明支鏈含有大量葡萄糖和少量半乳糖殘基。

通過甲基化方法確定多糖FMP3-1的連接方式[10]。甲基化FMP3-1進行糖醇乙酸酯反應 生成的最終產物進行GC-MS分析,結果表明FMP3-1主要含有6種連接方式1-β-D-Glcp、1-β-D-Galp、(1→4)-Glcp、(1→6)-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp和(1→3,6)-β-D-Glcp,各連接方式之間的摩爾比為1.0∶0.49∶1.04∶5.09∶0.84∶0.62。由此可知,FMP3-1是一個帶有分支的雜多糖,而高含量的(1→6)-Glcp是多糖FMP3-1主鏈的主要組成結構。

圖1 FMP3-1的HPGPC圖譜(A)、紫外光譜(B)、FT-IR圖譜(C)、GC圖譜(D)及其水解產物FMP3-1S的GC圖譜(E)Fig.1 HPGPC(A),UV spectrum(B),FT-IR(C),GC(D)of FMP3-1 and GC of its hydrolyzed production FMP3-1S(E)

圖2 FMP3-1的核磁共振譜Fig.2 NMR spectra of FMP3-1注:A：1H NMR;B：13C NMR;C：HSQC;D:HMBC。

為了進一步確定FMP3-1化學結構,對其進行1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC核磁分析(圖2)。在參考相關文獻[12-14]及結合單糖組成、甲基化結果的基礎上,對FMP3-1各糖殘基化學位移進行了歸屬。通過分析,確定(1→4)-Glcp、1-β-D-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp、1-β-D-Galp、(1→3,6)-β-D-Glcp和(1→6)-Glcp各糖殘基的異頭氫碳吸收峰分別為5.24 ppm/102.1 ppm、5.21 ppm/102.3 ppm、4.92 ppm/104.1 ppm、4.82 ppm/100.8 ppm、4.60 ppm/105.3 ppm、4.37 ppm/105.6 ppm。FMP3-1的HMBC譜圖(圖2D)上顯示了糖殘基之間的鏈接位點,其中明顯的交叉峰F H1/F C6表明(1→6)-Glcp是FMP3-1中主要的連接方式。結合GC和甲基化結果可以推斷,多糖FMP3-1的主鏈由(1→4)-β-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp組成,在(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp的O-3位連有支鏈1-β-D-Glcp和1-β-D-Galp。由李盛等[15]可知,菌類多糖主要由(1→3)-β-D-Glcp組成,而連接有1→6支鏈的(1→3)-β-D-Glcp能提高機體免疫功能。Zhou等[16]研究發現,白玉菇堿提多糖WHP的主鏈是由(1→3)-β-D-Glcp組成,平均3～4個殘基的O-6位連接1-β-D-Glcp,表明白玉菇堿提多糖WHP是一種典型的具有良好免疫活性的菌類多糖。由Huang等[17]可知,靈芝多糖的主鏈是由(1→3)-β-D-Glcp和(1→4)-β-D-Glcp組成,帶有(1→6)-Glcp的支鏈。根據Meng等[18]的報道,平菇多糖的主鏈是由(1→3)-β-D-Glcp組成,可增強淋巴細胞的增殖。與上述文獻研究不同的是,本文中從黃山花菇中提取出的多糖FMP3-1是一種雜多糖。

2.2 FMP3-1的免疫活性分析

采用體外免疫活性實驗檢測了多糖FMP3-1及其水解產物FMP3-1S對巨噬細胞Raw 264.7的增殖活性、NO分泌能力和吞噬活性的影響,結果見圖3。由圖3可知,FMP3-1和其水解產物FMP3-1S能明顯促進巨噬細胞RAW264.7的增殖(圖3A),且具有濃度效應,在濃度為500 μg/mL時,增殖指數分別為1.84和1.41。比較多糖FMP3-1及其水解產物FMP3-1S對巨噬細胞Raw 264.7增殖的影響可知,部分酸水解多糖FMP3-1S對巨噬細胞Raw 264.7的增殖活性有明顯的減弱,與FMP3-1相比有差異明顯。由此推斷支鏈的缺失對多糖FMP3-1免疫活性的發揮具有顯著影響(P<0.05)。研究表明多糖發揮活性的構效關系十分復雜,受多糖支鏈、取代度、溶解度、分子量、溶液狀態等的影響[15]。FMP3-1與FMP3-1S活性的差異驗證了上述論斷。巨噬細胞Raw 264.7分泌NO能力和吞噬活性實驗結果(圖3B、圖3C)表明,FMP3-1與FMP3-1S都能極顯著(P<0.01)促進巨噬細胞RAW 264.7的NO釋放量,增強巨噬細胞RAW 264.7的吞噬活性(P<0.01)。研究結果進一步說明了FMP3-1具有很好的免疫促進作用。Zhou等[16]研究了白玉菇多糖及其酸水解產物的免疫活性,發現白玉菇多糖WHP具有較好的細胞增殖活性,酸水解產物WHPS能顯著提高巨噬細胞RAW 264.7的吞噬活性、免疫活性。相比于白玉菇多糖,黃山花菇多糖能更好的提高巨噬細胞RAW 264.7的增殖活性并且能促使巨噬細胞RAW 264.7分泌更多的NO,這些結果說明黃山花菇多糖具有更好的免疫活性。由上述結果可知,菌菇多糖及其酸水解產物免疫活性的差異可能是由于結構差異造成的。

圖3 FMP3-1和FMP3-1S對巨噬細胞Raw 264.7免疫活性的影響Fig.3 Immunoassay of FMP3-1 and FMP3-1Sin macrophage Raw 264.7注:與對照組相比,*代表差異顯著P<0.05,**代表差異極顯著P<0.01。

3 結論

采用DEAE-纖維素離子交換層析柱及葡聚糖凝膠色譜技術成功從黃山花菇水提粗多糖FMP3中分離出一個均一多糖組分FMP3-1,紫外掃描結果顯示FMP3-1不含核酸和蛋白質。FT-IR圖譜分析表明FMP3-1不含糖醛酸,為中性多糖組分。FMP3-1的平均分子量為5.74×105Da,由甘露糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成,摩爾比為1.00∶9.23∶0.57。甲基化結果表明FMP3-1含有6種連接方式1-β-D-Glcp、1-β-D-Galp、(1→4)-Glcp、(1→6)-Glcp、(1→3,6)-β-D-Manp和(1→3,6)-β-D-Glcp,各連接方式之間的摩爾比為1.0∶0.49∶1.04∶5.09∶0.84∶0.62,是一個帶有分支的雜多糖。FMP3-1的主鏈由(1→4)-β-D-Glcp、(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp組成,在(1→6)-β-D-Glcp和(1→6)-β-D-Manp的O-3位連有支鏈1-β-D-Glcp和1-β-D-Galp。免疫活性實驗結果表明FMP3-1及其水解產物FMP3-1S都能促進巨噬細胞Raw264.7的增殖,提高巨噬細胞Raw264.7的NO分泌和吞噬能力,具有很好的免疫活性,但FMP3-1的免疫活性高于FMP3-1S,表明FMP3-1免疫活性受支鏈結構影響較大。