陽春砂仁生品與鹽制砂仁不同溶劑萃取物抑菌效果比較

曹冠華,張 雪,王希付,熊 記,王 杰,李曉崗,肖進寶,趙榮華,賀 森

(云南中醫藥大學中藥學院,云南昆明 650500)

砂仁(Fructusamomi)又名小豆蔻,多年生草本姜科植物,其花、果、根、莖、葉均可入藥[1]。砂仁為歷代常用中藥,含多種活性成分[2],其中以揮發油含量居多。中醫認為砂仁性溫、味辛,歸胃經、脾經、腎經,具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效[3]。砂仁根據其不同的炮制方法可分為鹽砂仁、姜砂仁及酒制砂仁等,但目前臨床上常用的是砂仁生品和鹽制砂仁。砂仁鹽制工藝指砂仁生品經一定濃度的鹽水悶潤后,高溫炒炙后的產品。砂仁鹽炙后主歸腎經,辛溫之性略減,溫而不燥,能引藥下行,增強理氣安胎、溫腎縮尿的作用[4]。目前國內外對砂仁的有效成分及藥理作用進行了大量的研究,但對砂仁抑菌研究相對較少,唐建陽等[5]研究發現砂仁粗提物對枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等均具有一定的抑制效果;高林林等[6]、鐘旭美等[7]進一步研究發現,砂仁中的黃酮類物質在抑菌效果中起到主要作用,尤其是60%乙醇浸提下的產物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和綠膿桿菌具有更好的抑制效果。但目前尚無關于砂仁和砂仁炮制品不同溶劑萃取物抑菌效果的報道。砂仁作為天然植物抑菌劑[8],具有廣譜、高效、毒副作用小,安全性較高等優點,具有西藥不具備的優勢,在食品、藥品、化妝品等領域具有廣闊的應用前景[9]。本實驗對砂仁生品和鹽制砂仁的抑菌效果進行了對比分析,為砂仁抑菌劑的研究及相關產品的開發提供了數據支持和理論依據,同時也為進一步探討砂仁的抑菌機理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陽春砂仁 選取的砂仁呈橢圓形或卵圓形,表面棕褐色,密生刺狀突起,頂端有花被殘基,基部具果梗;種子團飽滿緊實,表面棕紅色或暗褐色的新鮮砂仁(水分含量為78.52%),此種砂仁活性成分含量較高[10],采自于云南省紅河金平縣陽春砂仁基地,由云南中醫藥大學趙榮華教授鑒定確定為陽春砂仁;大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 云南大學微生物重點實驗室;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鈉、蛋白胨、酵母粉等 均為分析純。

SK7210HP型超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;LABOROTA4010型旋轉蒸發儀 Heidolph;SHB-III型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;MJ系列恒溫恒濕培養箱 上海一恒科技有限公司;WFZ UV-4802H型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;CS1011型電熱鼓風干燥箱 中華人民共和國重慶實驗設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 砂仁的炮制 取凈砂仁,加鹽水拌勻,室溫悶潤1 h,待鹽水吸盡后用文火炒干(水分含量為9.42%),取出晾涼。每100 g砂仁用食鹽2.5 g[4]。

1.2.2 砂仁乙醇提取物及不同溶劑萃取物的制備 采用有機溶劑熱浸法結合超聲法對砂仁進行有效成分的提取[11]。取砂仁生品與鹽砂仁打粉,過60目篩,將粉末分別用65%、75%、95%的乙醇(浸提固液比1∶10 (m/v))浸泡1 h,60 ℃超聲(功率300 W,頻率40 kHz)3 h,,提取兩次,合并濾液。濾液經旋轉蒸發濃縮至粘稠,揮去有機溶劑,冷凍干燥,得砂仁醇提物,備用。通過比較不同乙醇濃度砂仁生品、鹽制砂仁的得率以及抑菌效果篩選出最佳提取濃度。

得率(%)=干燥后砂仁提取物質量/原料質量×100

將最佳提取濃度提取的砂仁醇提物復溶于蒸餾水中,按極性由小到大,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,有機溶劑與醇提物體積比為2∶1,萃取3～4次。將各組分萃取液蒸發濃縮,得到萃取物的浸膏,干燥稱量,儲存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 抑菌活性的測定

1.2.3.1 培養基的配制 LB培養基:蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g,加水定容至1 L,適度加熱使培養基均勻溶解,調整pH至7.0～7.2,于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2.3.2 供試菌懸液的制備及濃度的測定 菌種活化:從4 ℃冰箱中取出冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌,用無菌接種環挑取單菌落,劃線培養于營養瓊脂平板培養基上,置于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h,得單菌落[12]。挑取活化后的單菌落,用無菌純水制備成菌懸液備用。

將離心管置于烘箱中干燥至恒重,自然冷卻后稱重,記為質量m1,準確量取10 mL菌液進行離心(3500 r/min,10 min),傾去上清液,將菌體烘干至恒重,自然冷卻后稱重,記為質量m2,根據菌體的質量m=m2-m1,計算菌體濃度。

1.2.3.3 供試菌液濃度的確定 采用梯度稀釋法[13],吸取1 mL上述菌懸液加入到9 mL無菌純水中并稀釋,選取5個稀釋度,各吸取0.2 mL分別加入到含有營養瓊脂培養基的培養皿中,涂布均勻,于37 ℃下恒溫培養24 h。要求菌長滿整個培養基且生長分布均勻,從中選出生長情況一致的平板,并以該稀釋度菌液作為供試菌液濃度,進行后續抑菌實驗。

1.2.3.4 不同溶劑萃取物抑菌圈直徑的測定 將LB培養基經高壓滅菌后倒入平板中,待培養基凝固后,在無菌狀態下分別取0.2 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的供試菌液于平板中均勻涂布,靜置待培養基吸取菌液,備用。

采用濾紙片法測定抑菌圈的大小[14]。分別精密稱取砂仁生品與鹽制砂仁不同濃度乙醇浸提物及不同溶劑萃取物的干燥粉末復溶于無菌純水中,超聲溶解,調整樣液濃度為0.1 g/mL,分別取2 mL于小試管中。用打孔器制作直徑7 mm的無菌濾紙片,放入裝有樣液的小試管中浸泡2 h,以無菌純水作對照,每組試驗設3個重復。將浸泡后的紙片排布在帶菌平板上,各濾紙片間距離均等,37 ℃,恒溫培養24 h。觀察并用游標卡尺準確測量抑菌圈直徑。當抑菌圈直徑大于7 mm時,則表示有抑菌作用;若對照組產生抑菌圈,則試驗失敗無效。

1.2.3.5 石油醚萃取物抑菌譜測定 分別將鹽制砂仁與砂仁生品的石油醚萃取物配制為0.1 g/mL溶液,之后進行梯度稀釋,稀釋倍數分別為10倍、100倍、1000倍;將直徑7 mm的無菌濾紙片浸泡于稀釋液中2 h。按上述方法制作帶菌平板,將浸泡于不同稀釋濃度的濾紙片整齊排布于帶菌平板上,以浸泡無菌純水的濾紙片為對照,37 ℃恒溫培養24 h,觀察并測量抑菌圈。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)測定 取砂仁生品及鹽制砂仁的石油醚萃取物,用無菌水溶解,將其配置為10 mg/mL的溶液,用瓊脂平板連續稀釋法將提取物進行稀釋[15],分別制作成抑菌濃度為3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5 mg/mL的培養基,待培養基凝固后,用移液槍分別吸取0.2 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌供試菌液于不同抑菌濃度的平板中,用涂布棒均勻涂布,37 ℃恒溫培養24 h,以不加石油醚萃取物的20 mL LB培養基平板作為空白對照。觀察有無細菌生長,用同樣的方法,升高或降低抑菌濃度,觀察大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌落生長情況,并計算3種供試菌種的最低抑菌濃度。

1.3 數據處理

采用軟件SPSS 21.0中的單因素方差分析(One-way Anova)(>2個樣本)或獨立樣本T檢驗(2個樣本)對本文數據進行方差分析。采用軟件GraphPad Prism 5作圖。

2 結果與分析

2.1 砂仁生品與鹽制砂仁不同濃度乙醇浸提物得率比較分析

以不同濃度的乙醇對砂仁生品和鹽制砂仁分別進行提取、精密稱量。由表1可知,醇提物的得率由高到低順序依次為:65%乙醇>75%乙醇>95%乙醇,這可能是由于砂仁中含有多糖、黃酮苷類等非揮發性成分物質,隨著乙醇濃度升高溶劑極性降低,導致非揮發性成分溶出減少,醇提物得率逐漸降低[16-18]。此外,砂仁中的揮發油也易溶于極性較高的溶液中。醇提物鹽制砂仁的得率整體都大于砂仁生品,推測由于鹽制過程中高溫致使部分有效成分的化學性質發生變化,部分有效成分溶出增加,得率增加[19-20]。但不同濃度醇提物的抑菌效果可能存在差異,故本實驗進一步考察了不同濃度醇提物的抑菌效果。

表1 砂仁生品與鹽制砂仁不同濃度乙醇浸提物得率(%)Table 1 Extract rates of Fructus amomi and itssalt-processed products with different concentration ethanol(%)

2.2 砂仁生品與鹽制砂仁不同濃度乙醇浸提物抑菌效果比較分析

由圖1可知,對于砂仁生品來說,與對照組相比,95%和75%乙醇浸提物對于3種供試菌的抑制效果明顯,且二者均優于65%乙醇浸提物,但95%和75%乙醇浸提物之間差異無顯著性。65%乙醇浸提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌無抑制效果;對枯草芽孢桿菌具有一定的抑制效果。因此,對于砂仁生品,95%乙醇浸提物對3種供試菌的抑菌效果最好。

圖1 砂仁生品和鹽制砂仁不同濃度乙醇提取物抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of different ethanol extractsmade from Fructus amomi and salt-processed products注:A、B、C分別表示供試菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌;不同的小寫字母代表同一砂仁制品(砂仁生品或鹽制砂仁)不同濃度乙醇提取物對同一種菌的抑制效果差異顯著,P<0.05;*代表相同乙醇濃度砂仁生品和鹽制砂仁提取物對同一種菌的抑制效果差異顯著,P<0.05;**代表差異極顯著,P<0.01;圖2、圖4同。

對于鹽制砂仁來說,95%乙醇提取物對于3種供試菌的抑制效果均優于75%乙醇浸提物。65%乙醇浸提物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均無抑制效果,但對金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著(P<0.05),抑菌圈直徑與95%乙醇相同,均顯著(P<0.05)高于75%乙醇浸提物。此外,95%乙醇提取物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果與75%、65%乙醇浸提物抑制效果相比,均差異顯著(P<0.05),但后兩者之間則無顯著差異。因此,對于鹽制砂仁來說,同樣是95%乙醇浸提物對三種供試菌的抑制效果最好。

對比同一濃度的乙醇浸提物抑菌效果發現,砂仁生品95%乙醇浸提物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果均顯著優于鹽制砂仁(P<0.05),而對大腸桿菌的抑制效果一致,抑菌圈直徑均為8.75 mm。砂仁生品75%乙醇提取物對3種供試菌的抑菌圈直徑均大于鹽制砂仁,呈顯著差異(P<0.05)。此外,砂仁生品和鹽制砂仁65%乙醇浸提物分別對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,其余全無抑制效果。黃酮和精油是砂仁中起抑菌作用的主要成分,但精油易揮發,在砂仁醇提物中起到抑菌作用的多為黃酮類物質[6,7,21]。此外,研究發現高濃度的乙醇或甲醇是提取砂仁中黃酮類物質的有效溶劑[7,16,22],這與本實驗所得的結果一致,故綜合考慮,本文后續實驗選擇95%乙醇作為砂仁生品和鹽制砂仁的提取溶劑,提取有效成分,并通過冷凍干燥、無菌水復溶,制成0.1 g/mL的醇浸提溶液用于后續實驗。

圖3 砂仁生品和鹽制砂仁不同溶劑萃取物抑菌效果平板直觀圖Fig.3 Illustrative diagram of bacteriostatic effect of different extracts madefrom Fructus amomi and its salt-processed products in plates

2.3 不同溶劑萃取物抑菌效果比較分析

依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取醇提物,無菌水復溶后制得不同萃取物溶液。由圖2、圖3可知,不同溶劑萃取物的抑菌效果差異較大,對于砂仁生品來說,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水層萃取物對3種菌的抑制效果趨勢一致,均為石油醚>乙酸乙酯>正丁醇 ≥ 水層。除與乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌抑制效果相比無顯著差異外,石油醚萃取物對3種菌的抑菌圈直徑與乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層萃取物相比,均呈顯著差異(P<0.05)。乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌的抑制效果顯著優于正丁醇(無抑菌效果)(P<0.05),但作用于金黃色葡球菌和枯草芽孢桿菌時則無顯著差異。此外,橫向比較發現,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物對3種菌的抑制效果順序分別為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌,大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。由此可知,不同溶劑萃取物對供試菌的抑制效果不同,但其抑制效果均為逐級遞減,推測抑菌活性物質多保留在石油醚萃取物,且在逐級萃取過程中有所損失。

圖2 砂仁生品和鹽制砂仁不同溶劑萃取物抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of different extracts madefrom Fructus amomi and its salt-processed products

對比鹽制砂仁不同溶劑萃取物對3種菌的抑制效果發現,其與砂仁生品變化規律一致,均為石油醚>乙酸乙酯>正丁醇 ≥ 水層。供試菌為大腸桿菌時,石油醚與乙酸乙酯萃取物抑菌效果無顯著差異,而之于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌則差異顯著(P<0.05)。石油醚與正丁醇萃取物對于3種菌的抑菌圈直徑之間則均為顯著差異(P<0.05)。乙酸乙酯與正丁醇萃取物對3種菌的抑制效果,僅作用于枯草芽孢桿菌時,二者之間差異顯著(P<0.05),而對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌則無顯著差異。此外,橫向比較結果顯示,石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌抑制效果最優,其次為大腸桿菌,金黃色葡萄球菌次之;乙酸乙酯和正丁醇萃取物對3種菌的抑制效果同石油醚萃取物變化規律一致,抑菌圈直徑均為:枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌。該實驗結果表明,砂仁經過鹽制后,其抑菌成分發生了一些變化。與砂仁生品相比,不同溶劑萃取物對3種供試菌的抑制效果已有所變化,但具體是哪些成分發生了變化需要進一步研究。

對比砂仁生品與鹽制砂仁相同溶劑萃取物抑菌效果發現,砂仁生品石油醚萃取物對3種菌的抑制效果均優于鹽制砂仁,且對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果呈顯著差異(P<0.05)、對金黃色葡萄球菌的抑制效果呈極顯著差異(P<0.01)。砂仁生品乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果同樣優于鹽制砂仁,且對前者的抑制效果呈顯著差異(P<0.05);而砂仁生品、鹽制砂仁正丁醇萃取物對3種菌的抑制效果之間則無顯著差異。總體來看,砂仁生品的抑菌效果明顯優于鹽制砂仁,最主要的原因是砂仁鹽制過程破壞了抑菌成分,如砂仁精油[23],但鹽制砂仁溫而不燥,在理氣安胎、溫腎縮尿等臨床方面具有良好的效果[4]。

圖5 石油醚萃取物的抑菌效果直觀圖Fig.5 Illustrative diagram of bacteriostatic effect of petroleum ether extract made from Fructus amomi and its salt-processed products

2.4 石油醚萃取物抑菌譜測定結果

選取對3種菌具有較好抑制效果的石油醚萃取物進行梯度稀釋,考察其抑菌譜。由圖4、圖5可知,隨著稀釋倍數的遞增,砂仁生品和鹽制砂仁的抑圈直徑逐漸變小,直至1000倍時的無任何抑制作用。在各稀釋倍數條件下,砂仁生品石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌抑制效果最優,其次為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。不同鹽制砂仁石油醚萃取物稀釋濃度對3種供試菌的抑制效果變化規律同砂仁生品一致。

圖4 砂仁生品和鹽制砂仁石油醚萃取物抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of petroleum ether extract madefrom Fructus amomi and its salt-processed products

此外,無論是石油醚萃取物原液濃度,還是將其稀釋10倍、100倍,砂仁生品對3種菌的抑菌效果均要好于鹽制砂仁,尤其是對枯草芽孢桿菌的抑制效果,在原液和10倍稀釋條件下,砂仁生品與鹽制砂仁之間的抑菌效果均呈顯著差異(P<0.05)。

2.5 石油醚萃取物對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)的測定

由表2可知,砂仁生品的石油醚萃取物對3種菌的的MIC值均小于鹽制砂仁,進一步說明,砂仁生品的抑菌效果優于鹽制砂仁,其中砂仁生品的石油醚萃取物對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好,為0.23 mg/mL。

表2 砂仁石油醚萃取物對3種供試菌的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration(MIC)ofpetroleum ether extracts against the

3 結論

砂仁生品不同溶劑萃取物抑菌效果顯著(P<0.05)優于鹽制砂仁,95%乙醇提取物的對3種供試菌的抑制效果優于75%、65%乙醇提取物,且不同溶劑萃取物對3種供試菌的抑制效果順序為:石油醚>乙酸乙酯>正丁醇 ≥ 水層。此外,砂仁生品、鹽制砂仁石油醚萃取物對3種菌的抑制能力順序分別為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌,枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌,推測這種差異是由于鹽炙改變了砂仁中的抑菌活性成分造成的。