枯草芽孢桿菌β甘露聚糖酶的克隆表達及重組酶性質(zhì)研究

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(1.湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學),湖北宜昌 443002;2.生物催化宜昌市重點實驗室(三峽大學),湖北宜昌 443002;3.三峽大學生物與制藥學院,湖北宜昌 443002)

圖1 β-甘露聚糖酶作用位點Fig.1 Conceptual diagram of action from β-mannanase

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)屬于半纖維素酶類,是一類能夠切斷甘露聚糖(包括線性甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖等)主鏈中β-1,4-D-甘露糖苷鍵(圖1)的內(nèi)切水解酶[1-3],水解產(chǎn)生的甘露低聚糖具有優(yōu)異的生理活性,能夠有效改善腸道環(huán)境和功能,增強人體機能,是一種優(yōu)良的保健品。甘露聚糖酶在食品、飼料、醫(yī)藥、生物能源等的開發(fā)領(lǐng)域具有較大的應用價值,同時也是降解植物生物量的重要自然資源[4-5]。

甘露聚糖酶在自然界中普遍存在[6-7],微生物是其最主要的生產(chǎn)來源[8],而細菌產(chǎn)的β-甘露聚糖酶比真菌來源的溫度穩(wěn)定性更好,尤其是以芽孢桿菌來源的甘露聚糖酶[9]。雖然目前有大量不同種類不同來源的β-甘露聚糖酶被發(fā)現(xiàn),但野生型β-甘露聚糖酶[10]尚不能完全滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求,酶學性質(zhì)上都存在一定的缺陷[11],如野生型甘露聚糖酶活性較低,部分野生型甘露聚糖酶對于魔芋粉的降解能力較差,無法充分利用我國豐富的魔芋資源。通過異源表達提高β-甘露聚糖酶的酶活和適用范圍,獲取活性較高的、生產(chǎn)成本較低的甘露聚糖酶,進一步拓寬魔芋的應用范圍,開發(fā)高附加值的魔芋產(chǎn)品,無疑是甘露聚糖酶進一步擴大應用市場的重要方式。目前已經(jīng)實現(xiàn)了甘露聚糖酶基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母、黑曲霉和里氏木霉中的成功表達[12-18],馬威等[19]將枯草芽孢桿菌MA139中的β-甘露聚糖酶基因進行優(yōu)化設(shè)計并在畢赤酵母X-33中進行表達,10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)誘導72 h時,可達到最大酶活2100 U/mL,異源表達后甘露聚糖酶酶學性質(zhì)更優(yōu)良。但目前對魔芋葡甘聚糖具有高度專一性的β-甘露聚糖酶的克隆表達及性質(zhì)解析仍有待進一步深入。

本實驗室前期以魔芋粉為唯一碳源,從土壤中定向篩選出可高效降解魔芋葡甘聚糖為魔芋低聚糖的細菌BacillussubtilisG1[20]。本文擬將B.subtilisG1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行高效表達,利用表達載體中的His-Tag編碼序列對重組酶進行分離純化,并研究重組蛋白的酶學性質(zhì),為深入了解其在分子水平上的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其進一步應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌G1(BacillussubtilisG1)、EscherichiacoilDH5α、E.coilBL21(DE3) 本實驗室保存菌株;質(zhì)粒pACYCDuet-1、Taq DNA polymerase、DL 5000 bp Marker、蛋白質(zhì)電泳Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液 TAKARA有限公司;BamH I和HindIII限制性內(nèi)切酶 上海生工生物工程有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 Vazyme生物技術(shù)有限公司;魔芋粉 宜昌一致魔芋公司 葡甘聚糖純度>95%;瓜爾膠 源葉生物 分析純;刺槐豆膠 SIGMA公司 分析純;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,純度>99.9%) Calbiochem公司;其它試劑國產(chǎn)或進口分析純;PCR引物合成及測序 上海生工生物技術(shù)有限公司。

C1000 Touch PCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀 Bio-Rad公司;UV1800紫外可見分光光度計 島津企業(yè)管理有限公司;SX-700蒸汽滅菌器、MX-307落地高速冷凍離心機 日本Tomy公司;NanoDrop One超微量紫外可見分光光度計 Thermo公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZQLY-180S恒溫培養(yǎng)搖床 上海知楚儀器有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱 泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建 依據(jù)TIANamp Soil DNA Kit試劑盒的方法從B.subtilisG1提取基因組DNA,根據(jù)文獻報道的β-甘露聚糖酶基因序列及表達載體pACYCDuet-1的多克隆位點設(shè)計引物。引物設(shè)計如下:上游引物Man-F:5′-CAGCCAGGATCCAGGGGAGTTGCATTTG-3′(下劃線處為BamH I酶切位點),下游引物Man-R:5′-GGCCGCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTAAAG-3′(下劃線處為HindIII酶切位點)。

PCR反應體系:1 μL基因組DNA模板,2 μL Man-F(10 μmol/L),2 μL Man-R(10 μmol/L),25 μL Prime STAR MAX Premix(2X),20 μL ddH2O。PCR擴增反應條件:98 ℃預變性10 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 30 s,30個循環(huán),最后72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收擴增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

將質(zhì)粒pACYCDuet-1經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切,膠回收目的條帶,與經(jīng)同樣雙酶切的目的基因PCR產(chǎn)物通過T4連接酶16 ℃過夜連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,涂布于含100 μg/mL氯霉素的LB平板上,37 ℃避光培養(yǎng),篩選陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)提取質(zhì)粒,經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切驗證及送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序,將驗證正確的克隆載體命名為pACYCDuet-1-BsmanA(如圖2)。

圖2 重組表達載體pACYCDuet-1-BsmanA結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structural schematic diagram of recombinantexpression vector pACYCDuet-1-BsmanA

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 將重組表達載體pACYCDuet-1-BsmanA轉(zhuǎn)入表達宿主E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細胞中,涂布于含100 g/mL氯霉素的LB抗性平板上,篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將驗證正確的含有pACYCDuet-1-BsmanA的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于含100 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)14 h。按OD600為0.1的接種量轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)OD600至0.6。加入誘導劑IPTG使其終濃度為0.8 mmol/L,于20 ℃,160 r/min誘導表達8 h后4 ℃、11000 r/min離心10 min收集菌體。用50 mmol/L、pH6.5的磷酸緩沖液洗滌菌體3次后,按菌體與緩沖液1∶10的比例加0.05 mol/L磷酸緩沖液重懸細胞,超聲波破碎后于4 ℃、11000 r/min離心30 min收集上清液。

本實驗pACYCDuet-1-BsmanA中含有His-Tag編碼序列,采用Ni-NTA柱純化目標蛋白的方法純化,將目的蛋白上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱,分別用10 mL含20、40和300 mmol/L咪唑的緩沖液進行洗脫,并按照每流出液1 mL為1毫分收集,收集活性部分保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶活力及蛋白質(zhì)的分析 酶活力的定義及測定方法參見文獻[21],重組蛋白分析采用SDS-PAGE[22],濃縮膠5%,分離膠10%,考馬斯亮藍R-250染色顯示蛋白帶;蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法[23]。

1.2.4 重組酶酶學性質(zhì)研究

1.2.4.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 將純化后的β-甘露聚糖酶用pH6.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液稀釋,分別于30～80 ℃的溫度下保溫10 min,測定酶活力,研究溫度對酶促反應的影響;將酶液置于50～80 ℃下保溫90 min,每隔10 min取樣測定酶活力,研究酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.2.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 分別在60 ℃,pH3.0～8.0的條件測定β-甘露聚糖酶的酶活力,研究酶的最適pH;將酶液加入上述不同梯度pH的緩沖液中稀釋,置于4 ℃條件下放置1 h后測定其殘留酶活力,研究酶在不同pH下的穩(wěn)定性。

1.2.4.3 酶的反應動力學分析 用pH6.5、50 mmol/L的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液配制質(zhì)量濃度為5 g/L的魔芋粉、瓜爾膠、刺槐豆膠,測定β-甘露聚糖酶對不同底物的催化活力。以不同濃度(3～10 g/L)魔芋粉、瓜爾膠、刺槐豆膠(用pH6.5的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液配制)為底物,在pH6.5,60 ℃的條件下測定酶的催化活力,Km和Vmax值通過Linewear-Burk方法[24]得到。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast對PCR擴增的基因序列進行在線比對,采用DNA STAR進行蛋白的多序列比對并繪制質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA圖譜;采用Excel對重組酶酶學性質(zhì)數(shù)據(jù)作圖;采用Oridin 9.5軟件并進行非線性擬合,計算β-甘露聚糖酶的Km和Vmax值。實驗重復3次取平均值為最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-甘露聚糖酶(BsmanA)基因的表達與純化

2.1.1 基因的擴增及序列分析 PCR擴增結(jié)果如圖3所示,獲得一條約為1100 bp的特異性單一亮條帶,與預期條帶大小一致。

圖3 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of the PCR amplification products注:M為DL 5000 DNA Marker;泳道1、2為BsmanA基因。

將擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后送至上海生工生物工程公司進行測序,對測序結(jié)果通過在線BLAST程序?qū)ENBANK中登錄的基因和蛋白質(zhì)序列進行比對發(fā)現(xiàn),擴增所獲得的基因序列及推斷的蛋白質(zhì)序列與GenBank中已經(jīng)登錄的枯草芽孢桿菌WL-7和枯草芽孢桿菌CICC9011中的β-甘露聚糖酶基因和蛋白質(zhì)序列具有高度一致性,最高分別達到99%和98%,初步鑒定擴增的基因為β-甘露聚糖酶基因,將其命名為BsmanA基因。

2.1.2 表達載體的構(gòu)建 將上述PCR擴增所得產(chǎn)物純化后,與質(zhì)粒pACYCDuet-1分別用BamH I和HindIII雙酶切(如圖4),酶切位點位于目的基因兩端,經(jīng)雙酶切后目的基因大小變化很小,電泳結(jié)果與預期相符,膠回收產(chǎn)物后將分別經(jīng)酶切的載體pACYCDuet-1與PCR產(chǎn)物通過T4連接酶過夜連接,得到重組表達質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA。

圖4 PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒進行雙酶切Fig.4 Double digestion of PCR products and plasmids注:M為DL5000 DNA Marker;泳道1為目的基因BsmanA;泳道2為BamH I和Hind III雙酶切目的基因BsmanA;泳道3為BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道4為質(zhì)粒pACYCDuet-1。

對篩選到的陽性克隆pACYCDuet-1-BsmanA再次用BamH I和HindIII進行雙酶切(圖5),1號泳道為BamH I和HindIII雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1結(jié)果,于5000 bp位置附近可見一條清晰地條帶,3號泳道為雙酶切結(jié)果,可以清晰觀察到5000和1100 bp附近兩條電泳帶,條帶大小與質(zhì)粒及目的基因大小相符,可初步驗證目的基因BsmanA成功連接至pACYCDuet-1。

圖6 重組蛋白氨基酸序列比對Fig.6 Amino acid sequence alignment of recombinant protein

圖5 重組表達質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA的酶切電泳圖譜Fig.5 Digestion Electrophoresis of Recombinant ExpressionPlasmid pACYCDuet-1-BsmanA注:M為DL5000 DNA Marker;泳道1為BamH I和Hind III雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道2為質(zhì)粒pACYCDuet-1;泳道3為BamH I和Hind III雙酶切重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-BsmanA。

2.1.3 序列分析 將酶切驗證正確的質(zhì)粒送至上海生工公司測序,并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對,結(jié)果顯示:該β-甘露聚糖酶基因的序列全長為1098 bp,包含366個氨基酸的編碼序列。通過NCBI中的Blast比對β-甘露聚糖酶的氨基酸序列結(jié)果如圖6所示:該酶的氨基酸序列與芽孢桿菌屬來源的MK-2(2016)β-mannanase(man)gene(GenBank登錄號:ANG59296.1)和Bacillussubtilissubsp. subtilis str. SC-8(GenBank登錄號:EHA29041.1)的序列相似性高達99%。

2.1.4 重組蛋白的異源表達和純化 將樣品組(構(gòu)建成功的重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA)和空白組(沒有整合BsmanA基因的pACYCDuet-1空載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)中進行表達的空白菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1),分別以IPTG為誘導劑以相同的條件進行重組蛋白的誘導表達,收集的菌體經(jīng)超聲破碎破壁后測定酶活(圖7),測得空白組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1無明顯β-甘露聚糖酶活力,誘導表達的樣品組重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA破壁上清的β-甘露聚糖酶活力高達220 U/mg。而沒有IPTG誘導作用的重組菌株E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA培養(yǎng)后也無法測得甘露聚糖酶活性。由此可證明,枯草芽孢桿菌G1中的β-甘露聚糖酶基因BsmanA成功地在大腸桿菌中獲得了表達。

圖7 重組菌株與空載菌株酶活檢測Fig.7 Enzyme activity detection ofrecombinant and empty strains

重組菌菌體破壁上清液蛋白SDS-PAGE電泳分析如圖8所示,重組菌E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-BsmanA在IPTG誘導下進行異源表達的β-甘露聚糖酶含有His標簽,經(jīng)鎳柱親和層析純化后,與重組菌菌體破壁上清液相比,純化后的目的蛋白條帶較單一,目的條帶分子量約為38 kD,與預期相符,這與已報道的BacillussubtilisBCC41051[25]中的β-甘露聚糖酶蛋白分子量相近,均為38 kD。

圖8 重組蛋白純化SDS-PAGE電泳Fig.8 Purification of SDS-PAGEelectrophoresis by recombinant protein 注:M為蛋白Marker;泳道1為40 mmol/L咪唑平衡緩沖液第10毫分;泳道2為40 mmol/L咪唑平衡緩沖液第1毫分;泳道3為20 mmol/L咪唑平衡緩沖液第6毫分;泳道4為粗酶液。

2.2 BsmanA的酶學性質(zhì)

2.2.1 最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性 溫度對重組甘露聚糖酶活力的影響結(jié)果如圖9所示,酶的最適溫度為60 ℃,在45～70 ℃間保持60%以上的酶活,由Srivastava等[26]研究可知,微生物來源的甘露聚糖酶在37～70 ℃的不同溫度下具有活性,從各種芽孢桿菌分離出的甘露聚糖酶在50～70 ℃范圍內(nèi)具有活性。一般來說,細菌甘露聚糖酶比真菌甘露聚糖酶更耐熱,這是紙漿漂白等工業(yè)應用的一個重要特性。將該重組酶置于不同溫度下孵育90 min后,測定其剩余酶活力的結(jié)果顯示,在50～70 ℃保溫70 min時,剩余酶活力在70%以上,可以認為具有較好的熱穩(wěn)定性;當處理溫度提高至80 ℃以上,酶活顯著降低。

圖9 重組甘露聚糖酶最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.9 Optimum reaction temperature and temperaturestability of recombinant mannanase注:A:重組β-甘露聚糖酶的最適溫度;B:重組β-甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。

圖10 重組甘露聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.10 Optimum pH and pH stability of recombinant mannanase注:A:重組β-甘露聚糖酶的最適pH;B:重組β-甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性。

2.2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 不同pH對重組甘露聚糖酶活力的影響結(jié)果如圖10所示,純化后的甘露聚糖酶蛋白在pH6.5條件下酶活最高,且在pH5.0～7.0之間表現(xiàn)出顯著(P<0.05)活性,保留最高酶活79%以上的活性。酸堿度對酶功能的影響與酶底物復合物的形成有關(guān),催化作用往往依賴于酶和底物上的電荷分布。據(jù)報道,細菌來源的甘露聚糖酶在中性至堿性的pH下具有最大活性,例如Srivastava等[27]研究報道的Bacillussp. CFR1601產(chǎn)的一種β-甘露聚糖酶(GH-26)在pH7下具有最佳活性。在pH穩(wěn)定性方面,許多真菌來源獲得的-β-甘露聚糖酶在酸性到中性范圍(pH4.0～7.0)內(nèi)可保持最高酶活的80%活性,細菌甘露聚糖酶在pH6.0～9.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性[26],本實驗中,在pH4.5～7.0,重組酶的酶活表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性,于4 ℃保溫1 h,剩余酶活仍達75%以上。

2.2.3β-甘露聚糖酶的反應動力學分析 通過改變底物的濃度,測定純化后的重組甘露聚糖酶對不同底物的活性,結(jié)果顯示重組酶對魔芋粉精粉催化活性最高,將其對魔芋粉的催化活性定為100%,該酶對刺槐豆膠和瓜爾膠的催化活性遠低于魔芋精粉,相對酶活分別為20.9%和0.08%。重組甘露聚糖酶對魔芋粉的Km和Vmax值分別為4.09 mg/mL和9.86 μmol/(mL·min)。

3 結(jié)論

本文從魔芋生長的土壤里分離出一株具有甘露聚糖水解能力的枯草芽孢桿菌G1,研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的甘露聚糖酶對魔芋粉水解效率較高,能水解魔芋粉中的魔芋葡甘聚糖得到魔芋低聚糖,有效提高魔芋的深加工利用價值。

本研究中成功克隆枯草芽孢桿菌G1中的甘露聚糖酶BsmanA編碼基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了異源表達,重組β-甘露聚糖酶為胞內(nèi)酶,對魔芋粉的比活性為220 U/mg,純化后的酶學性質(zhì)研究表明,該酶的最適反應溫度為60 ℃;在50 ℃處理90 min 后殘留酶活性為64%,80 ℃處理30 min后殘留酶活性為35%;其最適pH為6.5,在pH4.5～7.0的范圍內(nèi)較穩(wěn)定;所測酶的最適底物為魔芋粉,其對魔芋粉的Km和Vmax值分別為4.09 mg/mL和9.86 μmol/(mL·min)。本研究描述了BsmanA的克隆和詳細的序列分析,這些研究為生物催化制備低聚甘露糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),展示了其在食品和動物飼料技術(shù)中的潛在應用價值,也為其它新酶在的基因進一步開發(fā)和應用上提供了新的思路和策略。