干酪乳桿菌yhaI基因敲除菌株的構建及其耐藥表型的分析

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(1.東北農業大學,國家乳業工程技術研究中心,黑龍江省綠色食品科學研究院,黑龍江哈爾濱 150030;2.內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,農業農村部奶制品加工重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

在醫學和農業領域內,抗生素被廣泛使用,導致細菌在抗生素應激環境中進行適應性進化,逐漸適應環境,最終使得抗生素失去效果。因此,抗生素耐藥性成為了全球關注熱點[1]。現在有大量關于抗生素抗性機制和致病菌在抗生素環境下基因組穩定性的研究[2]。制定一個防治抗生素耐藥性傳播的方法至關重要[3],其最好的方法是尋找一個可以替代或者輔助的藥物從而減少抗生素的使用[4]。目前,益生菌聯合抗生素被用于治療胃腸道疾病,并且在臨床上取得一定療效[5]。人們對益生菌在改善人類健康和臨床實踐中的應用越來越重視[6],益生菌在長期接觸抗生素環境中產生的適應性進化成為了主要研究內容[7]。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

注：a引物中添加的限制性內切酶序列由下劃線標出。

目前有大部分關于致病菌在抗生素環境中進化機制的研究,對乳酸菌適應機制的研究較少。而且有文獻報道關于乳酸菌通過點突變可以獲得抗生素耐藥性[8]。所以,在適應性進化過程中發生的點突變也不應該被忽視[9]。蛋白質組學研究技術是分析在不同培養條件下,細胞之間的功能差異的最好的方法之一[10]。然而基因敲除技術又是研究基因功能最有效的方法之一,它依據同源重組理論,通過構建帶有同源序列的基因敲除載體,將其轉入細胞,取代野生型的等位基因,最后通過分析突變體的表型從而確定基因功能[11]。

課題組前期研究結果顯示,干酪乳桿菌Zhang在適應抗生素環境過程中的耐藥表型有所變化,基因組相對穩定[12]。與干酪乳桿菌Zhang相比,1200代適應性進化菌株的yhaI基因顯著上調,可能與菌株的耐藥表型有關[13]。為了深入研究yhaI基因是否與耐藥表型相關,本研究采用Cre/lox基因重組技術將其敲除,并對突變體的表型進行驗證。本研究成功的構建干酪乳桿菌Zhang的基因敲除技術,并且進一步鑒定yhaI基因對干酪乳桿菌Zhang適應慶大霉素環境的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在慶大霉素中連續培養1200代的干酪乳桿菌Zhang[14]內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供;大腸桿菌DH5α[15]澤生生物有限公司;pNZ5319質粒[16]荷蘭瓦格寧根大學惠贈;pMSPcre質粒[17]山東大學孔健教授惠贈;高保真TransStart?FastPfuDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公式;限制性內切酶、T4連接酶 美國New England Biolabs公司;紅霉素(Ery)、氯霉素(Cm) 購自美國Sigma公司;實驗所用引物 根據GenBank報道yhaI的基因序列(GenBank accession number CP001084.2)使用Primer premier 5.0軟件分別設計長度為1 kb左右的上、下游同源臂引物(表1) 上海桑尼生物科技有限公司。

2720 Thermal Cycler PCR儀 購自美國Applied Biosystems公司;DYY-12電泳儀 購自北京六一電子儀器廠;凝膠成像系統 購自美國UVP公司;MicroPulser TM電擊儀 購自美國BIO-RAD;DU800分光光度計 美國BECKMA。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌和大腸桿菌的培養條件 乳酸菌用MRS固體培養基,添加的紅霉素終濃度為5 μg/mL,氯霉素終濃度為10 μg/mL;使用前需濾菌(0.22 μm孔徑濾膜),培養溫度為37 ℃。

大腸桿菌的培養用LB培養基紅霉素或氯霉素在培養基中的終濃度分別為250和10 μg/mL;37 ℃、300 r/min搖床培養。

1.2.2 目的基因同源臂擴增及敲除載體的構建

1.2.2.1 目的基因同源臂擴增 PCR反應以L.caseiZhang-G-1200基因組為模板,利用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)進行基因組的提取,然后利用高保真TransStart?FastPfuDNA Polymerase擴增出yhaI基因上下游各約1000 bp的片段,擴增引物為yhaI upF/R、yhaI downF/R(表1)。PCR反應體系為50 μL:模板DNA 1.5 μL,上下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,5×TransStart?FastPfuBuffer 10 μL,高保真聚合酶0.5 μL,ddH2O補足50 μL。PCR條件為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.2.2 敲除載體pNZ5319-yhaIUp-Down的構建和克隆 將純化后的上、下游同源臂片段分別插入到pNZ5319質粒的XohI、PemI和Eco53kI、BglII酶切位點中。42 ℃轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行克隆,用氯霉素(10 μg/mL)在LB平板上篩選陽性克隆。用引物yhaI upF、85R和87F、yhaI downR進行PCR擴增,送樣于上海桑尼公司進行測序,驗證插入序列的正確性。

1.2.3 乳酸菌感受態的制備和敲除載體的電轉化

1.2.3.1 乳酸菌感受態的制備 將活化2代后的乳桿菌接種到MRS液體培養基中,37 ℃培養12 h;按2%接種量接種到溶液I(MRS+0.75 mol/L山梨醇+0.1%甘氨酸)中,37 ℃培養至OD值0.3～0.6;6000 r/min 4 ℃離心5 min,收集3 mL菌體細胞;用1 mL預冷的溶液II(1 mol/L蔗糖+3.5 mmol/L MgCl2·6H2O)洗滌細胞,6000 r/min 4 ℃離心5 min,去除上清液,反復洗滌3次;用40 μL冰浴的溶液II重懸菌體細胞,用于電轉化乳桿菌。

1.2.3.2 敲除載體的電轉化 取無菌電轉化杯冰上預冷10 min;取40 μL冰浴的感受態細胞懸浮液,加入1 μg上述1.2.2.2構建好的載體質粒DNA,吹吸混勻,冰浴10 min;轉移混合液至電轉化杯,冰浴10 min。設置電轉參數:干酪乳桿菌參數為電壓1.7 kV(2 mm電極杯),電阻200 Ω,電容為25 μF。將電轉化杯迅速擦干,放入電擊槽中,進行電擊轉化;向轉化后的電轉化杯中加入960 μL預冷的復蘇液(MRS+0.75 mol/L山梨醇+10 mmol/L CaCl2+100 mmol/L MgCl2),冰上放置5 min;將液體移入無菌Eppendorf管中,37 ℃靜止培養3 h,將細胞涂布到含有5 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上,37 ℃培養48 h,長出的菌落即為轉化子。感受態細胞要現用現制備。

1.2.4 雙交換子L.caseiZhang-G-1200-yhaI::lox66-P32-cat-lox71的篩選 挑取多個單菌落活化于含氯霉素(10 μg/mL)的MRS培養基中,培養24 h后分別接種在氯霉素(10 μg/mL)和紅霉素(5 μg/mL)MRS培養基中,篩選具有氯霉素抗性無紅霉素抗性的重組子,同時將原始菌株L.caseiZhang-G-1200分別接種于含氯霉素和紅霉素的MRS培養基中作為對照。將篩選到的有氯霉素抗性無紅霉素抗性的重組子(雙交換子)和原始菌株分別用5對引物(yhaI upF/yhaI downR、EryintF/EryintR、CatF/CatR、yhaI upF/CatR和CatF/yhaI downR)擴增,電泳比較PCR產物條帶大小并將后者送到上海桑尼生物科技有限公司進行測序驗證。

1.2.5 突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI的構建 通過電轉化的方法將pMSPcre轉入以上篩選到的氯霉素抗性雙交換子中。涂布于含紅霉素的MRS平板上,37 ℃培養48～72 h。篩選出具紅霉素抗性無氯霉素抗性的菌株。將以上篩選的菌株在無抗生素培養基中37 ℃連續傳10代使pMSPcre丟失,進行PCR驗證。PCR所用引物為EryintF/EryintR、CreF/CreR和CatF/CatR,以傳代之前菌為對照。同時將篩選到的突變株再次用同源臂引物yhaI upF/yhaI downR進行PCR擴增,送到上海桑尼生物科技有限公司進行測序驗證。

1.2.6 突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI耐藥表型分析 采用稀釋法[18]測定突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI對慶大霉素的最小抑制濃度,以及在不同濃度的慶大霉素環境下,突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI的活菌數、濁度和pH,以原始菌株為對照。從而分析突變株與野生型生長特性的差異。

1.3 數據處理

利用origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 敲除載體pNZ5319-yhaI Up-Down的構建

將在含有氯霉素(10 μg/mL)的LB平板上篩選的陽性克隆體進行PCR驗證。泳道1、2分別用引物yhaI upF、yhaI upR和yhaI upF、85R擴增,泳道3、4分別用引物yhaI downF、yhaI downR和 87F、yhaI downR擴增,每對擴增產物大概差異200 bp左右。結果如圖1所示,電泳結果與預期一致,說明前后臂已經成功插入pNZ5319質粒。并且測序結果說明各序列均正確。載體pNZ5319-yhaI Up-Down成功構建。

圖1 敲除載體的構建Fig.1 Construction of knockout vectors注:M:marker;泳道1代表用引物yhaI upF、85R對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進行擴增;泳道2代表用引物yhaI upF、yhaI upR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進行擴增;泳道3代表用引物87F、yhaI downR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進行擴增;泳道4代表用引物yhaI downF、yhaI downR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進行擴增的電泳圖。

2.2 基因敲除載體的電轉化

將敲除載體pNZ5319-yhaI Up-Down經電擊轉化L.caseiZhang-G-1200,涂布于含氯霉素(10 μg/mL)和紅霉素(5 μg/mL)MRS培養基中,篩選出5個含有氯霉素抗性無紅霉素抗性的雙交換子。用引物yhaI upF/yhaI downR、EryintF/EryintR、CatF/CatR、yhaI upF/CatR和CatF/yhaI downR進行驗證,原始菌株和pNZ5319質粒為對照。由圖2可以看出,只有質粒有紅霉素基因,所以只有泳道2有條帶;氯霉素基因只有原始菌株沒有,所以泳道9沒有條帶,泳道10～15本應該都有條帶,但可能因為特異性差所以未出現條帶;在質粒與轉化子中用前臂F,Cat R及Cat F和后臂R引物擴增均出現條帶,如泳道17～22和25～30所示,說明Cat基因片段確實已經連入目的基因的前后臂中;由于在質粒與轉化子中較原始菌株多了氯霉素抗性基因片段(所加入的包含氯霉素抗性基因在內的片段>所敲除的目的基因片段),因此質粒與轉化子中的全長片段要大于原始菌株,如泳道31～37所示。結果與預期的一致,并且測序結果顯示各序列均正確。成功的篩選到雙交換子。

2.3 突變株L. casei Zhang-G-1200-yhaI的構建

將pMSPcre質粒電轉入上述的雙交換子中,涂布含紅霉素的MRS平板上,篩選出具有紅霉素抗性沒有氯霉素抗性的菌株。并在無抗生素的培養基中連續傳10代使pMSPcre質粒丟失。用引物EryintF/EryintR、CreF/CreR、CatF/CatR和yhaI upF、yhaI downR驗證,原始菌株和質粒為對照，驗證結果如圖3所示。在突變體中都沒有紅霉素、氯霉素和Cre基因,并且測序結果顯示各序列都正確。說明成功構建突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI。

圖3 突變體的PCR驗證Fig.3 Mutant verified by PCR analysis注:泳道1、2為原始菌株和突變株分別用引物yhaI upF、yhaI downR的PCR產物,泳道3～5對應的引物為EryintF/EryintR,泳道6～8所用引物為CatF/CatR,泳道9～11引物為CreF/CreR,它們所對應的模板分別為質粒(泳道3、6、9),原始菌株(泳道4、7、10)和突變體(泳道5、8、11)。

2.4 突變株L. casei Zhang-G-1200-yhaI的耐藥表型的分析

對突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI進行慶大霉素耐藥性分析,并且對其在不同慶大霉素濃度中的生長特性進行檢測,以原始菌株為對照。結果如圖4所示,突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI在正常培養基中生長時,和野生型菌株活菌數、濁度和pH都沒有差異,在慶大霉素濃度為8和16 μg/mL時,原始菌株的OD值是突變株的2倍左右,在慶大霉素濃度為16 μg/mL時,突變株的活菌數是原始菌株的7/10。pH也在慶大霉素濃度為16 μg/mL時不同,因為突變株在該濃度下,抑制細菌的生長繁殖,所以pH大于原始菌株。所以我們認為yhaI基因與干酪乳桿菌Zhang的耐藥性相關。

圖4 突變體在不同慶大霉素濃度下的生長特性Fig.4 Growth characteristics of mutantsat different gentamycin concentrations 注:a:pH;b:OD值;c:活菌數。

3 討論與結論

基因功能鑒定對于乳酸菌適應性進化機理的解析至關重要[19]。基因敲除是研究基因功能最有效的研究方法。目前有研究者采用Cre/lox系統構建基因敲除方法,該方法由三步組成,第一步是使用標準克隆程序構建基因特異性誘變載體;第二步是通過雙交換重組將靶基因替換為lox66-P32-cat-lox71;第三步是通過Cre瞬時表達,使靶基因位點的lox66-P32-cat-lox71形成lox72位點[16]。Cre/lox系統之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應用,是由該系統的諸多優點決定的[20-22]:Cre重組酶與具有loxP位點的DNA片斷形成復合物后,可以提供足夠的能量引發之后的DNA重組過程,因此該系統不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子;loxP位點是一段較短的DNA序列,因此非常容易合成;Cre重組酶是一種比較穩定的蛋白質,因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用;Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調控之下,從而使這種重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官,以及不同的發育階段或不同的生理條件下產生,進而發揮作用,這一點也是該系統在應用過程中最為重要的一點。

本文研究表明，yhaI基因對干酪乳桿菌Zhang的耐藥性具有調控作用,在慶大霉素濃度為8和16 μg/mL時,突變株的濁度是原始菌株的1/2;在慶大霉素濃度為16 μg/mL時,突變株的活菌數是原始菌株的7/10。目前,雖然對干酪乳桿菌Zhang的適應性進化機制并未明確,但是,該研究為干酪乳桿菌的適應性進化機制提供了一個新思路。