采后番木瓜果實炭疽病病原菌分離鑒定及其拮抗菌的篩選

王雅君1,邵遠志1,何文琪1,尤文靜1,葛春暉1,李 雯

(1.海南大學食品科學與工程學院,海南海口 570228;2.海南大學園藝學院,海南海口 570228)

番木瓜(CaricapapayaL.)又稱木瓜、乳瓜、萬壽果,是著名的熱帶和亞熱帶水果之一,我國番木瓜主要種植于廣東、海南、廣西、云南、福建、臺灣等地[1]。番木瓜營養豐富,含多種維生素,具有抗氧化活性,有“百益果王”之稱[2]。除此之外,番木瓜有一定的藥用價值,可助消化、健脾胃[3],具有預防高血壓以及防癌的保健功效[4],故深受消費者的喜愛。番木瓜屬于呼吸躍變型果實,采后成熟衰老快、易受生物和非生物脅迫的影響等特點[5],因此,番木瓜采后及貯藏運輸過程中常出現果實發病腐爛等問題。有研究表明,番木瓜采后腐爛的原因主要受到真菌的侵染作用[6],現已在番木瓜果實上已經發現15種以上的致病真菌,其中由炭疽菌(Colletotrichumsp.)引起的炭疽病是番木瓜采后貯藏與運輸的主要病害之一[7-8]。在海南,番木瓜受炭疽病菌的侵染率為20.3%～34.4%[9],由此造成了較為嚴重的經濟損失。

目前,防治番木瓜采后病害的有效措施是使用化學殺菌劑,這其中常用的化學殺菌劑有特克多、多菌靈、苯來特和甲基托布津等[10]。但長期高濃度使用化學殺菌劑可誘導病原菌產生抗藥性,其藥物殘留也對人類健康也有直接威脅[11-12]。生物防治作為一種新型、綠色、安全、能有效控制采后病害的途徑深受研究者們的關注[13]。生防菌在減少和替代化學殺菌劑的使用方面有著較大的潛力[14],其中,芽孢桿菌是目前研究最多的生防菌之一[15-16]。大量研究表明,芽孢桿菌能有效控制熱帶果實采后病害的發生,如芒果炭疽病[17]、香蕉枯萎病[18]、枇杷腐爛病及炭疽病[19]等,目前少有芽孢桿菌防控采后番木瓜病害的研究。

本研究從番木瓜炭疽病病果中分離鑒定了一株新型海南地區番木瓜炭疽病病原菌。針對此病原菌,從果園土壤中分離篩選得到一株拮抗效果較好的拮抗菌,在果實上進行了活體拮抗驗證試驗,并對可能涉及的拮抗機理進行初步研究,以期為番木瓜采后病害的生物防治技術提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發病番木瓜果實 從海南省海口、瓊海番木瓜種植地采集;番木瓜 “日升”,挑選健康、大小一致的果實,7～8成熟,海南省海口市南北水果市場選購;供試土壤 于2018年4月17日和7月13日從海南省海口、瓊海果園采集12種不同果樹根系5～20 cm的土壤,密封分裝后,立即帶回實驗室于4 ℃保存,用于拮抗菌的分離;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose ager,PDA) 新鮮去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,1000 mL蒸餾水;牛肉膏蛋白胨固體培養基 牛肉浸膏3 g,細菌學蛋白胨10 g,NaCl5 g,瓊脂18 g,1000 mL蒸餾水,培養基于121 ℃滅菌20 min后待用;Ezup柱式真菌、細菌基因組DNA抽提試劑盒、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)體系各種試劑 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑 均為分析純。

BCM-1000生物凈化工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司;ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡 南京衡橋儀器有限公司;FYL-YS-280L恒溫培養箱 北京福意電器有限公司;NRY-211恒溫培養搖床 上海南榮實驗室設備有限公司;AL-204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BIC-300人工氣候箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣液的制備 拮抗菌懸液:拮抗菌于28 ℃、200 r/min牛肉膏蛋白胨培養基中培養24 h,發酵液于10000 r/min離心10 min,棄上清后用無菌水重懸,得到菌懸液用血球計數板調節所需濃度。

無細胞濾液:將發酵液離心后,取上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后獲得。

滅菌液:將發酵液于121 ℃滅菌20 min獲得。

病原菌孢子懸液:采用無菌接種環小心刮取病原菌菌體并接種于15 mL無菌水中,隨后用紗布過濾,并使用血球計數板調節濃度至1×107孢子/mL。

1.2.2 番木瓜炭疽病病原菌的分離純化 參照袁雪等[20]的方法并稍作修改,用無菌小刀切取果實病健交界處5 mm×5 mm見方的果皮,依次用75%(V/V)的乙醇和1%(V/V)的次氯酸鈉浸泡30 s,隨后用無菌水清洗3次,濾紙吸干水分后置于PDA培養基上,于28 ℃培養3～5 d。待長出菌落后,挑取少量邊緣菌絲植入新的PDA培養基中,重復上述操作直至獲得純化菌株。將純化后的菌株保存于PDA斜面中,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 致病性檢驗 選取健康、大小一致的番木瓜用1%(V/V)的次氯酸鈉消毒1 min后用自來水沖凈、晾干。用打孔器(直徑為8 mm)在番木瓜表面刺2個1 mm深的傷口,吸取25 μL用無菌蒸餾水配制的1×107孢子/mL病原菌孢子懸浮液接種于番木瓜傷口處,以接種等量無菌水作為對照,果實置于溫度25 ℃、相對濕度為90%培養箱中培養7 d,每天記錄發病情況并計算發病率。取明顯發病的果實,按照1.2.1的方法進行病原菌再分離,觀察是否與初始分離菌株一致。其中發病率計算公式如下:

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 病原菌形態特征及初步鑒定 將純化后的病原菌接種于PDA培養基上于28 ℃下培養,記錄菌落形態特征,在光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子及孢子梗形態,參照《真菌鑒定學手冊》[21]進行病原菌初步鑒定。

1.2.4.2 病原菌分子生物學鑒定 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌DNA,使用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增,PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4.3 序列分析 將測序結果在GenBank核酸數據庫中進行Blast比對,并結合數據庫中的同源序列,利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining構建系統進化樹。

1.2.5 病原菌生物學特性研究

1.2.5.1 溫度對病原菌生長及產孢能力的影響 取于PDA培養基上培養5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,分別置于10、15、20、25、30、35和40 ℃的恒溫培養箱中培養5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.5.2 光照、pH對病原菌生長及產孢能力的影響 取于PDA培養基上培養5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,分別置于28 ℃條件下以全光照、全黑暗和12 h光暗交替3種光照處理,5 d后測量菌落直徑和產孢量。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養基pH分別調為4、5、6、7、8、9、10和11,待平板凝固后將直徑為5 mm的菌餅放置于平板中央,PDA平板于28 ℃培養5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.5.3 不同碳源對病原菌生長及產孢能力的影響 參照楊秀梅等[22]的方法,分別以葡萄糖、D-果糖、D-麥芽糖、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉和D-半乳糖作為碳源加入基礎培養基中,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于平板中央,于28 ℃培養5 d后測量菌落直徑和產孢量。

1.2.6 拮抗菌的分離純化 參照冉繼平等[23]的方法并稍加修改,取10 g土壤樣品放入90 mL無菌水中于28 ℃、100 r/min搖床振蕩2～3 h,采用平板稀釋法,將泥樣稀釋至10-3、10-4、10-5,涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基上28 ℃培養48 h,挑取形態各異的單菌落進行平板劃線分離,直至獲得單一菌落,于4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.7 拮抗菌的篩選 通過平板對峙實驗對拮抗菌進行初篩,采用濾紙片法[24]對初篩菌株進行復篩,測量抑菌帶半徑并計算拮抗指數,對拮抗效果最好的菌株進行保存。拮抗指數計算公式如下:

1.2.8 拮抗菌鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[25]觀察拮抗菌形態特征,結合生理生化特性對拮抗菌W-2進行初步鑒定。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對拮抗菌進行測序,將序列結果在GenBank核酸數據庫中進行同源性比對分析,利用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining構建系統進化樹。

1.2.9 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響 取于PDA培養基上培養5 d的病原菌,用無菌打孔器取直徑為5 mm的菌餅放置于PDA中央,參照Guardado等[26]的方法,將篩選出的拮抗菌W-2配制成濃度為1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL的菌懸液,將4片無菌濾紙片浸泡不同菌懸液后分別放置于距菌餅約30 mm處,PDA平板于28 ℃培養5 d,觀察菌絲生長情況并測量抑菌圈半徑。

1.2.10 拮抗菌對病原菌孢子萌發的影響 參照Li等[27]的方法并稍加修改,在10 mL離心管中加入100 μL用無菌蒸餾水配制的1×107孢子/mL病原菌孢子懸浮液,再加入等量的4個濃度為1×106、1×107、1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液和無菌水,于28 ℃、100 r/min振蕩培養,分別在6和12 h后通過顯微鏡400×鏡下觀察100個孢子的萌發情況,一般孢子芽管長度為孢子長度的1.5倍時視為萌發。孢子萌發率計算公式如下:

1.2.11 拮抗菌不同組分對病原菌的影響 將4片無菌濾紙片分別浸泡濃度為1×108CFU/mL的發酵液、1×108CFU/mL菌懸液、無細胞濾液、滅菌液和無菌水后分別放置于距菌餅約30 mm處,以無菌水作為對照。病原菌接種方法、培養條件及測量方法同1.2.5。

1.2.12 番木瓜果實上拮抗菌對番木瓜炭疽菌的抑制效果 將番木瓜果實按照1.2.2的方法清洗、晾干后,用無菌打孔器(直徑為8 mm)在果身刺2個1 mm深的傷口,將果實分為3組:A組:只接種50 μL無菌水,作為對照;B組:接種25 μL無菌水和25 μL濃度為1×107CFU/mL病原菌孢子懸液;C組:接種25 μL濃度為1×108CFU/mL拮抗菌懸液和25 μL濃度為1×107CFU/mL病原菌孢子懸液。將處理后的3組果實放置于25 ℃、相對濕度為90%的恒溫恒濕培養箱中培養7 d后,觀察并記錄果實的病斑直徑和發病率。

1.3 數據處理

實驗中每個處理重復3次,數據采用Excel處理,使用GraphPad Prism 5軟件繪圖,采用SPSS 17.0軟件中的Duncan法進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 番木瓜炭疽病病原菌鑒定結果與致病性檢驗分析

2.1.1 番木瓜炭疽病病原菌初步鑒定 在PDA培養基上分離純化得到番木瓜炭疽病病原菌,將其命名為WT-1。病原菌菌落呈圓形(圖1A),菌絲生長速度較為緩慢,約5～7 d長滿平板。菌絲生長初期為白色,后期變為灰白色,背部褐色至黑色(圖1B)。通過光學顯微鏡觀察,菌絲有隔膜,多分支(圖1C)。病原菌在PDA培養基上于28 ℃培養第5 d產孢,分生孢子堆為黃褐色,分生孢子呈橢圓形,單孢,中部有1個油球,內含物為顆粒狀(圖1D)。根據《真菌鑒定學手冊》,初步鑒定其為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)。

圖1 病原菌WT-1第5d菌落形態和在顯微鏡下菌絲和分生孢子形態(400×)Fig.1 Morphology of the bacterial pathogenWT-1 on the 5th day and morphology ofmycelia and conidia under the microscope(400×)注:A和B為病原菌菌落形態;C為病原菌菌絲形態;D為孢子形態。

2.1.2 病原菌致病性檢驗 本試驗將從果實病交界處分離純化獲得的病原菌進行培養,制備1×107CFU/mL孢子懸浮液接種于果實刺傷傷口,由圖2B-2可知,第3 d時,接種孢子懸浮液的番木瓜傷口處開始輕微發病,出現水漬狀圓形病斑。第6 d時,番木瓜發病率達94%,水漬狀逐漸擴大,病斑直徑達30～36 mm,病斑為暗褐色,中央凹陷,有同心輪紋(圖B-3),部分傷口中央出現橙紅色粘質粒或小黑點,這與番木瓜炭疽病發病癥狀一致(圖A-2),而對照組無發病情況(圖CK)。按照1.2.1的方法取果皮組織進行分離,得到的病原菌與WT-1具有相同的形態特征,因此驗證了病原菌WT-1為番木瓜炭疽病病原菌。

圖4 病原菌WT-1的ITS系統發育樹Fig.4 WT-1 phylogenetic tree based on ITS sequence

圖2 番木瓜炭疽病的癥狀特征和致病性檢驗圖片Fig.2 Symptoms and pathogenicity testpictures of papaya anthracnose注:圖A-1為采后第0 d番木瓜果實;圖A-2為采后自然環境下發病果實;圖B-1為接種病原菌第0 d的果實;圖B-2為接種病原菌第3 d發病果實;圖B-3為接種病原菌第6 d發病果實;圖CK為對照組,即接種無菌水第6 d的番木瓜果實。

2.1.3 病原菌分子生物學鑒定分析 利用ITS1和ITS4引物將提取的病原菌基因組DNA進行PCR擴增,擴增片段約為500～700 bp,經測序得到一條長度560 bp的ITS序列,將測序結果在GenBank核酸數據庫中進行blast比對,發現此序列與Glomerellamagna(KC815123.1)的相似性為100%。

圖3 病原菌ITS電泳圖Fig.3 Electrophoregram of pathogen ITS 注:M為DNA Ladder Mix marker;WT-1為病原菌ITS擴增產物。

采用MEGA6.0構建系統進化樹,如圖4所示,WT-1與Glomerellamagna處于同一分支,參照《植物病原真菌學》[28]可知Glomerella為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)的有性態小叢殼屬。結合形態學特征與分子生物學鑒定結果,確定菌株WT-1為番木瓜炭疽菌(Glomerellamagna)。

2.2 病原菌生物學特性研究

2.2.1 溫度對病原菌生長及產孢能力的影響 根據圖5可以看出,在不同溫度條件下病原菌菌絲均能生長,但在溫度為10和40 ℃條件下菌落直徑顯著低于其他處理組(P<0.05),而且未產生孢子。在溫度為30 ℃條件下病原菌菌落直徑及產孢量顯著高于其他處理組(P<0.05),表明病原菌最適生長溫度及產孢溫度約為30 ℃。

圖5 溫度對病原菌WT-1生長及產孢能力的影響Fig.5 Effects of temperature on myceliumand sporulation of WT-1注:不同小字母表示同一指標不同處理間差異性顯著(P<0.05);圖6～圖8同。

2.2.2 光照、pH對病原菌生長及產孢能力的影響 由圖6可以看出,在3種光照條件下菌絲均能生長,其中全黑暗條件下菌絲生長情況顯著低于全光照和12 h光暗交替處理(P<0.05)。全光照和12 h光暗交替條件下菌絲直徑無明顯差異,但是在12 h光暗交替條件下產孢量最高。

圖6 光照對病原菌WT-1生長及產孢能力的影響Fig.6 Effects of light on myceliumand sporulation of WT-1

根據圖7可知,病原菌在pH為4～11時均能生長,但pH過高或過低時會相對緩慢病原菌菌絲生長及產孢能力,病原菌菌絲生長的pH最適范圍為6～8,產生孢子的pH最適范圍為7～8。

圖7 pH對病原菌WT-1生長及產孢能力的影響Fig.7 Effects of pH value on myceliumand sporulation of WT-1

2.2.3 不同碳源對病原菌生長及產孢能力的影響 由圖8可知,病原菌在不同碳源條件下均能生長,其中病原菌菌絲在以葡萄糖、果糖和蔗糖為碳源的培養基上生長情況顯著大于其他碳源(P<0.05),且3種碳源條件下產孢量也大于其他處理組,其中葡萄糖最優,其次為果糖,蔗糖次之。

圖8 碳源對病原菌WT-1生長及產孢能力的影響Fig.8 Effects of carbon sourceson mycelium and sporulation of WT-1

2.3 拮抗菌的篩選結果

從果園土壤中分離純化得到63株菌,通過初篩得到22株具有拮抗效果的菌株,復篩獲得7株對Glomerellamagna具有較好拮抗效果的菌株(表1)。其中菌株W-2的拮抗能力最強,其拮抗指數達到3.23,抑菌帶半徑達12.70 mm。

表1 拮抗菌株對病原菌WT-1抑制效果復篩結果Table 1 Results of the inhibition ofantagonistic strains on pathogen WT-1

注：同列不同小字母表示差異性顯著(P<0.05);表3～表5同。

2.4 拮抗菌的鑒定結果

2.4.1 拮抗菌形態學和生理生化鑒定 在牛肉膏蛋白胨培養基上,拮抗菌W-2菌落呈圓形無隆起(圖9A),乳白色,表面有褶皺,不透明,邊緣不整齊,菌落較濕潤,生長迅速。通過顯微鏡觀察,菌體細胞呈直桿狀(圖9B),鏈狀排列,產橢圓形或圓卵形芽孢,無莢膜。結合形態學和生理生化特性(表2),參照《常見細菌系統鑒定手冊》可以初步鑒定菌株W-2為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

圖9 拮抗菌W-2第5 d菌落形態和顯微鏡下細胞形態(400×)Fig.9 Antagonistic antibacterial W-2 colony morphologyand cell morphology under microscope(400×)

2.4.2 拮抗菌16S rDNA序列分析 拮抗菌16S rDNA擴增結果如圖10所示,擴增片段約為1500 bp,經測序得知其序列長度為1493 bp,將測序結果在GenBank核酸數據庫中進行Blast比對,結果表明,菌株W-2與Bacillusatrophaeus(CP024051.1)的相似性為100%。根據MEGA6.0構建的系統進化樹可知,菌株W-2和B.atrophaeus位于同一分支。結合形態學特征、生理生化和分子生物學鑒定結果,可確定菌株W-2為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖11 拮抗菌W-2基于16S rDNA的系統發育樹Fig.11 Phylogenetic tree of W-2 based on 16S rDNA sequence

表2 拮抗菌W-2的生理生化測試結果Table 2 Physiological and biochemical characteristic of W-2

圖10 拮抗菌W-2 16S rDNA電泳圖Fig.10 PCR amplification of 16S rDNA sequence of W-2注:M為DNA Ladder Mix marker;W-2為拮抗菌16S rDNA擴增產物。

注：“+”表示陽性,“-”表示陰性。

2.5 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響

由表3可以看出,4個濃度的拮抗菌W-2對番木瓜炭疽病菌絲生長均有明顯的抑制作用,濃度為1×108和1×109CFU/mL時抑制效果較好,且濃度為1×109CFU/mL時,抑制效果最優。從圖12A可以看出,在菌株W-2的作用下,抑菌帶周邊病原菌菌絲無法向外繼續生長,而且邊緣有一條很明顯的深色條帶。通過顯微鏡觀察抑菌帶附近的菌絲發現其形態發生改變,其中圖12B菌絲體短小膨大。

表3 不同濃度W-2對WT-1菌絲生長的影響Table 3 Antagonistic effects of W-2at different concentrations on mycelium of WT-1

圖12 拮抗菌對病原菌菌絲生長的影響(400×)Fig.12 Effect of antagonistic antibioticson the growth of pathogenic mycelia(400×)注:B中(a)為膨大菌絲形態。

2.6 拮抗菌對病原菌孢子萌發的影響

如表4所示,在拮抗菌W-2菌懸液的作用下,大部分病原菌孢子的萌發被抑制。處理6 h后與對照組相比,濃度為1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液對病原菌孢子的相對抑制率為100%。處理12 h后,濃度為1×108和1×109CFU/mL的拮抗菌懸液孢子的平均萌發率分別為20.67%和20.00%,顯著低于對照組(P<0.05)。通過光學顯微鏡觀察發現部分孢子生長畸形,有些孢子油球變多(圖13A)。

表4 不同濃度W-2對孢子萌發率的影響Table 4 Effect of W-2 at differentconcentrations on conidial germination rate

圖13 拮抗菌W-2對病原菌WT-1孢子的影響(400×)Fig.13 Effects of W-2 on conidialmorphology of WT-1(400×)注:A中(a)為畸形孢子形態,(b)為孢子油球變多孢子形態;B為正常孢子形態。

2.7 拮抗菌不同組分對病原菌的影響

如表5所示,拮抗菌發酵液、菌懸液和無細胞濾液對病原菌菌絲生長均有抑制作用。其中發酵液的拮抗效果優于菌懸液,拮抗效果顯著優于無細胞濾液(P<0.05)。菌懸液拮抗效果優于無細胞濾液,兩者差異不顯著,說明拮抗菌的抑制作用是菌懸液與產生的拮抗物質共同作用的結果。另外,滅菌液對病原菌并無抑制作用,說明滅菌后拮抗物質已失活。

表5 W-2不同組分對WT-1菌絲生長的拮抗影響Table 5 Antagonistic effects of W-2 at different partson mycelium of Glomerella magna

2.8 番木瓜果實上拮抗菌對番木瓜炭疽菌的抑制效果

由圖14可以看出,貯藏5 d時,對照組A的番木瓜果實尚未發病,而接種了病原菌孢子懸液的B組和C組的果實均出現發病情況。之后,番木瓜果實上的病斑直徑和發病率隨著貯藏時間的延長而增大。貯藏第7 d,3組的病斑直徑分別為11.30、21.60和16.60 mm,發病率分別為20.00%、79.57%和50.03%。與B組相比,C組的病斑直徑明顯降低了5.00 mm,而且發病率顯著降低30%(P<0.05)。結果表明,B.atrophaeus有效的抑制了番木瓜炭疽菌在番木瓜傷口處的生長。

圖14 番木瓜傷口處病斑直徑和發病率隨貯藏時間的變化Fig.14 Changes of lesion diameters and decayincidence in papaya wound with the preservation days注:圖例中A-無菌水;B-無菌水+病原菌孢子懸液;C-拮抗菌懸液+病原菌孢子懸液。不同小字母表示同一貯藏時間的不同處理間差異性顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

番木瓜炭疽病是影響番木瓜采后貯藏運輸最為嚴重的病害之一,因海南省氣候高溫多雨,在番木瓜生長季節,氣候環境也極其適合炭疽病菌的繁殖,致使該病發病迅速。在海南地區,經報道的番木瓜炭疽病病原菌目前有兩種,分別是膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)[29]。在本試驗中,從發病果實病健交界處分離獲得了一株番木瓜炭疽病有性態致病菌株Glomerellamagna。該菌株的最適生長溫度及產孢溫度為30 ℃,在12 h光暗交替條件下產孢量最高;菌絲生長的最適pH范圍為6～8,pH在7～8時可產生大量孢子,最適碳源為葡萄糖。將此菌株于美國菌種保藏中心(ATCC)進行搜索,發現Glomerellamagna是一株可以引起西瓜、南瓜和黃瓜等葫蘆科植物炭疽病的病原菌,于2010年首次在中國臺灣發現并報道該病原菌[30]。Glomerellamagna作為一株海南地區新型的番木瓜炭疽病病原菌,有待對其進一步研究。

近年來,人們對安全健康、環境友好型農產品的需求日益增加,生物防治作為一種可取代化學殺菌劑的新途徑,在采后果蔬防腐保鮮方面有較大的潛力。相關研究也發現若干拮抗微生物能夠有效控制番木瓜采后炭疽病。石晶盈等[31]分離并篩選出1株內生細菌惡臭假單胞菌生物變種Ⅰ(PseudomonasputidabiovarⅠ),對采后番木瓜疫病和炭疽病具有抑制作用。陳亮[32]發現解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)發酵液產生的揮發性物質對C.gloeosporioide有較好的抑制效果。孫合美等[33]篩選出4株對C.gloeosporioides和C.capsici均有良好拮抗性的優良木霉菌(Trichodermasp.)。本試驗針對分離獲得的新型番木瓜炭疽病病原菌Glomerellamagna,開展拮抗菌的篩選。從果園土壤中篩選獲得7株拮抗菌,其中菌株W-2拮抗能力最強,將其鑒定為萎縮芽孢桿菌,該菌在離體和活體防效試驗中對番木瓜炭疽菌都具有明顯的拮抗效果。

大量研究表明,萎縮芽孢桿菌能抑制多種植物病原菌的生長,其作用機制可能包括產生抗菌物質、產嗜鐵素、鈍化病原菌的寄生和繁殖能力等[15]。Li等[34]從胡麻植株土樣中分離出的萎縮芽孢桿菌SF1對胡麻枯萎病有抑制作用。萎縮芽孢桿菌B5的發酵產物通過分泌脂肽伊枯草菌素、桿菌霉素和表面活性肽等物質,對刺果番荔枝和牛油果炭疽病病原菌的菌絲和孢子均有較強的抑制作用[26]。Zhang等[35]報道了一株對黃瓜白粉病和番茄灰霉病具有較強的抑制作用萎縮芽孢桿菌CAB-1,其代謝產物鄰茴香胺能有效抑制B.cinerea菌絲的生長。本研究的體外試驗表明,在拮抗菌W-2作用下,番木瓜炭疽菌的菌絲短小、膨大,隔膜消失,孢子形態異常。而且拮抗菌發酵液、菌懸液和無細胞濾液對病原菌菌絲生長均有抑制作用,這可能與拮抗菌直接的抑菌作用或在代謝過程中分泌的抗菌物質有關,但相關機理及抗菌物質仍需進一步研究。實驗結果為海南地區番木瓜炭疽病新型致病菌Glomerellamagna的生物防治提供了理論基礎,為后續針對拮抗菌拮抗機理的進一步研究做了鋪墊。