山西老陳醋中優勢產酸菌的分離純化及功能分析

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(1.北京工商大學食品與健康學院,北京 100048;2.北京工商大學食品質量與安全北京實驗室,北京 100048;3.北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048;)

我國傳統釀造食醋普遍為自然接種、多微共酵、開放式生產[1]。正是由于包括細菌和真菌在內的多種菌種共同存在的混菌發酵,賦予了我國食醋豐富獨特的風味和保健功能[2-3]。但是,群體微生物體系復雜、代謝機制不清,造成食醋發酵過程調控困難、原料利用率不高,勞動強度大、生產效率低、不同批次產品品質風味穩定性差等問題,而目前人們釀造食醋還僅僅停留在醋酸菌將乙醇轉化為乙酸的層面上[4-6],對于釀造過程對中其它微生物的作用認識不足,這就大大阻礙了我國傳統發酵食醋行業的工藝創新和行業技術升級。

山西老陳醋天然發酵醋醅中存在著種類繁多的產酸菌,性質優良的產酸菌在老陳醋的風味、品質及功能成分的形成過程中起到重要作用。呂艷歌等[7]利用分子生物學技術從連續采樣的山西老陳醋醋醅中分離出了芽孢桿菌及醋酸桿菌,其中優勢菌群為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)。杜宏福等[8]采用PCR-DGGE技術結合CCA分析方法對山西老陳醋醋醅和酒醅發酵過程中微生物群落演替及有機酸變化進行分析,得到優勢菌群為醋酸菌及乳酸菌,主體酸為乙酸和乳酸。史改玲等[9]從山西老陳醋醋醅中篩選出9株優良芽孢桿菌,其中地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)CP-18和CP-1853有較強的產酸和產酯能力,產量分別為0.25 g/L和10.67 g/100 mL,甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)CP-1576產乙酸能力較強,為1.15 mg/mL。但目前少有文獻報道對從山西老陳醋醋醅中篩選出不同種屬的優良產酸菌在單菌純培養過程中產有機酸和揮發性成分的分析。

本實驗通過篩選鑒定從山西老陳醋醋醅中獲得3株優良產酸菌,并通過高效液相色譜與氣相色譜質譜法對其產有機酸能力和產風味物質的功能特性進行探究,從而明確菌株在發酵過程中所起關鍵作用以及發酵過程中微生物的代謝對食醋釀造品質的影響[10-11],以期豐富老陳醋中優良菌株的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西老陳醋醋醅 山西老陳醋集團有限公司定州分公司;DNA Marker 北京橋生物科技有限公司;dNTPs 日本TAKARA公司;TransTaq?-T DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司;引物 由北京奧科鼎盛公司合;草酸、酒石酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、α-酮戊二酸(標準品)、2-辛醇(分析純) Sigma-Aldrich公司。

JY2002 電子天平 上海浦春計量儀器有限公司;PHS-3CpH計 上海精密科學儀器有限公司;LRH-250恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;DL-CJ-2ND I超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;TENSUC恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司;YQX-SG46-280S高壓蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;氣相色譜質譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 醋酸菌、芽孢桿菌發酵培養基:葡萄糖10 g/L,酵母粉10 g/L,蛋白胨3 g/L,121 ℃滅菌20 min,降溫至55 ℃左右加入無水乙醇5%(V/V)。

產酸菌株篩選培養基(GYC培養基):葡萄糖10 g/L,酵母浸粉10 g/L,胰蛋白胨3 g/L,輕質碳酸鈣5 g/L,瓊脂粉20 g/L,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

斜面保藏培養基:胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂20 g/L,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min乳酸菌發酵培養基(MRS):葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,KH2PO41 g/L,K2HPO42.5 g/L,MgSO41 g/L,NaCl 2.5 g/L,115 ℃滅菌30 min,降溫至55 ℃左右加入無水乙醇5%(V/V)。

LB培養基:胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,NaCl 5 g/L,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 產酸菌株的篩選 初篩:稱取1 g醋醅置于9 mL無菌水中,震蕩混勻得到濃度梯度為10-1的稀釋液,然后以10倍梯度依次稀釋至10-6,取100 μL稀釋好的菌液均勻涂在GYC固體培養基平板上,倒置于培養箱中,37 ℃ RH 80%培養,培養至有菌落出現。菌株產酸后與CaCO3反應產生透明圈,根據有無透明圈來判斷是否產酸。挑取產酸單菌落且長勢良好者,劃線分離純化至斜面保藏培養基,4 ℃冰箱保存,以備進一步鑒定。

復篩:將斜面保藏的菌株接種至液體GYC培養基中,37 ℃、180 r/min培養12 h后菌液劃線至GYC固體培養基平板上,37 ℃ RH 80%培養反復劃線至單菌落,得到純化后的3株產酸菌株,對其進行種屬鑒定。

1.2.3 產酸菌株的種屬鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定 將純化后的產酸菌株轉移到GYC平板上,37 ℃,RH 80%培養,觀察菌落的生長速度和菌落相應的大小、形態等培養特征,同時對菌落進行革蘭氏染色,并觀察染色結果和細胞形態[12-13,9]。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 a.PCR引物

16S rDNA正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′。

16S rDNA反向引物1492R:5′-ACGGTTACCTTG TTACGACTT-3′

b.菌體培養

將斜面保藏的菌株在GYC平板上劃線活化,在37 ℃ RH 80%下培養12 h后挑取單菌落接種到50 mL液體LB培養基中,37 ℃、180 r/min培養12 h。

c.基因組DNA提取

取1 mL經培養后的菌液于離心管中,在4 ℃ 10000 r/min下離心10 min,棄上清液,留菌體沉淀。后全基因組DNA提取操作見OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒。

d.PCR擴增

PCR反應采用50 μL體系,5 μL的10×buffer,4 μL的dNPTs,1 μL的27F,1 μL的1492R,1 μL的模板,0.5 μL的TransTaq-T。反應條件為94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,29個循環;72 ℃再延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗,并將擴增產物進行測序[14]。

e.16S rDNA序列測定和系統發育分析

表1 菌株形態觀察Table 1 Observation of strain morphology

將16S rDNA成功擴增產物送往測序公司,進行雙向測序,并將拼接序列提交至16s rDNA GenBank庫檢索系統,NCBI的BLAST(http://www.ncbi. nlm.Gov/Blast/)對序列同源性進行比較分析,采用生物學軟件MEGA4繪制構建相關菌株的系統發育樹。

1.2.4 用于有機酸及揮發性成分分析的菌液制備 醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌分別接種于特定培養基后培養144 h,其中醋酸菌、芽孢桿菌于32 ℃、120 r/min搖床振蕩培養,乳酸菌置于37 ℃培養箱靜置培養。發酵結束后,將發酵液置于4 ℃以備進一步的分析。

1.2.5 產酸菌發酵液有機酸分析 參照文獻[15-16],色譜條件:液相系統為Agillent 1100;色譜柱為Waters Atantis C18色譜柱(4.6×150 mm,5 μm);流動相為20 mmol/L NaH2PO4,pH=2.7;進樣體積是10 μL;流動速度1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測器為UV 210 nm。

以乙酸(41.82 g/L)、丙酮酸(8.9 g/L)、乳酸(20 g/L)、α-酮戊二酸(0.5 g/L)、草酸(0.55 g/L)、琥珀酸(48 g/L)、酒石酸(12 g/L)、富馬酸(1 g/L)八種標準物質作為對照,以保留時間和樣品加標定性,將各種有機酸標準溶液在同樣的色譜條件下進樣,繪制標準曲線,采用峰面積外標法定量。

有機酸含量的計算:將所得的發酵上清液用0.22 μm濾膜過濾除雜質,通過HPLC分析發酵液的有機酸組成分析。

計算公式:C=C標×A樣×N×10-3/A標×V

式中:C-發酵液中有機酸濃度(mg/100 mL);C標-標樣濃度(mg/L);A樣-樣品峰面積;A標-標樣峰面積;N-樣品稀釋倍數;V-發酵液體積(mL)。

1.2.6 產酸菌發酵液的揮發性成分分析 樣品預處理:取發酵液5 mL,離心10000 r/min,10 min,取上清與15 mL氣質小瓶中,加入2.0 g NaCl,并加入5 μL(0.21 mol/L)2-辛醇作為內標,用于氣質分析。

色譜條件:DB-wax毛細管色譜柱,柱長30 m,內徑0.25 nm;液膜厚度0.25 μm,載氣He,流量1 mL/min,不分流;進樣口溫度250 ℃;柱溫:起始溫度30 ℃,以5 ℃/min升溫至180 ℃,再以12 ℃/min升溫至240 ℃,保持5 min。

質譜條件:接口溫度250 ℃,離子源溫度200 ℃,電離方式EI+,電子能量70 eV,掃描質量范圍33～450 amu。

1.3 數據處理

每組實驗進行三個平行,樣品中揮發性成分的定性通過與Nist數據庫進行分析比較,檢測出揮發性成分匹配度大于800的化合物,采用內標法定量方式求得各組分含量;利用Excel 2007軟件處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 產酸菌的分離篩選及鑒定

2.1.1 形態學鑒定 在GYC平板上分離的典型產酸菌菌落如圖1所示,按照產透明圈的大小不同以及菌落形態差異,共挑取3株菌保藏,菌落形態和細胞形態觀察結果如表1所示。鑒定結果表明:BCP0454為短桿狀的革蘭氏陰性菌,BCP0738為長桿狀的革蘭氏陽性菌,BCP0449為長桿狀的革蘭氏陽性菌。

圖1 GYC平板上產透明圈的產酸菌Fig.1 The colony of acid-producing bacteriaon the solid flat of GYC

2.1.2 分子生物學鑒定 對3株產酸菌進行全基因組DNA提取,以全基因組DNA為模板進行PCR擴增得到16S rDNA核酸片段并測序,并將測序結果提交于NCBI數據庫中進行BLAST在線同源性對比分析,通過構建系統發育樹,初步證明為菌株BCP0454屬于巴氏醋桿菌(Acetobactorpasteurianus);BCP0738屬于短乳桿菌(Lactobacillusbrevis);BCP0449屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

2.2 產酸菌株發酵液有機酸分析

表2 產酸菌發酵液中有機酸的分析結果(mg/100 mL)Table 2 Organic acids analysis results of acid-producing bacteria broth(mg/100 mL)

注：ND為未檢出。按照1.2.4中所述的發酵條件進行發酵。發酵結束后,將發酵液于10000 r/min離心10 min。上清液用0.22 μm濾膜過濾除雜質,利用HPLC測定其中的各種有機酸含量。首先對草酸、酒石酸、丙酮酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸等8中有機酸進行HPLC檢測,然后通過產酸菌發酵液與標準品保留時間的比對,通過外標法對其進行定量。

圖3 有機酸混標的 HPLC 檢測圖譜Fig.3 The HPLC chromatogram of mix-standardfor organic acid analysis 注:草酸2.336 min,酒石酸2.631 min,丙酮酸3.011 min,α-酮戊二酸3.761 min,乳酸4.210 min,乙酸4.604 min,富馬酸5.863 min,琥珀酸7.774 min。

3株產酸菌發酵液經HPLC檢測,并對圖3進行積分計算,有機酸的種類及含量如表2所示。在發酵液中共有7種有機酸被檢出,分別為草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸、琥珀酸,它們的含量在NO～4885.25 mg/100 mL之間;每種菌株均能產生兩種或兩種以上的有機酸。

巴氏醋桿菌BCP0454能夠產生5種有機酸,種類較其他菌株豐富,并且產乙酸的含量達到4885.25 mg/100 mL,與杜宏福等[8]在研究山西老陳醋整個發酵過程細菌群落組成和有機酸變化規律中,在醋酸發酵階段產生的3916.3 mg/100 g醋醅相比,具有較高產乙酸水平。短乳桿菌BCP0738能夠同時產乙酸和乳酸,其含量分別為648.58和395.07 mg/100 mL。趙國忠等[17]在老陳醋釀造過程酒精發酵階段添加一株優良乳酸菌,發酵終期檢測到乳酸的含量為62 mg/100 mL。劉陽等[18]從保寧醋醋曲中分離得到1株發酵乳酸桿菌(Lactobacillusfemertum),檢測到乳酸、乙酸,含量分別為66.56和104.08 mg/100 mL。芽孢桿菌BCP0449能夠產生兩種有機酸,分別為乙酸和琥珀酸,總量為2108.24 mg/100 mL,兩種有機酸產量高于于華等[19]從四川麩醋醋醅中篩選出的產酸芽孢桿菌,其產乙酸和琥珀酸的總量為9.85 mg/100 mL。

2.3 產酸菌發酵液中揮發性成分分析

將發酵液的揮發性成分分成五大類,分別為酯類、羧酸類、醇類、羰基類及酚類物質。按照1.2.4中所述的發酵條件進行發酵,取發酵液對3株產酸菌株中揮發性成分進行檢測,與數據庫比對,整理結果如表3。

圖2 BCP0454、BCP0449、BCP0738基于16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of BCP0454,BCP0449,BCP0738 based on the 16S rDNA sequence

表3 巴氏醋桿菌BCP0454發酵液中揮發性成分分析結果
Table 3 Volatile components analysis resultsin the fermentation broth of BCP0454

種類名稱含量(μg/100 mL)總量(μg/100 mL)酯類乙酸乙酯10.17苯乙酸乙酯2.77乙酸苯乙酯3.83棕櫚酸乙酯5.5322.30羧酸類辛酸8.38壬酸3.34癸酸21.16棕櫚酸6.3539.23醇類S-(-)-2-甲基-1-丁醇2.77芳樟醇7.90苯乙醇4.1514.82醛類壬醛8.87癸醛1.55苯甲醛9.932,4-二甲基苯甲醛14.5734.92芳香族化合物1-甲基萘1.55苯并噻唑8.8010.35

從表3的結果來看,巴氏醋桿菌BCP0454的發酵液中共檢測出17種揮發性物質。其中包括4種酯類、4種羧酸類、3種醇類、4種醛類和2種芳香族化合物，其相對含量分別為18.34%、32.26%、12.19%、28.71%、和8.51%。在所檢測的5類化合物中,芳香族化合物的含量相對較低,羧酸類物質的含量最高。

從表4的結果來看,短乳桿菌BCP0738的發酵液中共檢測到23種揮發性物質。其中包括6種酯類、3種羧酸類、7種醇類、5種醛類、1種芳香族化合物和1種吡嗪類;其中酯類物質種類豐富且含量最高,占所有揮發性物質總量的51.70%。

表4 短乳桿菌BCP0738發酵液中揮發性成分分析結果Table 4 Volatile components analysis resultsin the fermentation broth of BCP0738

從表5的結果來看,芽孢桿菌BCP0449的發酵液中共檢測到26種揮發性物質。其中包括6種酯類、3種羧酸類、5種醇類、5種醛類、4種芳香族化合物和3種吡嗪類;其中酯類和醛類含量相對于其他幾種成分較高,分別占總量的14.5%和57.97%;能夠產生3種吡嗪類,與此同時,吡嗪類的重要前提物質乙偶姻的產量達到25.28 μg/100 mL。

表5 枯草芽孢桿菌BCP0449發酵液中揮發性成分分析結果Table 5 Volatile components analysis resultsin the fermentation broth of BCP0449

綜上所述,通過對產酸菌株發酵液中揮發性成分進行分析,發現這三株微生物均能夠產生5～6類揮發性物質,分別為酯類、羧酸類、醇類、醛類、芳香族化合物、吡嗪類物質,并且所檢測到的風味物質是屬于已報道食醋中風味物質的關鍵成分。對于不同種屬的微生物,其分泌的主要揮發性物質的比例也有較大差別[20],巴氏醋桿菌BCP0454發酵液中羧酸類的含量最高,達到了32.26%,短乳桿菌BCP0738的發酵液中酯類種類豐富且含量最高,占所有揮發性物質總量的51.70%,芽孢桿菌BCP0449所產醛類含量相對于其他幾種成分較高,占總量的57.97%。不同種類的物質對于食醋釀造過程中風味及品質的影響不盡相同,羧酸類對食醋的呈酸性有影響,具有果香、脂肪香的酯類對山西老陳醋的香氣形成有重要作用,醛類的焦糖香、奶香和烤香對山西老陳醋色、香貢獻較大[21]。

3 結論

本研究從山西老陳醋醋醅中篩選得到了3株不同產酸菌,分別為巴氏醋桿菌(Acetobactorpasteurianus)BCP0454、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)BCP0738和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BCP0449,其發酵產物中含有影響山西老陳醋風味及品質的功能成分。通過所產有機酸和風味物質兩方面對單菌功能特性進行探究,分別得BCP0454具有較好產有機酸的能力,并且所產乙酸含量(4885.25 mg/100 mL)相對較高,在所產17種風味物質中羧酸類和醛類物質含量最高;BCP0738能同時產生乳酸和乙酸(1225.79 mg/100 mL),產生的23種風味物質中酯類物質含量最高達到51.70%;BCP0449能夠產2種有機酸,總量達到2108.24 mg/100 mL,同時能夠產生食醋中的重要功能成分乙偶姻及3種吡嗪類物質。由于單菌發酵優化及混菌發酵實驗工作量大,在基于本研究的基礎上,課題組會采用正交、響應面等方法繼續進行發酵實驗探究以及后續應用實驗。有機酸和風味物質的形成是食醋釀造的關鍵工藝,而本研究通過探究微生物相應的功能特性,豐富了山西老陳醋的菌種資源,也為生物強化在食醋釀造中的應用提供微生物資源。