菠蘿皮渣羧甲基纖維素/海藻酸鈉復合水凝膠珠固定化菠蘿蛋白酶的制備及穩(wěn)定性研究

陳 輝,黃惠華

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510000)

菠蘿蛋白酶(bromelain)是從菠蘿中提取的一種由多種酶組成的混合物,在肉類嫩化、消炎、抗水腫等方面都有很廣泛的用途[1]。但菠蘿蛋白酶作為生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用時很容易受外界環(huán)境影響而失去活性[2-3]。與游離酶相比,固定化酶具有穩(wěn)定性好、易回收、可重復利用等優(yōu)點[4]。Jafary等[5]以戊二醛為交聯(lián)劑,將乳糖過氧化物酶固定在聚苯胺聚合物上,乳糖過氧化物酶的穩(wěn)定性得到明顯提高,且能重復使用。Selvam等[6]制備了一種磁性納米顆粒并用于固定化細菌纖維素酶,發(fā)現(xiàn)固定化后的纖維素酶表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性和活性。

海藻酸鈉(Sodium alginate,SA)是一種主要從褐藻中提取的酸性多糖,具有高粘度、良好的生物相溶性、可降解性以及在凝膠中能夠包覆其他材料的能力[7],是一種良好的固定化酶載體。菠蘿在加工過程中,會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物菠蘿皮渣,如果不加以利用直接丟棄,會造成資源的浪費和環(huán)境污染。然而,由于纖維素在大多數(shù)溶劑中的不溶性,將纖維素改性的應用更加廣泛。其中,通過纖維素的羧甲基化可以得到具有良好溶解性,生物相容性和生物降解性的羧甲基纖維素,其廣泛用于農(nóng)業(yè)、穩(wěn)定劑、緩凝劑和藥物中[8-10]。通過將菠蘿皮渣羧甲基纖維素(Pineapple peel residue carboxymethyl cellulose,PCMC)與SA共混制備水凝膠珠,并以此為載體固定化菠蘿蛋白酶,不僅能提高菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性,還能提高酶的重復利用率,降低生產(chǎn)成本。

本實驗在前人[11]的基礎(chǔ)上,以生物相溶性良好的PCMC和SA為原料,共混制備復合水凝膠珠,并用于固定化菠蘿蛋白酶,以期為固定化酶載體的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿皮渣纖維素(Pineapple peel residue cellulose,PPC) 實驗室自制[12];菠蘿蛋白酶(300 U/mg,CAS:8002-43-5)、海藻酸鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司;其他試劑 均為化學純或分析純。

BSA12S-CW型精密分析天平 賽多利斯儀器有限公司;UV-1800紫外/可見分光光度計 日本島津公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 廣州市星爍儀器有限公司;JW-30260 minR型高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCMC的制備 參考He等[13]的方法并稍作修改:稱取2.0 g PPC加入到30 mL 95%乙醇中,攪拌使其充分混合。再向體系中加入3.0 mL 30%氫氧化鈉溶液,30 ℃條件下磁力攪拌1.5 h完成堿化反應。然后向其中加入2.4 g氯乙酸鈉,升溫到65 ℃反應2.0 h,完成醚化反應。用少量乙酸中和至pH為7～8,過濾后用50%乙醇溶液反復洗滌,50 ℃干燥,得到PCMC成品。

1.2.2 固定化菠蘿蛋白酶的制備 參考羅蘇芹等[14]的方法并稍作修改。分別稱取一定量的PCMC和SA于10 mL蒸餾水中,60 ℃磁力攪拌充分溶解后,冷卻至室溫。加入5.0 mL一定濃度的菠蘿蛋白酶溶液,繼續(xù)磁力攪拌混合均勻。將混合物用注射器緩慢滴到一定濃度的CaCl2溶液中交聯(lián)1.0 h形成水凝膠珠。然后將水凝膠珠浸泡在戊二醛溶液中進一步交聯(lián)一定時間,交聯(lián)完成后用去離子水反復清洗,除去未反應的雜質(zhì),用濾紙擦凈表面水分,得到固定化菠蘿蛋白酶,4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菠蘿蛋白酶的活力測定 游離菠蘿蛋白酶活性的測定[15]:取1.0 mL酶液,置于37.2 ℃水浴中預熱10 min,加入濃度為2.0 mg/mL酪蛋白溶液2.0 mL,混合搖勻后準確反應10 min。加入濃度為10%三氯乙酸溶液3.0 mL終止反應。保溫20 min后將混合物在8000 r/min下離心10 min,取上清液測定其在275 nm波長下的吸光度。另取1.0 mL酶液,按照上述步驟操作,以交換酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液的加入順序作為對照。

固定化酶的活力測定:將200 mg固定化酶(濕重)浸入1.0 mL磷酸緩沖溶液(0.03 mol/L,pH7.2)中代替上述1.0 mL酶液,其余步驟相同。

菠蘿蛋白酶活性定義為:1.0 g固定化酶或1.0 mL游離酶液在上述條件下水解酪蛋白,每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸,即為一個酶活力單位,表示為U。

相對酶活性(%)定義為:將某一組中測定的酶活性最高值記為100%,其他條件下測定的酶活性與最高酶活性的比值[16]。

1.2.4 單因素試驗 分別研究了PCMC與SA質(zhì)量比、CaCl2溶液濃度、菠蘿蛋白酶濃度、戊二醛溶液體積分數(shù)以及交聯(lián)時間對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活的影響。固定CaCl2溶液濃度為1.0%、菠蘿蛋白酶濃度為2.0 mg/mL、戊二醛溶液體積分數(shù)為1.0%、交聯(lián)時間為60 min,考察不同PCMC與SA質(zhì)量比(0∶5、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質(zhì)量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1.0%、戊二醛溶液體積分數(shù)為1.0%、交聯(lián)時間為60 min,考察不同菠蘿蛋白酶濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質(zhì)量比為2∶3、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、戊二醛溶液體積分數(shù)為1%、交聯(lián)時間為60 min,考察不同CaCl2溶液濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質(zhì)量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1%、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、交聯(lián)時間為60 min,考察不同戊二醛溶液體積分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質(zhì)量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1%、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、戊二醛溶液體積分數(shù)為1%,考察不同交聯(lián)時間(20、40、60、80、100 min)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響。

1.2.5 固定化酶的穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 熱穩(wěn)定性 分別取200 mg(濕重)優(yōu)化工藝后制備的固定化酶(600 U)和3 mL游離酶(600 U)在不同溫度(40、50、60、70、80 ℃)下放置2 h,測定其活性,考察固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.5.2 酸堿穩(wěn)定性 分別取200 mg(濕重)優(yōu)化工藝后制備的固定化酶(600 U)和3 mL游離酶(600 U)在不同pH(3、5、7、9、11)環(huán)境下放置24 h,測定其活性,考察固定化酶和游離酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.5.3 重復使用性 按照優(yōu)化后的固定化酶制備條件制備固定化菠蘿蛋白酶,將200 mg(濕重)固定化菠蘿蛋白酶(600 U)在相同條件下重復7次測定其活性,每次測完后用磷酸緩沖溶液將固定化酶清洗干凈。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)重復3次取平均值,用Oringin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿蛋白酶固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 PCMC與SA質(zhì)量比對固定化酶活性的影響 PCMC與SA質(zhì)量比對固定化酶活性的影響結(jié)果如圖1所示,當不添加PCMC時,固定化酶的相對酶活性只有46.8%,隨著PCMC和SA的質(zhì)量比增加,固定化酶相對酶活性也隨之增加,在PCMC和SA的質(zhì)量比為2∶3時達到最大值100%。繼續(xù)增加PCMC和SA的質(zhì)量比,固定化酶的相對酶活性反而減小,這是因為PCMC含量過多時,相應的SA含量較少,形成的水凝膠珠不能很好的與Ca2+交聯(lián),機械強度不夠,導致相對酶活性降低[17]。

圖1 PCMC與SA質(zhì)量比對固定化酶活性的影響Fig.1 Effect of mass ratio of PCMC to SAon the activity of immobilized enzyme

2.1.2 CaCl2溶液濃度對固定化酶活性的影響 CaCl2溶液濃度對固定化酶活力的影響結(jié)果如圖2所示,隨著CaCl2溶液濃度的提高,固定化酶的相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在濃度為1.0%時達到最大值100%。這可能是因為當濃度低于1.0%時,交聯(lián)程度不夠,水凝膠珠機械強度太弱,酶分子容易從水凝膠珠中滲漏出來[18],當CaCl2濃度高于1.0%時,高濃度的鈣離子充滿在水凝膠珠里面,抑制了菠蘿蛋白酶的活性。

圖2 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響Fig.2 Effect of CaCl2 concentrationon the activity of immobilized enzyme

圖3 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of bromelain concentrationon the activity of immobilized enzyme

2.1.3 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響結(jié)果如圖3所示,當菠蘿蛋白酶濃度從1.0 mg/mL增加到2.0 mg/mL時,相對酶活性有一定程度的增加,但繼續(xù)增加酶濃度,相對酶活性變化不大,這可能是因為水凝膠上的吸附位點已經(jīng)全部被酶分子占據(jù),即使繼續(xù)增加酶濃度,相對酶活性也不會相應增加[19]。

2.1.4 戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活性的影響 戊二醛的作用是將菠蘿蛋白酶分子交聯(lián)在水凝膠載體上[20],從而實現(xiàn)固定化,因此有必要考察戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活性的影響。由圖4可知,隨著戊二醛體積分數(shù)的提高,固定化酶的相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在戊二醛體積分數(shù)為1.0%時達到最大值100%。這是因為當戊二醛體積分數(shù)低于1.0%時,不能充分的將菠蘿蛋白酶分子交聯(lián)在水凝膠載體上,從而造成菠蘿蛋白酶分子的脫落。而當戊二醛體積分數(shù)高于1.0%時,過高濃度的戊二醛會使菠蘿蛋白酶分子交聯(lián)過度,造成菠蘿蛋白酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使酶失活[13],因此選擇戊二醛溶液的體積分數(shù)為1.0%。

圖4 戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde volume fractionon the activity of immobilized enzyme

2.1.5 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響結(jié)果如圖5所示。隨著交聯(lián)時間的增加,固定化酶相對酶活性呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當交聯(lián)時間小于60 min時,交聯(lián)程度不夠,不能很好的固定菠蘿蛋白酶。但交聯(lián)時間大于60 min,菠蘿蛋白酶與水凝膠緊密結(jié)合,導致酶的活性位點不能很好的與底物分子結(jié)合,從而影響了酶的相對活性。因此,選擇交聯(lián)時間為60 min。

圖5 交聯(lián)時間對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of crosslinking timeon the activity of immobilized enzyme

2.2 固定化菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性研究

2.2.1 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較 由圖6可知,隨著溫度的升高,固定化酶和游離酶的相對酶活性都呈現(xiàn)減小的趨勢,但固定化酶的相對酶活性比游離酶的相對酶活性減小的更加緩慢,在50 ℃環(huán)境下放置2.0 h后,固定化酶的相對酶活性為89.3%,而此溫度下游離菠蘿蛋白酶的相對酶活性為48.3%;在80 ℃環(huán)境下放置2.0 h后,固定化酶的相對酶活性為35.2%,此時游離酶已幾乎檢測不到活性,說明固定化酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性。這是因為菠蘿蛋白酶和水凝膠載體之間形成了共價鍵或氫鍵,酶活性位點的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,同時水凝膠載體對酶分子也有一定的保護作用[18]。

圖6 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability betweenimmobilized enzyme and free enzyme

2.2.2 固定化酶和游離酶的酸堿穩(wěn)定性比較 由圖7可知,游離菠蘿蛋白酶在pH大于5環(huán)境下放置24 h后,相對酶活性隨著pH的增加逐漸減小,在pH為11時,相對酶活性為42.3%。而固定化酶在pH3～11范圍內(nèi)相對酶活性都大于83.0%。游離菠蘿蛋白酶在pH為5時最穩(wěn)定,而固定化酶在pH為7時最穩(wěn)定,說明菠蘿蛋白酶固定化后的穩(wěn)定性向堿性方向移動。

圖7 固定化酶和游離酶的酸堿穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparison of pH stability ofimmobilized enzyme and free enzyme

2.2.3 固定化酶的重復使用性 固定化酶的重復使用性結(jié)果如圖8所示,隨著使用次數(shù)的增加,固定化酶的相對酶活性呈現(xiàn)減小的趨勢,這可能是因為少量酶分子與載體結(jié)合不牢固,使用過程中脫落,導致固定化酶活性降低。使用5次后,相對酶活性變化不顯著;使用7次后,固定化酶還保持起始酶活性的60.5%,說明固定化酶具有良好的重復操作穩(wěn)定性。

圖8 固定化酶的重復使用性Fig.8 Reusability of the immobilized enzyme

3 結(jié)論

通過將菠蘿皮渣羧甲基纖維素和海藻酸鈉按照一定比例混合,以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化菠蘿蛋白酶。通過單因素實驗得出固定化菠蘿蛋白酶的最佳制備工藝為:菠蘿皮渣羧甲基纖維素與海藻酸鈉的質(zhì)量比為2∶3,氯化鈣的濃度為1.0%,菠蘿蛋白酶濃度為2.0 mg/mL,戊二醛體積分數(shù)為1.0%,交聯(lián)時間為60 min。比較游離菠蘿蛋白酶和制備的固定化菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn):固定化酶比游離酶更耐受高溫環(huán)境和堿性環(huán)境,且具有良好的重復操作穩(wěn)定性。本實驗以菠蘿皮渣為原料,開發(fā)了一種新的固定化酶載體,所制備的固定化菠蘿蛋白酶具有較好的溫度穩(wěn)定性和堿環(huán)境穩(wěn)定性,有利于酶的工業(yè)化生產(chǎn)和儲存,對廢棄資源的高值化利用具有重要意義,同時也為其他酶的固定化研究提供理論基礎(chǔ)。