草魚頭磷脂制備工藝優化及抗氧化性能分析

,2,3,*,2,3,2,3,2,3,2,3

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.湖北省農產品加工與轉化重點實驗室,湖北武漢 430023;3.大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室,湖北武漢 430023)

磷脂是生命的重要物質和細胞膜的組成成分之一,具有調節機體代謝,降血脂,預防血栓等生理活性功能[1-2]。從結構來看,磷脂屬兩親結構,磷脂中的磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanilamine,PE)將細胞膜上的過氧化脂質運送出細胞膜,防止細胞膜表面積累較多的脂質過氧化產物,避免細胞膜的損傷,從而實現磷脂的抗氧化作用[3-5]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國具有本土特色且大量養殖的一種常見魚類,養殖周期短,食用口感好,受到水產養殖行業和市場的喜愛,草魚加工產品主要有魚肉的冷凍制品、生鮮調味品、魚糜以及干腌制品4種類型,但魚頭一般作為副產物沒有很好的加工利用途徑[6]。國內有研究者對草魚肌肉中磷脂進行了提取優化和分析測定,并對草魚各部位脂質進行系統性的分析研究,但基于草魚頭來源磷脂的制備工藝優化并分析其抗氧化性能的課題鮮見報道[7]。目前磷脂的制備方法主要為溶劑萃取法[8-10]、柱層析法[11]、CO2超臨界萃取法[12]和膜分離法[13]等。

本研究以草魚加工副產物中的魚頭為原料,基于成本和工業化生產可行性考慮,選擇溶劑法來提取草魚頭磷脂,并檢測草魚頭磷脂的體外抗氧化性能,其可為磷脂在水產品加工副產物領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活草魚 產地武漢,購買于武漢市常青花園武商量販店,每條重量(1000±100) g;大豆磷脂(純度≥65%) 美國Sigma公司;氯仿、正己烷、甲醇 色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司;BF3-甲醇 上海Aladdin公司;GF254薄層色譜硅膠板、GF254柱層析硅膠(100～200目) 青島海洋化工廠;所有分離用有機溶劑 均為國產分析純。

RE-52CS旋轉蒸發器、YH-500隔膜真空泵 上海亞榮生化儀器廠;HH-2數顯恒溫水浴鍋 上海維誠儀器有限公司;CP214電子分析天平 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草魚頭磷脂提取工藝流程 鮮活草魚→宰殺→魚頭→破壁機破碎→真空冷凍干燥→粉碎后過200目篩→加乙醇混勻后于水浴鍋靜置提取→抽濾→取濾液于0.08 MPa真空,80 ℃條件下旋轉蒸發去除溶劑→磷脂

1.2.1.1 乙醇濃度對草魚頭磷脂得率及純度的影響 取粉碎后的草魚頭粉25 g左右,設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%、100%,固定條件為:料液比1∶10 g/mL,55 ℃條件下提取1.5 h,抽濾后旋蒸除去乙醇,用磷脂純度來確定最優乙醇濃度。

1.2.1.2 料液比對草魚頭磷脂得率及純度的影響 取粉碎后的草魚頭粉25 g左右,設置料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL,固定條件為:乙醇濃度70%,55 ℃條件下提取時間1.5 h,抽濾后旋蒸除去乙醇,用磷脂純度來確定最優料液比。

1.2.1.3 提取溫度對草魚頭磷脂提取率及純度的影響 取粉碎后的草魚頭粉25 g左右,設置提取溫度為25、35、45、55、65、75 ℃,固定條件為:乙醇濃度70%,料液比1∶8 g/mL,提取時間1.5 h,抽濾后旋蒸除去乙醇,用磷脂純度來確定最優提取溫度。

1.2.1.4 提取時間對草魚頭磷脂提取率及純度的影響 取粉碎后的草魚頭粉25 g左右,設置提取時間為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 h,固定條件為:乙醇濃度70%,料液比1∶8 g/mL,提取溫度55 ℃,抽濾后旋蒸除去乙醇,用磷脂純度來確定最優提取時間。

1.2.2 正交試驗設計 分別考察乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間四個單因素對草魚頭磷脂得率及純度的影響。根據單因素實驗結果,每個因素選取3個較佳水平,按照L9(34)進行正交試驗,以磷脂純度為考核指標來優化草魚頭磷脂制備工藝,見表1[14]。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 磷脂純度檢測 磷脂產物中所含純磷脂的質量檢測參考SN/T 3851-2014[15]。

1.2.4 草魚頭磷脂的純化 準確稱取0.2 g最優工藝條件下乙醇提取的草魚頭磷脂進行硅膠柱分離,先后用220 mL氯仿、120 mL丙酮、220 mL甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液后旋蒸去除甲醇,即為純化后磷脂。純化后的磷脂-20 ℃條件下保存,用于磷脂脂肪酸組成分析。

1.2.5 草魚頭磷脂薄層色譜分析 將上述所純化的磷脂加入氯仿溶解,配制成100 mg/mL的溶液進行薄層色譜分離,展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4 (V/V/V),采用Ditmmer-Leser試劑作為顯色劑,顯色后掃描薄層結果,采用比移值Rf=溶質移動的距離/溶液移動的距離,并使用Scion Image軟件處理圖像后分析不同磷脂種類的含量。

1.2.6 草魚頭磷脂的脂肪酸組成分析

1.2.6.1 脂肪酸甲酯化 稱取草魚頭磷脂50 mg于10 mL容量瓶中,加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH/甲醇溶液,在65 ℃皂化30 min,后加入2 mL的BF3-甲醇(1∶3,V/V)溶液,加熱反應3 min后,冷卻至室溫,加入2 mL正己烷進行萃取,搖勻后靜置分層,取上層有機相,離心備用。

1.2.6.2 GC條件 色譜柱:HP-FFAP石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至190 ℃,再以3 ℃/min升至220 ℃,保持10 min;載氣(He)流速1.0 mL/min,壓力88 kPa,進樣量1 μL;分流比10∶1。

1.2.6.3 MS條件 電子轟擊離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;掃描周期3.21次/s;質量掃描范圍m/z 10～460。

1.2.6.4 GC-MS數據分析 用氣相色譜-質譜進行全離子掃描分析。用化學工作站數據處理系統和標準質譜圖庫NIST11進行解析,確認草魚頭磷脂中各種脂肪酸的化學結構。根據化合物色譜峰響應,利用面積歸一化法計算各脂肪酸組分的相對百分含量。

1.2.7 外抗氧化能力測定

1.2.7.1 羥自由基(·OH)清除能力測定 參照文獻[16],將脂質樣品配成5、10、15、20、25 mg/mL的五種樣品溶液,進行羥自由基(·OH)清除能力測定。與樣品同濃度的大豆卵磷脂重復上述步驟,并與草魚頭磷脂比較。

1.2.7.2 還原力的測定 參照文獻[17],樣品用蒸餾水超聲溶解,配制成10、20、30、40、50 mg/mL的五種樣品溶液,進行還原力測定。與樣品同濃度的大豆卵磷脂重復上述步驟,并與草魚頭磷脂比較。

1.3 數據處理

試驗數據經整理后,采用SPSS Statistics 19對數據進行顯著性方差分析,多重比較采用最小顯著法,差異顯著水平為α=0.05,試驗數據使用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對磷脂得率及純度的影響

為了保證提取得到的草魚頭磷脂的品質,在工藝優化時以磷脂的純度作為主要檢測指標,同時測定得率作為參考。從圖1可以看到,提取的草魚頭磷脂純度隨著乙醇濃度的升高先增大后減小,而磷脂得率呈現與之相反的先下降后升高的趨勢,當乙醇濃度為70%時,磷脂純度最高,達64.34%,確定為最佳乙醇濃度,此時得率為4.74%。當乙醇濃度在50%時,提取液水含量較高,I/O值(無機性值/有機性值)偏無機性方向,水溶性雜質提取較多,故其中磷脂純度較低;隨著乙醇濃度升高,提取液的無機性逐漸減弱,有機性升高,逐漸接近磷脂的I/O值,提取得到的磷脂純度升高,水溶性成分明顯減少,磷脂得率降低;當乙醇濃度進一步升高時,提取液極性開始下降,I/O值偏向有機性質,作為極性脂的磷脂的溶解度降低[18],而同時提取到的非極性脂質的增加,導致磷脂得率上升但純度下降。陳文娟等[19]發現使用乙醇溶液提取大黃魚魚卵時提取物中磷脂含量(純度)隨著乙醇含量的增大逐漸增大,當乙醇含量為95%時,磷脂純度為24%,提取率最大,直到使用乙醇濃度100%,磷脂純度提取率開始下降,與本研究結果類似,只是最優的乙醇濃度偏高,這可能與原料不同有關,包括其中的磷脂含量、磷脂結合狀態等因素都會對提取工藝產生影響,故確定最佳乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對磷脂得率及純度的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrationon yield and purity of phospholipids

2.2 料液比范圍的確定

圖2結果表明,隨著料液比中提取液的比例增加,提取的草魚頭磷脂純度先升高后下降,在料液比1∶8和1∶10 g/mL時達到最高,兩者都在65%附近,差別不明顯;而磷脂得率呈現先明顯降低再上升的變化,料液比在1∶8和1∶10 g/mL時,提取率偏低,都在3.4%附近,區別不顯著。在指標相同的情況下,更低的料液比可以降低成本,故確定1∶8 g/mL為最佳料液比。

圖2 料液比對磷脂得率及純度的影響Fig.2 Effect of material to liquid ratioon yield and purity of phospholipids

料液比1∶4 g/mL時提取液的量偏少,草魚頭粉末吸收了乙醇溶液的水分會導致乙醇濃度增加,從而導致提取的磷脂純度不高但提取率偏高(參見2.1中乙醇濃度高的情況),隨著提取液的比例增加,草魚頭粉末對乙醇溶液的影響逐漸減小,磷脂提取的純度增加,得率保持穩定,磷脂在乙醇溶液中濃度適宜,達到提取的動態平衡,但當提取液比例進一步增大時,平衡被打破,過多的乙醇溶液會在提取磷脂后繼續溶解中性脂,從而導致純度下降而得率上升。

2.3 提取溫度對磷脂得率及純度的影響

從圖3可以看到,草魚頭磷脂純度隨著提取溫度的升高先上升后下降,當提取溫度為55 ℃時,磷脂純度最高,達76.75%。而磷脂得率隨著提取溫度的升高,在2.5%～3.5%附近呈現波動變化,當提取溫度為55 ℃時,磷脂產物得率2.65%,確定55 ℃為最佳提取溫度。提取溫度的升高可加快溶質的傳質速率,對于極性磷脂的選擇性更強,因此可以獲得較高純度的磷脂;但隨著溫度逐漸升高,乙醇揮發加快,導致提取液中乙醇濃度降低,因而磷脂純度又開始下降(參見2.1)。過高的溫度還會使磷脂氧化降解,影響磷脂的品質[20]。因此提取溫度不宜過高。得率的波動變化,推測與提取的磷脂中混有的中性脂比例有關。

圖3 提取溫度對磷脂得率及純度的影響Fig.3 Effect of temperature on yieldand purity of phospholipids

2.4 提取時間對磷脂得率及純度的影響

分析圖4中的結果可以看到,草魚頭磷脂純度在提取時間從1.5 h增加到3 h時略有上升,達到最高值,之后再延長提取時間,純度連續下降。磷脂提取率隨著提取時間的增加,在1.88%～3.15%之間呈現波動,在提取時間為4.5 h時,得率達到最高,但3 h時得率已經達到3%,與之相差不大。確定3 h為最佳提取時間。草魚頭粉末所含的磷脂的被乙醇溶液充分提取出來需要一定時間,適當的提取時間有利于得到純度和得率都較高的磷脂,但是過長的提取時間會由于偏高的提取溫度(55 ℃)引起乙醇揮發從而降低乙醇濃度,使提取的磷脂純度下降,同時非磷脂成分的增加導致得率降低后又上升。

圖4 提取時間對磷脂得率及純度的影響Fig.4 Effect of time on yield and purity of phospholipids

2.5 草魚頭磷脂制備正交試驗結果

從表2可知,影響草魚頭磷脂制備的主次因素為A>B>C>D,即乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。從表3可知,通過進一步的方差分析表明,乙醇濃度對草魚頭磷脂的提取影響非常顯著,提取時間對草魚頭磷脂的提取影響顯著,而料液比和提取溫度對草魚頭磷脂的提取影響不顯著。

2.6 驗證試驗結果

優方案為A3B2C2D2(乙醇濃度80%,料液比1∶8 g/mL,提取溫度55 ℃,提取時間3 h)。經驗證,按照A3B2C2D2條件提取的脂質樣品中磷脂純度為79.52%±1.48%,略低于正交試驗A3B1C3D2的純度(84.20%±0.65%),最終確定A3B1C3D2為最優工藝條件,此時磷脂得率為3.03%±0.06%。綜上所述,根據正交試驗結果,確認最佳工藝條件為:乙醇濃度80%,料液比1∶6 g/mL,提取溫度65 ℃,提取時間3 h。

表2 正交試驗方案和結果Table 2 Program and results of orthogonal test

表3 草魚頭磷脂提取方差分析Table 3 Analysis of variance of extraction ofgrass carp head phospholipids

注：“*”表示影響顯著,P<0.05;“**”表示影響極顯著,P<0.01。

2.7 最優條件磷脂薄層色譜分析

表4 磷脂各組分的比移值Table 4 Transfer values and composition of phospholipids component

注：不同字母表示具有顯著性差異,P<0.05。

草魚頭磷脂薄層分析結果見圖5和表4。從結果中可看到,草魚頭磷脂主要含有磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanilamine,PE)、鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)和溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine,LPC)四種磷脂,PC在魚頭磷脂中含量最高,達60%,PE其次,達20%。

圖5 磷脂的薄層色譜圖Fig.5 Thin layer chromatography of phospholipid

PC是人體生長發育所需的重要磷脂,是人體獲得膽堿及生長代謝的物質來源[21]。PE是神經細胞膜的重要構成,能顯著改善大腦發育及功能[22]。Judde等[23]發現大豆卵磷脂的抗氧化能力與磷脂中的PC和PE的含量有關。SM對于抑制癌癥具有潛在的作用效果,其代謝產物神經酰胺和鞘氨醇維持體內細胞的正常生長[24]。

2.8 最優條件磷脂的脂肪酸組成

草魚頭磷脂脂肪酸組成見表5。草魚頭磷脂中的脂肪酸組成以PUFA為主,含量達到52.09%±0.59%。草魚頭磷脂中EPA含量占10.34%±0.03%,DHA含量占17.83%±0.48%。作為n-3系列PUFA,DHA和EPA具有獨特的生理活性。DHA是人體必需的多不飽和脂肪酸,對人體視網膜的發育起著關鍵作用。EPA對視網膜和大腦的結構膜起重要作用,并可預防心腦血管疾病的發生[25]。

表5 草魚頭磷脂脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition ofphospholipids from grass carp head

結合有DHA和EPA的磷脂在擁有磷脂和PUFA各自的生理功能外,更容易被人體接受并消化吸收效果更佳,而當它們作為單獨脂肪酸或者甘油酯等形式時,其結構更加穩定,不易被人體吸收[26]。

2.9 體外抗氧化能力測定

2.9.1 ·OH清除能力測定 ·OH是人體內最活潑的自由基之一,能夠氧化細胞膜上的不飽和脂肪酸,其氧化產物能夠與蛋白質等生物大分子反應,引起細胞膜損傷[27]。由圖6可知,草魚頭磷脂和大豆卵磷脂對·OH都有清除能力,且·OH清除率隨著濃度的增加而增長。在檢測的磷脂濃度范圍內,草魚頭磷脂·OH清除率全都顯著高于大豆卵磷脂(P<0.05),兩者的·OH清除率在濃度為25 mg/mL時達最大值,分別為94.4%、84.2%。Saito等[28]發現,PC和PE的極性頭部側鏈具有清除氫過氧化物的活性氨基。Cortie等[29]研究發現,磷脂中SFA和MUFA的含量越高,其磷脂的氧化穩定性越好。草魚頭磷脂中PC和PE含量比大豆磷脂含量高,草魚頭磷脂比大豆磷脂結合了更多的SFA和MUFA,因此,草魚頭磷脂比大豆磷脂清除自由基的活性更好[30]。

圖6 磷脂對·OH清除能力Fig.6 ·OH scavenging ability of phospholipids

2.9.2 還原力的測定 還原力是衡量物質抗氧化能力的指標之一[31]。由圖7可知,吸光度隨著磷脂濃度的增加而增大,即還原力隨磷脂濃度增加而增強。在10～50 mg/mL范圍內,草魚頭磷脂的還原力顯著高于大豆卵磷脂(P<0.05),大豆磷脂和草魚頭磷脂都具有PC和PE,二者在還原力之間的差異可能是草魚頭磷脂中PC和PE含量比大豆磷脂含量高所導致,還可能與草魚頭SFA的含量高有關[28-29]。

圖7 磷脂的還原能力Fig.7 Reducing capacity of phospholipids

3 結論

通過單因素正交試驗確定乙醇提取冷凍干燥草魚頭粉磷脂的最優工藝方案為:乙醇濃度80%,料液比1∶6,提取溫度65 ℃,提取時間3 h,在此條件下,磷脂純度84.20%±0.65%,磷脂得率為3.03%±0.06%。草魚頭磷脂以PC為主,脂肪酸組成以PUFA為主,特別是含有一定量的DHA和EPA。體外抗氧化能力測定中,草魚頭磷脂的·OH清除能力和還原力都優于大豆磷脂。通過本文中醇提法制備的草魚頭磷脂營養價值較高,具有一定開發前景,或可將其應用在磷脂補充劑、抗衰老保健品等方面。