嗜熱鏈球菌發酵改良納豆工藝優化

(河南農業大學食品科學技術學院,鄭州市大豆深加工重點試驗室,河南鄭州 450000)

新鮮納豆因其獨特的氨臭味不能被大多數中國人所接受[15],所以改良其風味、提高接受度具有重要意義。目前改良納豆的常見方法有三種,優化發酵菌種、添加發酵底物和改變發酵菌種。Takemura等通過敲除特定基因來培育低臭的納豆菌種[16]。Koguchi等通過實驗證明改變底物成分可達到減少不良氣味的效果[17]。吳雪嬌等[18]通過添加白糖發酵,添加酸奶后熟改良納豆風味。付文靜[19]通過添加花生粕共同發酵來改良納豆,改善了傳統納豆的口感,提升了納豆的品質。王麗娜等[20]通過添加花生發酵和調味料調制成蒜蓉口味的納豆來提高產品的可接受度。陳思[21]用納豆芽孢桿菌T與沼澤紅假單胞菌混合發酵對納豆風味進行改良,改良后納豆激酶酶活提高且氨含量減少,氨臭味有明顯改良。高沛汝[22]利用納豆芽孢桿菌和酵母菌共同發酵,氨臭味明顯降低。本實驗擬采取分步發酵的方式改良納豆,使納豆芽孢桿菌在前期發酵時充分利用營養物質生成納豆激酶,在保留其特征性營養物質的前提下改良其風味。

嗜熱鏈球菌是一種常見發酵劑,在人體內可耐胃酸、膽鹽,抑制致病菌并產生維生素等生物活性物質。嗜熱鏈球菌常應用于乳制品發酵,大豆肽風味改良等方面,不僅可以產生特殊風味物質,且因其自身缺乏蛋白酶或酶活較弱,可與納豆菌競爭含氮蛋白質水解產物[23],減少納豆菌產出不良氣味物質含量。本實驗擬通過納豆芽孢桿菌與乳酸菌嗜熱鏈球菌分步發酵來改良納豆的風味,設置不同的嗜熱鏈球菌發酵的發酵溫度、發酵時間、接種量,通過分析其感官評分、納豆激酶酶活,探索最佳發酵改良納豆的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃豆(墾豐16號) 鄭州種子市場;納豆芽孢桿菌(BNCC 185324)、嗜熱鏈球菌(BNCC 335885) 北納創聯生物技術有限公司;MRS培養基、MRS肉湯、牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司;瓊脂、0.01 mol/L PBS緩沖溶液、纖維蛋白原、凝血酶(1000 U)、尿激酶(1240 IU) Solarbio公司;鹽酸(優級純) 煙臺市雙雙化工有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

Neofuge 1600R臺式高速離心機 上海力申科學儀器有限公司;UV2000紫外可見分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;SX-500全自動蒸汽滅菌鍋 北京五洲東方科技發展有限公司;SW-CJ超凈工作臺 上海樹立儀器儀表有限公司;BagMixer400拍擊式均質器 法國Interscience公司;K1301半自動定氮儀 上海晟聲自動化分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌發酵大豆 將黃豆清洗后在30 ℃下浸泡3 h至黃豆顆粒充分吸水膨脹,常壓蒸煮30 min進行滅菌熟制。冷卻至30 ℃進行納豆芽孢桿菌接種,接種量為2%(菌液濃度為106CFU/g濕基),在37 ℃下發酵24 h。

1.2.2 嗜熱鏈球菌發酵單因素實驗 將納豆芽孢桿菌發酵后的大豆進行嗜熱鏈球菌二次發酵。以嗜熱鏈球菌發酵溫度、發酵時間、接種量為3個因素,以納豆激酶酶活和感官評分為評價指標進行單因素實驗。研究發酵時間30 h,接種量1.5%時,發酵溫度分別為33、36、39、42、45 ℃時對評價指標的影響;研究發酵溫度42 ℃,接種量1.5%時,發酵時間分別為0、10、20、30、40、50 h時對評價指標的影響;研究發酵溫度42 ℃,發酵時間20 h時,接種量分別為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時對評價指標的影響。實驗在無菌操作臺中操作,所有樣品接觸器材均滅菌處理。

1.2.3 嗜熱鏈球菌發酵響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken設計原理,以發酵溫度(A)、發酵時間(B)、接種量(C)為優化條件,以感官評分、納豆激酶酶活為響應值,設計3因素3水平響應面優化實驗,確定最優嗜熱鏈球菌發酵條件。因素水平見表1。

表1 Box-Behnken響應曲面實驗設計因素和水平表Table 1 Factors and level tables ofBox-Behnken response surface test design

1.2.4 建立感官評分模糊數學模型 根據樣品色澤、氣味、滋味進行感官評分,感官評分標準如表2所示。參考文獻[24-25],建立模糊數學模型。將感官評分得分建立模糊矩陣Rij。

式中:i=1，2，3，…(樣品編號);j=1，2，3分別代表樣品色澤、氣味、滋味的得分。

設質量因素權重為X,采用強制決定法確定各質量因素的權重,確定權重集為X。

X=[0.3 0.4 0.3]T

即產品質量特性中色澤占30%,氣味占40%,滋味占30%。樣品模糊數學感官評分集Y=R×X。第i組樣品的評價結果為Yi=Ri×X。

1.2.5 納豆激酶酶活測定和感官評價 納豆激酶酶活的測定:參考付文靜[19]改良的分光光度計法;感官評價:選取河南農業大學食品學院10名研究生根據樣品色澤、氣味、滋味進行感官評分,感官評分標準如表2所示。結果由1.2.4中所建模型進行計算,得到綜合評分。

1.2.6 改良前后納豆營養成分變化 通過測定納豆水分含量(采用李君[26]的干燥箱測定法)、粗脂肪(采用GB 5009.6-2016第一法測定)、粗蛋白(采用GB 5009.5-2016第一法測定)、氨基酸態氮含量(采用甲醛滴定法)、納豆激酶酶活(參考付文靜[19]改良的分光光度計法)和異黃酮含量(采用紫外分光光度計法[27])來評價改良前后納豆的營養變化。

1.3 數據統計分析

所有測定重復3次取平均值;實驗數據采用SPSS 20.0、Origin 8.0和Design Expert 10.0軟件處理分析。

表2 納豆感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of natto

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對納豆激酶酶活和納豆感官評分的影響

由圖1可知,納豆激酶酶活隨著溫度的增加呈先增加后降低的趨勢,在42 ℃時達到最大值,納豆激酶酶活為(1248±91) U/g。發酵溫度為45 ℃時,由于溫度過高抑制菌種的生長及代謝,所以納豆激酶酶活下降;隨著溫度的增加,感官評分先增加后降低,39與42 ℃的感官評分沒有顯著差異,但在42 ℃時感官評分最高,為(8.1±0.6) 分。綜上,選42 ℃為后續研究參數。

圖1 發酵溫度對納豆激酶酶活和納豆感官評分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperatureon nattokinase enzyme activity and sensory scores注:圖中不同小寫字母表示具有顯著性差異P<0.05;相同字母表示不具有顯著性差異P>0.05;圖2、圖3同。

2.2 發酵時間對納豆感官評分和納豆激酶酶活的影響

由圖2可知,隨著發酵時間的增長,納豆激酶酶活先增加后降低。在20 h時達到最高值,納豆激酶酶活為(1790±128) U/g。在20 h之后,納豆激酶酶活整體呈降低趨勢,這是由于嗜熱鏈球菌與納豆芽孢桿菌競爭發酵底物,且納豆芽孢桿菌發酵時間過長,進入衰亡期;隨著發酵時間的增長,感官評分先增加后降低。在10～30 h范圍內,感官評分無顯著性差異,但在20 h時達到最高分,感官評分為(7.6±0.2) 分。綜上,選20 h為后續研究參數。

圖2 發酵時間對納豆激酶酶活和感官評分的影響Fig.2 Effect of fermentation timeon nattokinase enzyme activity and sensory scores

2.3 接種量對納豆感官評分和納豆激酶酶活的影響

圖3 接種量對納豆激酶酶活的影響Fig.3 Effect of inoculation on nattokinaseenzyme activity and sensory scores

由圖3可知,隨著接種量的增加,納豆激酶酶活先增加后降低。在1.5%時達到最大值,納豆激酶酶活為(1914±69) U/g。而接種量大于1.5%時,納豆激酶酶活會下降,且接種量為2.5%時的納豆激酶酶活低于改良前的,這是因為嗜熱鏈球菌接種量過高,產酸增加,pH降低,影響納豆芽孢桿菌的發酵,并且降低納豆激酶的活力,造成納豆激酶酶活下降;隨著接種量的增加,感官評分整體呈增加趨勢,在1.5%時感官評分最高,為(7.8±0.4) 分。綜上,選擇1.5%為后續研究參數。

表4 方差分析結果Table 4 Analysis of variance

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01);表5同。

2.4 響應面優化實驗結果與分析

2.4.1 實驗設計及結果 響應面實驗設計及結果見表3。

表3 Box-Behnken實驗設計與結果Table 3 Response variable Box-Behnken design

2.4.2 以感官評分為響應指標的響應面結果分析 利用Design-Expert 10.0對感官評分(Y)與各因素進行多元回歸分析,同時擬合得二次回歸方程:

Y=-162.83+7.61A+1.45B-0.90C-0.02AB-0.01BC-0.09A2-0.01B2+0.30C2

以感官評分為響應值的響應面二次回歸模型方差分析結果見表4。

3D響應面圖可直觀反映出因素之間的交互作用。由圖4可知,等高線呈橢圓形且曲線密集,表明發酵溫度與發酵時間的交互作用對感官評分的影響顯著。

2.4.3 以納豆激酶酶活為響應指標的響應面結果分析 利用Design-Expert 10.0納豆激酶酶活(Z)與各因素進行多元回歸分析,同時擬合得二次回歸方程:

Z=-93437.53+4185.99A+500.58B+3439.15C-4.21AB-2.67AC-18.95BC-48.72A2-7.9B2-967.8C2

以納豆激酶酶活為響應值的響應面二次回歸模型方差分析結果見表5。

表5 方差分析結果Table 5 Analysis of variance

圖4 發酵參數交互作用對感官評分的影響Fig.4 Effect of interaction of fermentationparameters on sensory scores

圖5 發酵參數交互作用對納豆激酶酶活的影響Fig.5 Effect of interaction of fermentationparameters on nattokinase activity

由圖5可知,接種量、發酵溫度與發酵時間的交互作用均不顯著。

2.4.4 響應面優化結果及驗證實驗 通過響應面優化實驗分析,嗜熱鏈球菌發酵最佳參數為:發酵溫度42 ℃,發酵時間18.6 h,接種量1.5%。預測結果感官評分8.1分,納豆激酶酶活2014 U/g。在此條件下進行3次驗證實驗。實驗結果表明,改良后的納豆呈鮮黃色,飽滿有光澤,有豆香味及些許氨臭味,無明顯后苦味。感官評分(8.0±0.037) 分,納豆激酶酶活(1964±83) U/g,均與預測值無顯著性差異(P>0.05),從而也證明了響應面法優化發酵工藝的有效性。

2.5 改良前后營養成分變化結果

由表6知,與普通納豆相比,改良后納豆水分含量沒有明顯變化;粗脂肪、粗蛋白和氨基酸態氮含量降低,這由于嗜熱鏈球菌的代謝作用使得脂肪、蛋白質和氨基酸被進一步分解。

表6 納豆改良前后營養成分變化結果Table 6 Changes in nutrient compositionbefore and after natto improvement

注：同列均值無不同上標字母者表示不存在差異顯著(P>0.05);同列均值有不同上標字母者表示差異顯著(P<0.05)。

改良后納豆激酶酶活增加,異黃酮含量明顯升高,這可能是由于嗜熱鏈球菌二次發酵過程中,分解了更多可利用作用底物供納豆菌生物反應。改良后的納豆不僅風味上更易被人們所接受,且主要活性物質納豆激酶酶活也提升了87.0%。

3 結論

實驗證明,嗜熱鏈球菌發酵改良納豆的最佳工藝條件為發酵溫度42 ℃,發酵時間18.6 h,接種量1.5%,此條件下納豆感官評分為8.0,納豆激酶酶活為1964 U/g。改良后納豆粗脂肪、粗蛋白、氨基酸態氮含量下降,生物活性物質納豆激酶酶活增加87.0%,異黃酮含量增加92.0%為(1.40±0.016) mg/g。改良后納豆感官上更易為人們所接受,生物活性物質也有所提高,改良效果較好。