高壓脈沖電場輔助水酶法提取杜仲葉中不可萃取多酚

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(1.湖南農業大學食品科學技術學院,湖南長沙 410128;2.慈利縣九九農業開發有限公司,湖南張家界 427200)

杜仲屬于單科、單屬、單種的落葉喬木,是我國特有的經濟植物,傳統以杜仲皮入藥,為我國名貴中藥材,在我國許多經典藥學著作中均有記載,而杜仲樹剝皮后容易死亡,制約了杜仲的藥用價值。研究發現,杜仲葉屬于可再生資源,并且與杜仲皮化學成分相似[1],葉中多酚類物質的含量高于皮[2],具有補肝益腎、強筋健骨、抗氧化[3]、降血壓[4-5]、降血脂等功效[6]。

高壓脈沖電場提取是將液態樣品或液體浸泡的固態樣品作為電解質置于容器內,通過放電產生高壓電流,破壞植物細胞,改變其通透性,使細胞內的物質能夠有效流出的一種食品加工方法[7-8]。高壓脈沖電場在食品加工領域應用廣泛,主要包括物料干燥[9]、食品殺菌[10]、輔助提取活性成分[11]等。Boussetta等[12]用高壓脈沖電場輔助提取葡萄渣中的多酚,結果表明,高壓脈沖電場輔助提取的多酚提取率比對照組高30%。Kantar等[13]等發現利用高壓脈沖電場輔助柑橘、柚子和檸檬榨汁會使果汁中多酚含量增加了大約39%、66%和135%。也有研究表明,高壓脈沖電場與水酶提取結合,多酚含量從0.5 mg/g提高到4.3 mg/g[14]。脈沖電場雖然可以提高多酚含量,但是對于提高多酚含量的影響因素方面研究不足。

多酚是杜仲葉主要活性成分[15]之一,具有抗氧化、抗衰老、殺菌、抗腫瘤癌變、抗心血管疾病等作用[16-20]。植物總多酚分為可萃取多酚與不可萃取多酚兩部分。可萃取多酚通過簡單的有機相萃取即可獲得,而不可萃取多酚需要通過化學或酶法破壞細胞壁才能分離[21]。有研究表明,不可萃取多酚的含量高于可萃取多酚[22],在食品營養方面具有廣闊的應用前景。但目前國內對于不可萃取多酚提取工藝的研究較少。

因此本實驗利用高壓脈沖電場輔助水酶法提取杜仲葉中不可萃取多酚,響應面優化提取工藝,為未來杜仲葉開發利用提供理論依據及研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

華仲8號杜仲葉 采自湖南省慈利縣九九農業開發有限公司,將杜仲葉清洗后于-80 ℃冰箱下預冷,然后進行冷凍干燥,將干燥好的杜仲葉用中藥粉碎機粉碎,過60目篩,密封放-20 ℃冰箱保存待用;沒食子酸(純度≥99%) 成都瑞芬思生物科技有限公司;纖維素酶(400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;水 為超純水;丙酮、乙酸乙酯、甲醇 分析純,國藥集團;其他試劑 均為分析純。

高壓脈沖電場 實驗室自制;GO-酶標儀 Thermo Fisher Scientific公司;DTY-A220型電子天平 美國康州HZ電子科技有限公司;TF-FD-1L型冷凍干燥機 上海拓紛機械設備有限公司;KM-300DE型中文液晶超聲波清洗器 昆山美美超聲儀器有限公司;LH-08B型中藥粉碎機 浙江省溫嶺市創力藥材器械廠;RE-2000B型旋轉蒸發儀 鞏義市中天科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉不可萃取多酚的提取 取保存于-20 ℃的杜仲葉粉末,加入85%丙酮(料液比=1∶10 g/mL)攪拌均勻,渦旋30 s,30 ℃下240 W超聲30 min,取出后抽濾分離上清液和殘渣,殘渣分別用甲醇、水各洗3次,凍干后作為提取不可萃取多酚原料。取1 g凍干粉末加入8 mL的蒸餾水及一定量的纖維素酶,使用高壓脈沖電場進行提取,抽濾得上清液,即為杜仲葉不可萃取多酚提取液。

1.2.2 不可萃取多酚含量的測定 參考Sun等[23]的方法并稍作修改。稱取5 mg沒食子酸于50 mL容量瓶中,再分別取0、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中,蒸餾水定容,得0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL沒食子酸標準品。取50 μL不同濃度的沒食子酸標準品于96孔板中,加入50 μL福林酚試劑,中速振蕩1 min,避光反應10 min后加入125 μL 7.5%的碳酸鈉,中速振蕩1 min,避光反應1.5 h后,置于酶標儀板槽內,在765 nm處測量吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度 為縱坐標,繪制標準曲線。曲線方程為:Y=16.439X+0.028,R2=0.9991。杜仲葉中不可萃取多酚含量的計算公式為:

不可萃取多酚含量(mg/g)=(C×V)/D

式中:C為標準方程計算出的濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;D為杜仲葉殘渣質量,g。

1.2.3 單因素實驗設計 取0.1 g左右的杜仲葉殘渣,以水為提取溶劑,固定單因素水平為:酶用量為12 mg、場強為2.81 kV/cm、脈沖數為100次,考察不同的酶用量(10、12、14、16、18 mg)、場強(2.21、2.51、2.81、3.11、3.41 kV/cm)、脈數(20、40、60、80、100次)對杜仲葉不可萃取多酚提取效果的影響。場強設置在2.21～3.41 kV/cm之間是因為在此區間內不可萃取多酚提取率變化較為明顯,繼續增大場強會導致電壓不穩,實驗結果不準確。

1.2.4 響應面試驗設計 根據Box-Behnken試驗設計原理[24],在單因素實驗的基礎上,以酶用量(A)、場強(B)、脈沖數(C)為考察因素,杜仲葉不可萃取多酚含量為響應值,采用三因素三水平的響應面試驗設計,響應面試驗的因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數據處理

每組實驗3次平行。通過OriginPro 8.5整理數據,繪制圖片,并采用Design-Expert 10統計軟件進行響應面優化分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶用量對不可萃取多酚提取效果的影響 由圖1可知,不可萃取多酚的含量隨著酶用量的增加呈現出先上升、后下降的趨勢,當酶用量為16 mg時達到最大值,為31.38 mg/g。這是因為纖維素酶的增加會破壞杜仲葉細胞壁,增強膜的滲透性,利于多酚類物質溶出,但是過多的纖維素酶就會產生粘附性,阻塞多酚物質溶出通道,同時酶量飽和時,酶解反應較為完全,繼續增大酶量會產生抑制作用[25-26]。

圖1 酶用量對不可萃取多酚含量的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.2 場強對不可萃取多酚提取效果的影響 場強與細胞膜的通透性密切相關,當場強增大時,使細胞膜兩側形成電位差,從而導致磷脂雙分子層發生位移,使細胞結構紊亂,提高細胞通透性,有利于溶劑進入細胞,同時胞內物質釋放能力增強[27]。從圖2中可以看出,隨著場強的增大,不可萃取多酚的含量逐漸上升,當場強為3.41 kV/cm時,含量為29.51 mg/g,由于實驗儀器限制,繼續增大場強會導致電壓不穩,所以場強最大為3.41 kV/cm。

圖2 場強對不可萃取多酚含量的影響Fig.2 Effect of field strength on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.3 脈沖數對不可萃取多酚提取效果的影響 由圖3可知,不可萃取多酚含量隨著脈沖數的增加呈現先增大后降低的趨勢。當脈沖數為80次時,含量最高為18.49 mg/g,小于80次時,脈沖數過小,對細胞的破壞的程度較低,不利于多酚物質的溶出;增大脈沖數,電場的作用頻率增強,同時增強細胞的破壞程度及破壞細胞數量,但脈沖數過大,時間過長,會產生不穩定因素,破壞多酚物質結構,從而降低了不可萃取多酚的含量[28]。

圖3 脈沖數對不可萃取多酚含量的影響Fig.3 Effect of pulse number on thecontent of non-extractable polyphenols

2.2 響應面優化不可萃取多酚的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果 為優化高壓脈沖電場結合水酶提取杜仲葉中不可萃取多酚的工藝條件,采用三因素三水平Box-Behnken試驗設計,在單因素實驗基礎上,精密稱取0.1 g左右的杜仲葉殘渣于比色管中,按照表1的因素水平對杜仲葉不可萃取多酚的提取工藝進行優化。具體方案及結果見表2。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Scheme and experimental resultsof response surface design

2.2.2 模型評價 利用Design-Expert軟件對表2試驗數據進行二次多項式回歸擬合,得到的數學模型為:

Y=22.2+3.44A-1.9B+2.27C-1.05AB+1.36AC+0.7BC+2.06A2+1.13B2+0.27C2

模型方差分析結果和各項系數顯著性檢驗結果列于表3。

2.2.3 響應面分析 由圖4可知,當酶用量和脈沖數,場強和脈沖數的響應面圖曲面走勢陡峭,響應值的改變較為敏感,同時等高線呈橢圓形且曲線密集,這說明酶用量與脈沖數,場強與脈沖數的交互作用對不可萃取多酚的含量有顯著性影響。而酶用量和場強交互作用的響應面圖曲面較為平緩,響應值改變不敏感,等高線不密集,這說明不可萃取多酚的含量受兩者交互作用影響的變化程度較小。通過最優化分析,最佳的提取條件為酶用量18 mg,場強2.81 kV/cm,脈沖數100次,預測值為34.969 mg/g。

表3 回歸模型各項方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 平行試驗結果Table 4 Parallel test results

圖4 各兩因素的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of each two factors

2.2.4 試驗結果驗證 在最優條件下進行3次平行試驗,測得杜仲葉不可萃取多酚的含量為(34.961±0.052) mg/g,與預測值34.969 mg/g相比,相差0.008 mg/g,說明此方程與實際情況擬合良好,建立的模型可靠。

3 結論

為了充分發揮杜仲葉的藥用價值,本文采用高壓脈沖電場輔助水酶法提取杜仲葉殘渣中不可萃取多酚,對杜仲葉不可萃取多酚方面的研究進行補充。研究得出,高壓脈沖電場輔助水酶法提取杜仲葉中不可萃取多酚的最佳提取工藝為:酶用量18 mg,場強2.81 kV/cm,脈沖數100次,在此條件下,不可萃取多酚的含量為(34.961±0.052) mg/g。目前,關于杜仲葉不可萃取多酚提取的研究較少,不可萃取多酚具有多種生物活性價值,對杜仲葉殘渣進行提取有極大地利用了杜仲葉,避免杜仲葉資源的浪費。對于不可萃取多酚的提取,應用較多的方法為酸水解方法和堿水解法,酸堿提取法存在耗時長、酸堿污染等、資源浪費等不足,而本文采用的高壓脈沖電場是一種新型提取技術,具有能耗小、耗時短、效率高、無污染等優勢,最重要的是能極大地保留原料中含有的化學成分。本文對于杜仲葉不可萃取多酚的研究尚存在一些不足,包括化學成分及抗氧化、抗癌、抑菌等生物活性等,接下來將會研究補充。