超聲波酶法提取莽吉柿果殼原花青素的工藝優化

呂 品,宋慧慧,李朋偉

(河南中醫藥大學藥學院,河南鄭州 450046)

莽吉柿(GarciniamangostanaL.)屬藤黃科藤黃屬植物,別名山竹、倒捻子,是一種熱帶多年生的常綠喬木,原產于東南亞,現我國云南、廣東、福建等省區均有種植。莽吉柿果實近球形,為著名的熱帶水果之一,果肉白色透明、柔軟多汁,富含多糖、氨基酸、維生素及礦物元素等[1-2]。莽吉柿果殼厚實,呈紫褐色,占單果鮮重的50%～60%,該部分雖不可食用,但包含多種活性成分,如氧雜蒽酮[3]、黃酮[4]、原花青素[5]、果膠[6]等,具有很高的利用價值。目前,莽吉柿以鮮食為主,果殼通常被當作廢棄物處理,造成了一定程度的資源浪費。

原花青素(Procyanidins,PC)是植物中廣泛存在的一類多酚化合物,由不同數量的兒茶素、表兒茶素或沒食子酸縮合而成,具有抗氧化[7]、清除自由基[8]、抗腫瘤[9]、抗輻射[10]、防治心血管疾病[11]等多種功能,在食品、藥品、化妝品等領域有著廣泛用途。原花青素的傳統提取多使用溶劑提取法,該法存在提取時間長、提取效率低等缺點[12]。近年來,超聲波、超臨界CO2、微波、酶解技術等應用于原花青素的提取工藝中,大大提高了提取效率[13]。超聲波提取是利用其產生的空化效應、機械效應和熱效應等,提升熱傳遞效率,加速溶劑滲透,從而提高提取率[14]。酶解提取是利用酶制劑促進細胞壁裂解,使提取物最大限度溶出,反應條件溫和,保證提取物性質穩定[15]。二者結合用于莽吉柿中原花青素的提取研究尚未見報道。

本研究以莽吉柿果殼為材料,采用超聲波-酶法技術提取原花青素,并對提取工藝進行優化,以期提高莽吉柿果殼的經濟價值,同時為原花青素的開發提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莽吉柿 鄭州水果市場;兒茶素標準品(純度>99%) 中國食品藥品檢定研究院;纖維素酶(1萬U/g)、香草醛 上海麥克林生化科技有限公司;無水乙醇、甲醇、濃鹽酸 國產分析純。

DHG-9143BS電熱恒溫干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;LT200E精密電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;FW100萬能粉碎機、DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司;PL-FS80T超聲清洗機 東莞康士潔超聲波科技有限公司;TD-600低速臺式離心機 四川蜀科儀器有限公司;UV-4802S紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 剝取莽吉柿果殼,用蒸餾水沖洗干凈,瀝水后放入干燥箱中,烘干(50 ℃)至恒重,將果殼粉碎過篩,收集粉末(<40目),避光干燥保存。

1.2.2 乙醇提取濃度的確定 稱取0.5 g莽吉柿果殼粉末至100 mL具塞三角瓶中,分別加入20 mL的40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液,放入超聲清洗機中,設定超聲功率300 W,超聲提取20 min后,料液立即于3000 r/min離心10 min,取上清液至25 mL容量瓶中,分別加入提取時所用濃度的乙醇進行定容,測定原花青素的得率,確定最適宜的提取濃度。

1.2.3 原花青素的超聲波-酶法提取 稱取0.5 g粉末至100 mL具塞三角瓶中,加入一定量的纖維素酶,加入10 mL蒸餾水,混合均勻,放入一定溫度的恒溫水浴鍋中,酶解一定時間后,向料液中再加入10 mL無水乙醇(使乙醇終濃度達50%),放入超聲清洗機中,設定一定的超聲功率,超聲提取一定時間后,料液立即于3000 r/min離心10 min,取上清至25 mL容量瓶中,用50%乙醇定容,即得原花青素提取液。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 加酶量對原花青素提取率的影響 在酶解溫度50 ℃,酶解時間60 min,超聲功率300 W,超聲時間20 min,加酶量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%(w/w)條件下,按照1.2.3方法進行提取,測定原花青素的得率。

1.2.4.2 酶解時間對原花青素提取率的影響 在加酶量1.5%,酶解溫度50 ℃,超聲功率300 W,超聲時間20 min,酶解時間分別為30、60、90、120、150 min條件下,按照1.2.3方法進行提取,測定原花青素的得率。

1.2.4.3 酶解溫度對原花青素提取率的影響 在加酶量1.5%,酶解時間60 min,超聲功率300 W,超聲時間20 min,酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃條件下,按照1.2.3方法進行提取,測定原花青素的得率。

1.2.4.4 超聲功率對原花青素提取率的影響 在加酶量1.5%,酶解溫度50 ℃,酶解時間60 min,超聲時間20 min,超聲功率分別為100、200、300、400、500 W條件下,按照1.2.3方法進行提取,測定原花青素的得率。

1.2.4.5 超聲時間對原花青素提取率的影響 在加酶量1.5%,酶解溫度50 ℃,酶解時間60 min,超聲功率300 W,超聲時間分別為10、20、30、40、50 min條件下,按照1.2.3方法進行提取,測定原花青素的得率。

1.2.5 響應面試驗設計 根據單因素實驗結果,選擇對原花青素得率影響較大的三個因素:酶解時間、酶解溫度、超聲功率作為考察因素,設計三因素三水平的響應面試驗,對工藝參數進行優化,試驗因素與水平見表1。加酶量(2%)、超聲時間(20 min)設定為單因素試驗的最佳值。

表1 超聲波-酶法提取原花青素的響應面試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis ofultrasonic enzymatic extraction of procyanidins

1.2.6 標準曲線的制作 準確稱取兒茶素標準品配制成1 mg/mL母液,經稀釋獲得0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL濃度梯度的標準溶液,采用香草醛-鹽酸法[16]進行測定。各取0.5 mL標準溶液至具塞試管中,加入3 mL 4%香草醛-甲醇(w/v)溶液(現用現配),再加入1.5 mL濃鹽酸,混勻后放入30 ℃水浴鍋中,避光反應20 min,用分光光度計在500 nm處檢測其吸光度,繪制出兒茶素的標準曲線,回歸方程為:Y=1.4293X+0.0733,R2=0.9871。

1.2.7 原花青素提取率的測定 將原花青素提取液適當稀釋,取0.5 mL至具塞試管中(另取0.5 mL 50%乙醇為空白對照),按照1.2.6方法檢測其500 nm處吸光度。對照標準曲線得到原花青素的質量濃度(mg/mL),按如下公式計算出原花青素的得率:

式中,C為所測溶液中原花青素的質量濃度,mg/mL;X為提取液的稀釋倍數;V為提取液的總體積,mL;m為樣品粉末的質量,g。

1.3 數據處理

每組樣品做三個平行,采用SPSS 19.0軟件處理數據并制作圖表;采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計與回歸分析。

2 結果與分析

2.1 乙醇提取濃度的確定

如圖1所示,隨著乙醇提取濃度的增高,原花青素的得率先升高后降低。乙醇濃度為40%時,水相比例較大,多糖[17]、果膠[18]等親水性雜質溶出較多,料液粘稠渾濁,離心不易分層,原花青素得率較低;50%乙醇進行提取時,提取液變清澈,得率達到最高;之后乙醇濃度再增加,一些親脂性、醇溶性等成分溶出增多,與乙醇-水分子結合,形成競爭性溶解,使原花青素的溶解度減少[19],得率顯著降低(P<0.05)。因此選擇50%乙醇為最適宜的提取濃度。

圖1 乙醇濃度對原花青素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on yield of procyanidins注:不同小寫字母表示差異顯著P<0.05;圖2～圖6同。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 加酶量對原花青素得率的影響 如圖2所示,纖維素酶添加量在0.5%～2.0%之間,原花青素的得率逐漸上升,該階段加酶量越多,酶解效率越高,原花青素越易從裂解細胞中溶出;加酶量為2.0%時,得率達最高;增至2.5%時,得率顯著下降(P<0.05),這可能是由于酶濃度較高時,底物相對濃度小,酶分子過飽和,一部分酶分子不能與底物結合,降低了酶解效率[20]。因此選擇最適宜的加酶量為2.0%。

圖2 加酶量對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on yield of procyanidins

2.2.2 酶解時間對原花青素得率的影響 如圖3所示,隨著酶解時間的延長,原花青素的提取率呈現先上升后下降的趨勢。酶解30 min時,未被酶解的底物較多,反應進行不完全,原花青素溶出較少;酶解60 min時,反應完全,提取率顯著上升并達到最高(P<0.05);超過60 min后提取率開始逐漸下降,可能隨著時間的延長,溶出的原花青素與空氣中氧氣接觸的幾率增大,發生氧化和聚合反應[21]。因此選擇最適宜的酶解時間為60 min。

圖3 酶解時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on yield of procyanidins

2.2.3 酶解溫度對原花青素得率的影響 如圖4所示,酶解溫度在30～60 ℃之間,原花青素的得率逐漸上升,在反應適宜的溫度范圍內,升溫能夠增大酶解效率,促進原花青素從裂解細胞中溶出;溫度為60 ℃時,得率達到最高;超過60 ℃后,得率顯著降低(P<0.05),溫度過高使酶的活性受到抑制甚至失活,削弱了酶解反應的進行。因此選擇最適宜的酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperatureon yield of procyanidins

2.2.4 超聲功率對原花青素得率的影響 如圖5所示,超聲功率為100、200 W時,原花青素的得率無顯著差異,但在300 W時顯著上升并達到最高(P<0.05);超過300 W后得率逐漸下降,可能超聲功率過大,少量脂溶性等成分溶出,與原花青素發生反應,降低原花青素的提取量[22],同時功率越大,超聲熱效應積累的熱量越多,使原花青素遇熱分解。因此選擇最適宜的超聲功率為300 W。

圖5 超聲功率對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of ultrasound poweron yield of procyanidins

2.2.5 超聲時間對原花青素得率的影響 如圖6所示,隨著超聲時間從10 min延長至20 min,原花青素的得率顯著增高(P<0.05),之后趨于平緩甚至略有降低。超聲20 min時樣品中原花青素已基本溶出,延長處理時間無太大影響,但過度超聲處理,會使原花青素結構發生變化[23],導致得率下降。因此選擇最適宜的超聲時間為20 min。

圖7 酶解時間與酶解溫度對原花青素得率的交互作用及等高線Fig.7 Interaction effect and contour on yield of procyanidins between enzymolysis time and enzymolysis temperature

圖6 超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on yield of procyanidins

2.3 響應面分析結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果 根據表1試驗因素與水平值,以原花青素得率為響應值,建立三因素三水平的響應面試驗,優化莽吉柿果殼中原花青素的超聲波-酶法提取工藝,設計方案及結果見表2。

表2 超聲波-酶法提取原花青素的響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surfaceanalysis of ultrasonic enzymatic extraction of procyanidins

2.3.2 回歸方程擬合與方差分析 對表2試驗數據進行回歸分析,建立回歸模型,獲得莽吉柿果殼中原花青素得率Y與酶解時間、酶解溫度、超聲功率三因素變量的二次多項回歸方程:

Y=12.35+0.59A-0.44B+0.37C-0.12AB+0.11AC-0.043BC-1.27A2-1.34B2-0.89C2

由上述方程可得,試驗因素對莽吉柿果殼中原花青素得率的影響大小依次為:酶解時間>酶解溫度>超聲功率。

表3 超聲波-酶法提取原花青素回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance table of regression model of ultrasonic enzymatic extraction of procyanidins

圖8 酶解時間和超聲功率對原花青素得率的交互作用及等高線Fig.8 Interaction effect and contour on yield of procyanidins between enzymolysis time and ultrasound power

圖9 酶解溫度和超聲功率對原花青素得率的交互作用及等高線Fig.9 Interaction effect and contour on extraction percentage of procyanidins between enzymolysis temperature and ultrasound power

注：*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);N表示無顯著性(P>0.05)。2.3.3 因素間交互作用分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制因素間交互作用的響應面圖和等高線圖,通過判斷響應面的坡度和等高線的圓形程度,從而獲得最佳的工藝條件[24]。如圖7～圖9所示,莽吉柿果殼中原花青素的得率隨酶解時間、酶解溫度、超聲功率的增大而升高,達到各因素的中心值后,得率均逐漸降低。對比各圖可知,酶解時間對原花青素得率的影響最大,表現為圖7、圖8響應面的坡度較陡,因此達到良好的提取效果,必須嚴格控制酶解時間;而超聲功率響應面的坡度相對較為平緩,說明該因素對得率的影響較小。此外,酶解時間、酶解溫度、超聲功率兩兩交互作用對原花青素得率沒有顯著影響,表現為各圖等高線的圓形程度明顯[25],這與回歸方程的方差分析結果一致。

2.3.4 最佳工藝條件的驗證 由軟件分析最佳提取工藝條件為:酶解時間67.47 min、酶解溫度58.22 ℃、超聲功率323 W,原花青素提取率的預測值可達12.50%。根據實際操作條件的需要,將最佳工藝參數改進為:加酶量2%、酶解時間68 min、酶解溫度58.5 ℃、超聲功率320 W、超聲時間20 min,以此條件進行三次驗證試驗,獲得原花青素得率的平均值為12.29%,與預測值的相對誤差為1.68%,表明所建模型能夠較好地反映真實試驗值,優化的工藝條件可靠,可行性強。在最佳工藝條件下,分別采用超聲波(樣品加入50%乙醇,超聲功率320 W,提取20 min,離心取上清定容)、酶法(樣品加入2%纖維素酶,溫度58.5 ℃,酶解68 min,添加無水乙醇至終濃度50%,離心取上清定容)單獨對莽吉柿果殼中原花青素進行提取,得率分別為8.93%和9.46%,由此可見,超聲波-酶法的提取效果要優于單獨使用超聲波和酶法提取。

3 結論

本研究首次將超聲波與酶解技術結合應用于莽吉柿果殼原花青素的提取中,通過單因素和響應面試驗對工藝參數進行優化,確定最佳工藝條件為:纖維素酶用量2%、酶解時間68 min、酶解溫度58.5 ℃、超聲功率320 W、超聲時間20 min。在此條件下原花青素的得率為12.29%,高于單獨使用超聲波和酶法提取。本研究可為莽吉柿果殼原花青素的工業化提取提供參考,具有較好的應用前景。